全 文 ：基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.31160020)
收稿日期：2013-11-20 接受日期：2013-12-10
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(6): 712~719
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.06.006
铝胁迫下丹波黑大豆根尖细胞线粒体参与细胞凋亡的研究
李金金 刘昂 王平 陈丽梅 年洪娟*
昆明理工大学生物工程技术研究中心，昆明 650500
*通讯作者，hjnian@163.com
摘 要 细胞凋亡(apoptosis)也称程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)，对于生物体正常发育和
繁殖是必不可少的，也受各种生物和非生物胁迫所调控。铝胁迫是酸性土壤中影响植物生长和限制作物
产量的一个主要因子，铝对细胞的毒害之一是诱导程序性细胞死亡。本研究通过用4,6-二脒基-2-苯基吲
哚(4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色观察铝胁迫下丹波黑大豆(Glycine max)根尖细胞细胞核和线
粒体中细胞色素c(cytochrome c, Cyt c)含量等的变化。结果表明，铝胁迫下，丹波黑大豆根尖细胞DAPI染
色后细胞核在细胞边缘聚集，核内的染色质凝聚呈新月状，分布在核内周边，呈致密浓染。大豆根尖细胞
线粒体中的丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量均随着铝处理浓度和时间的增加呈上升趋势，表明大豆根
尖细胞线粒体膜氧化程度增加，膜系统损害更严重。线粒体Cyt c/a的比值能够反映线粒体内膜上Cyt c量
的变化。铝胁迫下，大豆根尖细胞线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,
MPTP)不断开放，线粒体膜电位(ΔΨm)降低，线粒体膜的完整性被破坏，促使Cyt c从线粒体内膜上脱落下
来，线粒体中的Cyt c/a和Cyt c含量减少，Cyt c有可能通过线粒体膜从线粒体释放到细胞质中。这些研究
结果从细胞和生理水平揭示了线粒体和Cyt c在铝诱导丹波黑大豆根尖细胞发生凋亡过程中的作用，进一
步阐明了铝胁迫诱导丹波黑大豆根尖细胞凋亡的过程，加深了铝毒对植物毒害机理的认识。
关键词 丹波黑大豆，铝胁迫，细胞凋亡，线粒体，细胞色素c
Root Tip Cell Mitochondria Involvement in Programmed Cell Death
Induced by Aluminum Stress of Tamba Black Soybean (Glycine max)
LI Jin-Jin LIU Ang WANG Ping CHEN Li-Mei NIAN Hong-Juan*
Biotechnology Research Center, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China
* Corresponding author, hjnian@163.com
Abstract Programmed cell death (PCD) is essential for normal development and reproduction which is also
induced by various biotic or abiotic stress. Aluminum (Al) stress is a major factor limiting plant growth and
yield of crops in acid soils. One of Al toxicity on cells is induced PCD. Whether Al stress causes soybean cell
apoptosis is still poorly understood. In this study, 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining and content
assays of mitochondrial cytochrome c (Cyt c) were performed in Tamba black soybean (Glycine max) root tip
cells under Al stresses. DAPI staining results showed that there was a nucleus aggregation in the cell edge,
and nuclear chromatin condensation displayed a crescent-shaped distribution around the nucleus with dense
stain. The content of mitochondrial malondialdehyde (MDA) of soybean root tip cells increased with the
increased Al concentration and time of Al treatment, which suggested that the degree of mitochondrial
membrane oxidation increased and membrane damage became more serious. Cyt c/a can reflect the content
change of Cyt c within the inner mitochondrial membrane. Mitochondrial permeability transition pore
铝胁迫下丹波黑大豆根尖细胞线粒体参与细胞凋亡的研究
Root Tip Cell Mitochondria Involvement in Programmed Cell Death Induced by Aluminum Stress of Tamba Black Soybean
