全 文 ：竹红菌甲素与细胞色素 C相互作用的
同步荧光光谱研究
顾晓天 1 ,吴晓红 1 ,周家宏1 ,魏少华2 ,刘颖 2 ,冯玉英 1
(1.南京师范大学分析测试中心 , 210097, 江苏 ,南京)
(2.南京师范大学化学与环境科学学院 , 210097, 江苏 ,南京)
[摘要 ] 　利用同步荧光光谱方法研究了在生理 pH值条件下竹红菌甲素 (HA)对细胞色素 C分子构象的影
响 ,同时探讨其作用机理.同步荧光光谱实验结果说明 HA与细胞色素 C之间的相互作用主要发生在 HA和细
胞色素 C分子表面的氨基酸残基之间 ,最终这种作用使细胞色素 C的构象发生变化.
[关键词 ] 　竹红菌甲素 ,细胞色素 C,同步荧光光谱
[中图分类号 ] O657, 　[文献标识码 ] A, 　[文章编号 ] 1001-4616(2005)04-0070-03
Study on the Interaction Between Hypocrellin A
and Cytochrom e C Using Synchronous F luorescence Spectra
Gu X iaotian
1 , WuX iaohong1 , Zhou J iahong1 , WeiShaohua2 , L iu Y ing2 , Feng Yuy ing1
(1. Ana lysis and Testing C en ter, Nan jing Norm al Univers ity, 210097, N an jing, C hina)
(2. S chool of Chem istry and Environm en tal S cience, Nan jing N orm al Un iversi ty, 210097, Nanjing, Ch ina)
Abstract:The e ffect o f hypocre llin A (HA) on the confo rm ational change s of cy to chrom e C has been
studied w ith synchronous fluorescence spectra. The results ind ica te tha tHA can change the confo rm ation
o f cy tochrom e C. The m echan ism has been discussed. I t is shown tha t the interaction between HA and
Cy tochrome C is m ainly be tw een HA and the am ino acid residues on the Cy to chrom e C surface.
K ey words:hypocrellin A, cy tochrome C, synchronous fluo re scence spectra
　收稿日期:2005-05-28.
基金项目:江苏省教育厅自然科学基金资助项目(2004191TSJB141和 2004K JD150110),南京师范大学优秀高层次人才启动基金资助项
目(2004191XGQ2B43).
作者简介:顾晓天 ,女, 1967— ,讲师 ,主要从事光谱分析和功能材料等领域研究 , E-m ail:guxiaotian@ njnu. edu. cn
通讯联系人:冯玉英 ,女 , 1953— ,教授 ,主要从事光谱分析和功能材料等领域的研究. E-m ail:yyfeng@ n jnu. edu. cn
0　引言
竹红菌甲素 (HA)是一种天然的光敏剂 ,该化合物具有优良的
光动力性质 ,被公认为是一种极有应用前景的光疗药物 [ 1— 3] .由于该
光敏剂主要是通过光敏损伤肿瘤细胞的细胞膜来杀死肿瘤细
胞 [ 4— 6] ,而细胞膜中主要成分是各种蛋白质 ,因此 HA与蛋白质之间
相互作用方面的研究开始受到关注 [ 7, 8] .
同步荧光光谱指同时扫描激发和发射光的波长 ,并使二者保持
一个固定的波长差的条件下检测相应的荧光发射信号所得的光谱.
由于同步荧光光谱具有对环境和分子构象的敏感性和信息丰富的特
点 ,已经成为研究蛋白质微环境和构象变化的有力工具[ 9] . 目前 ,同
步荧光技术已经被广泛地应用到研究药物分子与蛋白质作用的领域
中 ,主要是考察药物分子对蛋白质构象的影响 ,以及检测蛋白质中发
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第 28卷第 4期
2005年 　　　　　　
南京师大学报(自然科学版)
JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERS ITY(Na tural Science)　　　　　　
Vo .l 28 No. 4
2005
内源荧光的氨基酸残基所处微环境的变化.但是到目前为止 ,尚未见有关 HA与蛋白质相互作用同步荧光
光谱的研究报道.
本文利用同步荧光光谱技术研究了 HA与细胞色素 C之间发生的相互作用 ,分析了 HA对细胞色素
C分子中的色氨酸和酪氨酸残基发光的影响 ,并对其作用机理进行了初步探讨 ,为进一步探讨 HA对细胞
膜中的蛋白质光敏损伤提供理论基础.