0 引言
细胞凋亡(apoptosis)也称程序性细胞死亡(pro-
grammed cell death, PCD)，是生物体内绝大多数细
胞在一定发育阶段由基因调控的、自主的、有序的
死亡过程，它对于组织进化、器官发育和机体自身
稳定的维持起着重要作用(Earnshaw, 1995; Steller,
1995; Hochman, 1997)。细胞凋亡受各种生物和非
生物胁迫所调控，例如热激诱导 (Vacca et al.,
2006)、UV-C照射 (Moharikar et al., 2006)、盐胁迫
(Affenzeller et al., 2009)、H2O2 诱导(Darehshouri et
al., 2008)、Cd诱导(Liu et al., 2013)和铝胁迫(Panda
et al., 2008)等。Greenberg等(1994)最早发现植物
中存在细胞凋亡现象。植物细胞凋亡时表现出与
动物细胞凋亡相似的形态和生化特征，线粒体膜电
位(ΔΨm)下降、细胞色素 c(cytochrome c, Cyt c)释
放、活性氧(reactive oxygen species, ROS)释放、细
胞核染色质收缩和DNA片段化等。线粒体是细胞
生命活动的控制中心，它不仅是细胞呼吸链和氧化
磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心。Cyt
c是线粒体呼吸链中传递电子的载体，由多肽和亚
铁血红素组成，松散地结合在富含不饱和脂肪酸的
线粒体内膜外侧磷脂上，不能自由通过线粒体外
膜。Cyt c既参与线粒体能量代谢，释放到胞浆中，
又直接参与细胞凋亡的调节。研究表明，Cyt c从
线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤(Yoshida et al.,
1998)。在凋亡因子的刺激下，线粒体膜通透性转
换 孔 (mitochondrial permeability transition pore,
MPTP)开放，膜通透性升高,跨膜电位下降，并释放
Cyt c到细胞质中，释放的Cyt c在 dATP存在的条
件下能与凋亡相关因子1(apoptotic protease activat-
ing factor-1, Apaf-1)结合，使其形成多聚体，并促使
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)与其结合形
成凋亡小体，激活 caspase-9，活化的 caspase-9进而
激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)，诱导
细胞凋亡(方希敏等, 2005)。
铝(aluminum, Al)是土壤中含量最多的金属元
素，约占地壳总质量的7%，通常其在土壤中主要以
固定态的硅酸盐或氧化物的形式存在，对植物无
害。但当土壤 pH低于 5.0的时候，铝的可溶性增
加，转变为Al3+、Al(OH)+、Al(OH)2+等溶解状态的铝
进入土壤中，微摩尔水平的铝即可对植物造成危害
(杨建立等, 2005)，因此，铝毒害严重影响着酸性土
壤 中 作 物 的 产 量 (Kochian, 1995; Matsumoto,
2000)。铝对植物的毒害表现为从细胞、组织水平
上抑制细胞的伸长，从分子水平上诱导植物细胞产
生ROS，并激活一些抗氧化酶活性，高浓度的ROS
破坏膜的结构和功能，使膜通透性发生改变
(Boscolo et al., 2003; Yin et al., 2010)，阻碍Ca2 +/K+
等通过细胞膜，扰乱细胞内Ca2+平衡，抑制细胞内
Ca2 +信号通路和磷脂酶 C的活性 (Zhang, Rengel,
1999)，诱发超氧化物自由基的产生和乙烯的生物
合成(Yakimova et al., 2007)，与细胞核内的核酸结
合，造成DNA链的破坏(Pan et al., 2001)。植物受
到铝毒害时，细胞产生活性氧，引发膜氧化损伤，导
致线粒体不可逆功能障碍 (Yamamoto et al.,
2002)。铝破坏线粒体氧化还原和钙稳态，ATP过
度损耗，诱导MPTP开放，继而Cyt c从线粒体中释
放出来，导致细胞凋亡。但直到目前为止，Al如何
诱导植物细胞凋亡的机制仍不完全清楚。
本研究通过 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-di-
amidino-2-phenylindole, DAPI)染色观察铝胁迫下
丹波黑大豆(Glycine max)根尖细胞细胞核变化，以
及线粒体中Cyt c含量等的变化，从细胞和生理水
平来揭示铝诱导丹波黑大豆发生凋亡过程中根尖
细胞细胞核变化和线粒体Cyt c在凋亡中的释放行
为，进一步阐明铝胁迫诱导细胞凋亡的过程和铝胁
迫对植物造成毒害的机理。
(MPTP) of soybean root tip cells opened unceasingly, mitochondrial membrane potential (ΔΨm) decreased,
mitochondrial membrane integrity was destroyed under Al stress promoting Cyt c off from the inner
mitochondrial membrane. A reduced value of mitochondrial Cyt c/a and content of Cyt c under Al stress
suggested that Cyt c might be released from mitochondria to the cytoplasm through the mitochondrial
membrane. These findings, from cellular and physiological level, revealed the roles of mitochondria and Cyt c
in Al-induced PCD of Tamba black soybean root tip cells, will furtherly know about PCD process induced by
Al tress and toxic mechanisms of Al to plants.
Keywords Tamba black soybean (Glycine max), Aluminum stress, Programmed cell death, Mitochondria,
Cytochrome c
铝胁迫下丹波黑大豆根尖细胞线粒体参与细胞凋亡的研究
Root Tip Cell Mitochondria Involvement in Programmed Cell Death Induced by Aluminum Stress of Tamba Black Soybean
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农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
1 材料与方法
1.1 材料
丹波黑大豆(Glycine max)，耐铝型黑大豆，最高可
耐200 μmol/L铝(武孔焕等, 2012)，为日本引进品种。
1.2 大豆的培养
用 5%的次氯酸钠对大豆种子进行消毒，用无
菌水冲洗干净后将种子放入盛有滤纸的培养皿中，
培养皿中加入 20 mL无菌水，25 ℃黑暗培养催芽。
种子露白发芽后挑选生长一致的幼苗置于有网眼
的泡沫板上，在含有完全营养液(Lipton et al., 1987)
(pH 4.2)的塑料盆(5 L)中于温室(昼/夜温度为30 ℃/
25 ℃，光照时间为 12 h/d，光 照 强 度 为 1 200
mol/(m2·s)条件下进行通气培养，营养液每天更换。
1.3 铝处理大豆根尖细胞
选取长势一致且未出现侧根的大豆幼苗用
0.5 mmol /L CaCl2溶液(pH 4.3)预处理 12 h。将预
处理后的大豆置于含有 25、50、100、150和 200
μmol/L AlCl3的 0.5 mmol /L CaCl2溶液(pH 4.3)，无
铝胁迫处理用 0.5 mmol /L的 CaCl2溶液(pH 4.3)，
在温室(培养条件如1.2)处理48 h后，收集大豆的主
根和侧根，进行下一步实验。
选取长势一致且未出现侧根的大豆幼苗用
0.5 mmol /L CaCl2溶液(pH 4.3)预处理 12 h。将预
处理后的大豆置于含有 50 μmol/L AlCl3的 0.5
mmol /L CaCl2溶液(pH 4.3)，在温室(培养条件如
1.2)分别处理0、6、12、24、36和48 h后，收集大豆的
主根和侧根，进行下一步实验。
1.4 大豆根尖细胞线粒体的提取
参考谭才邓(2007)的方法略作修改，取丹波黑
大豆幼根1 cm根尖3~5 g，用蒸馏水冲洗2~3遍，加
10 mL预冷的抽提缓冲液(pH 7.5, 50 mmol/L Tris,
0.5 mol/L 蔗糖, 5 mmol/L EDTA, 0.2% BSA, 5
mmol/L半胱氨酸, 0.3% β-巯基乙醇(W/V), 0.3%聚
乙烯吡咯烷酮(W/V),用PBS配制)，冰上研磨，得到
匀浆溶液，收集匀浆液两次，匀浆液4℃，1 000 r/min离
心5 min，收集两次离心的上清，4 ℃，12 000 r/min离
心10 min，弃上清，沉淀用1.5 mL抽提缓冲液悬浮，
并转移至一干净的 2 mL的离心管中，4 ℃，10 000
r/min离心10 min，弃上清，重复一次；得到较纯的线
粒体沉淀，所得沉淀用1.5 mL预冷的抽提缓冲液悬
浮。线粒体浓度以线粒体蛋白含量(mg)表示，利用
考马斯亮蓝法测定线粒体蛋白质含量。
线粒体染色镜检：取适量线粒体悬浮液与詹纳
斯绿B应用液按 1∶1混匀，室温染色 15~20 min，吸
取适量混合液于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜
下进行观察。
詹纳斯绿B应用液配方为，Ringer溶液：NaCl
0.85 g，KCl 0.25 g，CaCl2 0.03 g，用去离子水定容
至 100 mL；1%詹纳斯绿B母液：50 mg詹纳斯绿溶
于 5 mL Ringer溶液中，稍微加热溶解，过滤，即
得。詹纳斯绿B应用液：取1 mL 1%詹纳斯绿 B母
液加入49 mL Ringer溶液，现配现用。
1.5 4,6-二脒基 -2-苯基吲哚 (4,6-diamidino-2-
phenylindole, DAPI)染色
取不同浓度铝处理48 h后的大豆根尖(主根)，