1　实验部分
1.1　试剂
　　HA为中国科学院理化技术研究所提供 ,马心细胞色素 C为美国 S igm a公司产品 ,使用前未经进一步
的提纯 ,其它试剂均为分析纯试剂. HA由于不溶于水 ,因此用二甲基亚砜 (DMSO)配制成浓溶液待用 ,实
验中直接加入此浓溶液.其余溶液均用二次去离子水配制 , 0.04mo l /L混合磷酸盐溶液 (pH =7.4)作缓冲
液.实验于室温下进行.
1.2　仪器
荧光光谱实验采用 Perkin E lme r公司的 LS 50B型荧光光谱仪.
2　结果与讨论
细胞色素 C分子的形状近似于球形 ,其表面电荷分布很不均匀 ,带正电荷的氨基酸残基(如赖氨酸残
基 )分布于细胞色素 C分子中 ,处于血红素与外部溶液相接触的通道 (活性区域 )附近 ,而带负电荷的氨基
酸残基则处于另一侧.根据文献 [ 9]报道 ,蛋白质中色氨酸 、酪氨酸和苯丙氨酸是仅有的发荧光的氨基酸
残基 ,其中苯丙氨酸通常以共振能的形式把自己的激发能转移到色氨酸残基上 ,所以在蛋白质中通常观察
不到苯丙氨酸的荧光发射峰 ,只能观察到色氨酸和酪氨酸残基的荧光光谱. 细胞色素 C分子中有一个色
氨酸残基和四个酪氨酸残基 ,其中色氨酸残基和一个酪氨酸残基均与细胞色素 C分子中血红素直接相
连 ,余下的三个酪氨酸残基全部或部分埋在疏水环境中. 当选择 Δλ=20 nm时 ,细胞色素 C的荧光光谱表
现为酪氨酸残基的荧光发射峰 ,而当 Δλ=80 nm时 ,表现为色氨酸残基的荧光发射峰[ 10] .
图 2是细胞色素 C在加入 HA前后的同步荧光光谱 ,图中的小插图是在同样实验条件下 ,分析 DMSO
的加入对细胞色素 C荧光光谱的影响 ,结果表明 ,相对于 HA对细胞色素 C荧光光谱的影响而言 , DMSO
的影响完全可以忽略不计.从图 2可知 ,细胞色素 C分子中色氨酸和酪氨酸残基的发射峰峰位分别位于
354 nm和 306 nm间 ,当向溶液中加入 HA之后 ,色氨酸残基的发射峰峰强随着 HA加入量的不断增加而
逐渐增高 ,但是峰位基本不变 ,而酪氨酸残基的发射峰不但峰强不断增强 ,峰位也出现明显的红移 ,该现象
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顾晓天 ,等:竹红菌甲素与细胞色素 C相互作用的同步荧光光谱研究
与 HA和血红蛋白相互作用的同步荧光研究结果相反. 比较两者峰位红移和峰强增强的程度 ,可以发现
HA对细胞色素 C分子中酪氨酸残基所处的微环境影响程度要远大于色氨酸残基 ,该结果表明 HA对细
胞色素 C分子内部微环境影响不大 ,主要是与细胞色素 C外部的氨基酸残基作用 ,从而改变细胞色素 C
的构象.该结论与紫外可见吸收光谱的实验结果一致 ,在两者相互作用的紫外光谱中 ,细胞色素 C分子中
血红素的特征吸收峰不受 HA的加入量的影响 ,而位于 280 nm处的细胞色素 C分子中氨基酸残基的吸收
峰却随着 HA加入量的增加 ,峰强不断增强 ,位于 210 ～ 250 nm之间的强吸收(芳香族及其它残基 、某些类
型的氢键以及其他与构象和螺旋含量有关的相互作用所产生的吸收 )峰位不断红移 ,峰强逐渐下降 ,因此
也说明 HA是主要与细胞色素 C表面的氨基酸残基发生作用 ,与血红素没有直接作用. 另外 ,色氨酸和酪
氨酸残基的荧光强度得到不同程度增强的原因是由于 HA和细胞色素 C分子中赖氨酸残基之间形成的氢
键降低了质子化氨基对氨基酸残基的荧光猝灭作用.
3　结论
同步荧光光谱实验结果说明 HA与细胞色素 C之间的相互作用主要发生在 HA和细胞色素 C分子表
面的氨基酸残基之间 ,对其内部血红素所处的微环境基本没有影响 ,这种相互作用最终使得细胞色素 C
的构象发生变化.
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[责任编辑:孙德泉 ]
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南京师大学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 28卷第 4期(2005年)