徒手切片，将切片放入 5%戊二醛中进行固定，置
于 4 ℃冰箱固定 2 h以上。固定液用 0.1 mmol/L
PBS (pH 7.0)反复冲洗 3次。将冲洗后的切片移到
载玻片上 (每片约放置 5~10切片)，滴加浓度为 5
μg/mL的 DAP I染色液 10~20 μL，盖好盖玻片，黑
暗染色 10~15 min。放置荧光倒置摄影显微镜
(Leitz Dialux 20, Wetzlar, Germany)下在 340/380
nm紫外光下激发，观察并拍照。
1.6 线粒体丙二醛(MDA)含量的测定
参照詹洁等(2009)的方法进行线粒体丙二醛
的含量测定，按赵世杰等(1994)的方法计算结果。
取 0.2 mL线粒体提取液(对照取 0.2 mL蒸馏水)于
试管，加入 l mL 0.6％的硫代巴比妥酸(TBA)，沸水
浴15 min，冷却后4 000 r/min，离心10 min，分别测
定各管在 532、600 和 450 nm的吸光值，按公式计
算样品中MDA的含量。实验独立重复3次。
计算公式：MDA含量=6.46×{(OD532-OD600)-
0.56×OD450}×V×a/W，其中 V为反应液总量(mL)，a
为稀释倍数，W 为样品重量 (g)，MDA 单位是
nmol/μg 蛋白。
1.7 线粒体膜电位(ΔΨm)的测定
依据参考文献(傅小云等, 2007)，将线粒体蛋
白质含量调至 1 mg/mL，取 100 μL线粒体，加入 1
mL液体C(呼吸功能测定介质(mmol/L): D-甘露醇
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220, 蔗糖 70, HEPES(2- [4- (2- Hydroxyethyl)- 1- pi-
perazinyl]ethanesulfonic acid, 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌
嗪乙烷磺酸)2和 K2HPO4 2, pH 7.0)，37 ℃水浴 5
min，4 ℃下 12 000 r/min离心 5 min，取上清于 500
nm波长处测线粒体外 Rhodamine 123浓度[Xout]。
设定线粒体基质体积为 1 μL/μg蛋白质，线粒体内
Rhodamine 123浓度[Xin]=(3-3.1×[Xout])×10 000/蛋
白浓度。实验独立重复 3次。根据Nemst方程计
算MMP：ΔΨm=59.5 lg[Xin]/[Xout]。Xin为线粒体膜内
电势，Xout为线粒体膜外电势。ΔΨm单位是mV。
1.8 线粒体Cyt c/a值的测定
参照Tonshin等(2003)的方法。分离的线粒体，
用0.2 %(W/V)牛血清白蛋白(BSA)悬浮，调整悬浮
液所含线粒体蛋白质浓度约为0.5 mg/mL。紫外分
光光度计检测550和630 nm处的吸收值，两种波长
的吸收值之比即为Cyt c/a。实验独立重复3次。
1.9 线粒体Cyt c含量的测定
取线粒体悬浮液，用超声波破碎机(SIM-1000D，
南京)将细胞破碎，破坏线粒体膜，用改良的张均田
(1998)的方法测定线粒体Cyt c含量。标准曲线测定，
取0.1 mmol/L Cyt c标准品，取0.2、0.4、0.6、0.8和1.0
mL于试管中，加蒸馏水至1.5 mL，加10 mg连二亚硫酸
钠，520 nm测光密度值，绘标准曲线。由样品光密度值
据标准曲线计算其浓度。实验独立重复3次。计算公
式：Cyt c的含量=3.71×OD520×a×V，其中V为反应液终
体积(mL)，a为稀释倍数，Cyt c单位是nmol/μg蛋白。
1.10 数据处理
数据通过t-检验进行显著性分析(P<0.05或P<0.01)。
2 结果与分析
2.1 铝胁迫下大豆根尖细胞DAPI染色
图1是不同铝浓度处理大豆根尖细胞后DAPI染
色结果。由于DAPI可以与细胞内DNA非嵌入式结
合，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，在紫外
光激发下产生蓝色荧光。荧光显微镜下观察结果表
明，未经铝处理的细胞核形态呈圆形，染色均匀(图
1A)；随着铝处理浓度的增加，细胞核出现细胞凋亡的
明显特征，即细胞核在细胞边缘聚集，核内的染色质
凝聚呈新月状分布核内周边，呈致密浓染(图 1B、
C)。DAPI染色结果表明，50 μmol/L铝处理48 h后极
少的一部分大豆根尖细胞发生凋亡。随着铝胁迫浓度
的增加，会有更多的细胞发生凋亡，当铝浓度达到200
μmol/L时，大部分细胞发生了凋亡或坏死。说明铝处
理浓度越高，大豆根尖细胞的凋亡现象越明显。
2.2 铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体MDA含量变化
MDA是膜脂质过氧化的产物，它的含量可以反
映出大豆根尖细胞线粒体膜脂过氧化程度，其积累
量的高低代表膜系统损伤程度的大小(Lutts et al.,
1996)。随着铝处理浓度的增加，大豆根尖细胞线粒
体的MDA含量随之升高。25 μmol/L铝处理时，
MDA含量与对照相比上升了45.5%，与对照组相比
呈显著差异(P＜0.05)；而 200 μmol/L铝处理时，上
升了 136.4%，与对照组相比呈极显著差异 (P＜
0.01)。处理的浓度越高，线粒体的MDA含量越高
(图2A)。当50 μmol/L铝胁迫大豆根尖细胞时，随着
铝处理时间的增加，线粒体MDA的含量升高。当
处理 12 h，线粒体的MDA含量与对照相比上升了
36.8%，与对照组相比呈显著差异(P＜0.05)。处理
A B C
图 1 DAPI染色检测不同浓度铝处理大豆根尖细胞的凋亡(Bar= 40μm)
Figure 1 DAPI stained soybean root tip cells exposed to different Al concentrations (Bar=40 μm)
A：0 μmol/L，细胞核呈圆形，染色均匀；B：50 μmol/L；C：200 μmol/L，细胞核在细胞边缘聚集，核内的染色质凝聚呈新月状分
布核内周边，呈致密浓染
A: 0 μmol/L, the nuclear morphology of control cells was round and dyeing uniformity; B: 50 μmol/L; C: 200 μmol/L, the nucleus in
the cell edge aggregation, nuclear chromatin condensation showed the crescent-shaped distribution inside the nucleus and a dense stain
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农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
时间达到48 h后，其含量上升了57.9%，与对照组相
比呈极显著差异(P＜0.01)。同一浓度铝处理时，处
理时间越长，线粒体MDA含量越高(图 2B)。说明
随着铝处理浓度和处理时间的增加，大豆根尖细胞
线粒体的MDA含量升高，则大豆根尖细胞线粒体
膜脂过氧化程度随之增加，其膜系统受到的损害更
严重。大豆根尖细胞线粒体膜脂过氧化程度与铝处
理浓度和处理时间之间存在依赖性。
2.3 铝胁迫下线粒体膜电位(ΔΨm)变化
线粒体膜电位(ΔΨm)能反映线粒体膜的完整
性。随着铝浓度的增加，大豆根尖细胞线粒体的
ΔΨm降低。25 μmol/L铝处理时，线粒体的ΔΨm与对
照相比下降了15.2%，与对照组相比呈显著差异(P＜
0.05)。200 μmol/L铝处理时，下降了39.4%，与对照
组相比呈极显著差异(P＜0.01)。处理的浓度越高，线
粒体的ΔΨm越低(图3A)。当50 μmol/L铝胁迫大豆
根尖细胞时，随着铝处理时间增加，线粒体的ΔΨm随
之降低，当处理时间达到12 h时，线粒体的ΔΨm与对
照相比下降了13.8%，与对照组相比呈显著差异(P＜
0.05)。处理时间达到48 h时，下降了23.1%，与对照
组相比呈极显著差异(P＜0.01)。同一浓度铝下随着
处理时间的增加，线粒体的ΔΨm越低(图3B)。
2.4 铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体Cyt c/a的值
Cyt c松散地结合在线粒体内膜外侧磷脂上，不
能自由通过线粒体外膜，而Cyt a紧密地结合在线粒
体内膜上。当铝胁迫大豆根尖细胞后其MPTP不断
开放，线粒体膜电位(ΔΨ m)降低，线粒体膜完整性被
破坏，这促使Cyt c从线粒体内膜上脱落下来释放到
细胞质中。所以Cyt c/a的值能够反映线粒体内膜上
的Cyt c量的变化。图4A中，随着铝处理浓度的增
加，大豆根尖细胞线粒体的Cyt c/a的比值呈下降趋
势。对照实验的大豆根尖细胞线粒体的Cyt c/a值约
为1.49，25、50、100和200 μmol/L铝处理时，Cyt c/a
的值分别约为1.34、1.28、1.25和1.20。图4B中显示，
随着50 μmol/L铝处理时间增加，大豆根尖细胞线粒
体的Cyt c/a的值同样呈下降趋势。表明铝胁迫大豆
根尖细胞后，MPTP不断增大，线粒体ΔΨm不断降低，
Cyt c不断从线粒体内膜上释放。
2.5 铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体Cyt c含量变化
随着铝处理浓度的增加，线粒体中Cty c的含量
减少。50 μmol/L铝处理时，线粒体中的Cyt c的含量
下降了20.5%，与对照组相比呈显著差异(P＜0.05)。
当200 μmol/L铝处理时，下降了52.3%，与对照组相
比呈极显著差异(P＜0.01)。处理的浓度越高，线粒体
中Cyt c的含量越低(图5A)。当50 μmol/L铝胁迫时，
随着铝处理时间增加，线粒体中Cty c的含量随之减
少，当处理时间达到12 h，线粒体中的Cyt c的含量与
对照相比下降了33.3%，与对照组相比呈显著差异
(P＜0.05)。处理时间达到 48 h时，其含量下降了
62.9%，与对照组相比呈极显著差异(P＜0.01)。同一
浓度铝处理时，处理时间越长，线粒体中Cyt c的含量
越低(图5B)。这说明铝处理大豆根尖时，大豆根尖细
胞线粒体Cyt c含量减少，可能是Cyt c从线粒体释放
A B
图2 铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体MDA含量的测定
Figure 2 Mitochondrial MDA content of soybean root tip cells under Al stress
A：不同浓度铝处理大豆根尖细胞 48 h；B：50 μmol/L铝不同时间处理大豆根尖细胞；*：与对照组呈显著性差异(P<0.05)；
**：与对照组呈极显著性差异(P<0.01)；n=3；下同
A: Soybean root tip cells treated with different concentrations Al for 48 h; B: Soybean root tip cells treated with 50 μmol/L Al for
different times; *: Significantly different from the control (P<0.05)；**: Highly significantly different from the control (P<0.01);
n=3; The same below
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到细胞质中。这一结果与前面测大豆根尖细胞线粒
体Cyt c/a的结果基本一致。
3 讨论
铝是酸性土壤上作物产量的主要限制因子之一。
目前国内外对铝毒的研究主要集中在植物耐铝机制方
面(Simões et al., 2012)，关于铝对植物的毒害机理还研
究较少，特别是铝对大豆毒害机理还鲜有报道。
关于细胞凋亡的机理在动物中研究比较清楚。
线粒体是细胞凋亡的重要参与者(Armstrong, 2006;
Singh et al., 2007)。线粒体外膜通透性增加被认为是
细胞凋亡过程中的初始步骤 (Hewitson, Darby,
2010)。凋亡相关蛋白从线粒体释放到细胞质是线粒
体外膜破坏的结果。在这些蛋白质中，Cyt c是线粒
体呼吸链的一个组成部分。Andronis和 Roubelakis-
Angelakis(2010)通过Western blot和Cyt c融合绿色
荧光蛋白检测发现盐胁迫烟草后其线粒体中Cyt c会
释放到细胞质中，从而导致烟草线粒体中的Cyt c量
减少而细胞质中的Cyt c量增加。本研究通过分光光
度法测定了铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体中Cyt c的
含量变化情况，发现线粒体中Cyt c含量减少，推测可
能是释放到细胞质中。
A B
图 3 铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的测定
Figure 3 Mitochondrial membrane potential (ΔΨm) of soybean root tip cells under Al stress
图 4 铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体Cyt c/a的值
Figure 4 Mitochondrial Cyt c/a of soybean root tip cells under Al stress
A B
A B
图 5 铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体Cyt c的含量
Figure 5 Mitochondrial Cyt c content of soybean root tip cells under Al stress
铝胁迫下丹波黑大豆根尖细胞线粒体参与细胞凋亡的研究
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Al/(μmol· L-1) t/h
Al/(μmol· L-1) t/h
C
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农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
线粒体内膜的电子传递链上除了含有Cyt c还
含有Cyt a。Cyt c松散地结合在富含不饱和脂肪酸的
线粒体内膜外侧磷脂上，不能自由通过线粒体外膜，
而Cyt a紧密地结合在线粒体内膜上。Cyt c/a的比值
能够反映线粒体内膜上的Cyt c含量的变化。Ton-
shin等(2003)通过不同的线粒体细胞色素的吸收光谱
发现老鼠心肌组织细胞凋亡过程中线粒体的Cyt c/a
比值会降低。本研究通过分光光度法测定铝胁迫下
大豆根尖细胞线粒体的Cyt c/a比值的变化，发现线粒
体的Cyt c/a比值也降低，这也说明线粒体中的Cyt c
含量减少。铝胁迫处理是否促使Cyt c从线粒体释放
到细胞质中，还有待于我们进一步通过Western blot
方法检测铝胁迫下大豆根尖细胞线粒体和细胞质中
Cyt c的含量变化。
铝胁迫会导致植物产生大量活性氧，活性氧参
与破坏细胞膜的流动性和渗透性，与质膜和细胞器
膜中不饱和脂肪酸的氢离子结合，膜脂质产生过氧
化(Boscolo et al., 2003; Yin et al., 2010)。而MDA
是膜脂过氧化的产物，本研究发现，线粒体中MDA
含量在铝胁迫后升高，这说明线粒体膜是铝毒的作
用位点，铝胁迫会导致线粒体膜脂发生过氧化损
伤。Panda 等(2008)通过 rhodamine 123荧光染色
发现铝胁迫烟草后会导致烟草细胞线粒体的膜电
位(ΔΨm)降低。本研究通过分光光度法测定铝胁
迫下大豆根尖细胞线粒体的膜电位(ΔΨm)的变化，
发现线粒体的膜电位(ΔΨm)也降低。这说明铝胁
迫使线粒体膜完整性受破坏，这可能也是Cyt c从
线粒体内膜上脱落下来，导致线粒体内Cyt c含量
减少的原因之一。本研究 DAPI染色结果表明铝
胁迫可以导致丹波黑大豆根尖细胞发生凋亡，并且
从生理水平揭示了线粒体和Cyt c在铝诱导大豆根
尖细胞发生凋亡过程中的作用；首次对大豆在铝胁
迫下细胞凋亡的生理机制进行了探索。这些研究
结果可以为提高酸性土壤上的大豆产量和培育耐
酸铝抗性品种提供理论参考。
4 结论
铝能诱导丹波黑大豆根尖细胞发生凋亡，并且
在凋亡过程中大豆根尖细胞细胞核在细胞边缘聚
集，核内的染色质凝聚呈新月状，分布在核内周边，
呈致密浓染。线粒体中的膜电位(ΔΨm)、Cyt c/a、
Cyt c会随着铝处理浓度和时间的增加呈下降趋
势，而丙二醛(MDA)的含量随之增加。这表明铝胁
迫下，大豆根尖细胞线粒体膜通透性转换孔
(MPTP)不断开放，膜氧化程度增加，膜的完整性被
破坏，促使Cyt c从线粒体内膜上脱落下来，Cyt c
有可能通过线粒体膜从线粒体释放到细胞质中。
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(责任编辑 马丽萍)
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