全 文 ：论著·桂药研究
▲基金项目:广西自然科学基金(2011GXNSFA018243);广西中医药管理局项目(GZZC1052)
作者简介:蒋林志(1965 ～)，男，硕士，主任医师，研究方向:激光手术白内障。
双氢杨梅树皮素对人视网膜母细胞瘤
HXO-ＲB44 细胞色素 C氧化酶表达的影响▲
蒋林志1 梁 皓1 严宇清1 陈迎迎1 唐 琪2 彭格员2
(1 广西医科大学第一附属医院眼科，南宁市 530021，E-mail:gxjlzhi@ 163． com;
2 广西医科大学 2009 级研究生，南宁市 530021)
【摘要】 目的 探讨双氢杨梅树皮素(APS)对体外培养的视网膜母细胞瘤(ＲB)细胞中细胞色素 C 氧化酶蛋白 IV
(COX-IV)表达的影响。方法 取对数生长期的人 ＲB 细胞株(HXO-ＲB44)进行体外培养，根据 APS 药物浓度设 3 个组:
4． 40 μg /ml(A组)、14． 84 μg /ml(B组)、33． 33 μg /ml(C组)，并设空白对照组及顺铂(2． 00 μg /ml)阳性对照组。采用蛋白
质印迹分析(Western Blot法)测定各组 COX-IV的表达量。结果 不同药物浓度组 APS 干预体外培养的 ＲB 细胞 24 h后，
COX-IV的表达量均明显降低;各 APS药物组与空白对照组、阳性对照组比较，差异均有统计学意义(P ＜ 0． 05)，其中 A 组
降低 COX-IV活性表达最为明显，相对灰度值为(0． 112 ± 0． 032);各组间并不呈现随药物浓度增加，COX-IV 活性表达降低
越明显的特征。结论 APS能降低 COX-IV的表达量，COX-IV的表达可能存在启动阈值，其表达量并不随 APS药物浓度升
高而降低。
【关键词】 视网膜母细胞瘤;双氢杨梅树皮素;细胞色素 C氧化酶;藤茶
【中图分类号】 Ｒ 774 【文献标识码】 A 【文章编号】 0253-4304(2015)03-0356-04
DOI:10． 11675 / j． issn． 0253-4304． 2015． 03． 22
Influence of ampelopsin on expression of cytochrome C oxidase of human retinoblastoma HXO-ＲB44 cells
JIANG Lin-zhi1，LIAN Hao1，YAN Yu-qing1，CHEN Ying-ying1，TANG Qi2，PENG Ge-yuan2
(1 Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China;
2 Graduate School，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)
【Abstract】 Objective To explore the influence of ampelopsin(APS)on the expression of cytochrome C oxidase IV(COX-IV)of
human retinoblastoma(ＲB)cell cultured in vitro． Methods Human retinoblastoma ＲB cell lines(HXO-ＲB44)cultured in vitro were
divided into three groups according the APS concentration，group A (4． 40 μg /ml)，group B(14． 84 μg /ml)and group C(33． 33 μg /ml)．
The blank control group and positive control group(cisplatin，2． 00 μg /ml)were enrolled in the study． The COX-IV expression was
determined in each group by Western Blot． Ｒesults The COX-IV expression decreased significantly in each APS group after ＲB cells
cultured in vitro had been treated for 24 hours，which showed a significant difference among each APS group，blank control group and
positive control group(P ＜ 0． 05)． The decrease of COX-IV activity expression was the most significant in group A，and the relative grey value
was (0． 112 ±0． 032)． No group presented a characteristic of higher drug concentration and lower COX-IV activity expression． Conclusion
APS can reduce the expression of COX-IV． The COX-IV expression may own the threshold，and its expression doesn t decrease with the
increasing APS concentration．
【Key words】 Ｒetinoblastoma;Ampelopsin;Cytochrome C oxidase;Ampelopsis grossedentala
视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，ＲB)是婴幼儿时期
最常见的眼内恶性肿瘤，其对患儿的视力和生命产生严
重的危害。关于 ＲB的治疗，国内目前以眼球摘除术、放
疗、化疗为主。近年来，中药及其有效成分在抗肿瘤的
研究领域中被人们所重视。广西是藤茶的主要产地，双
氢杨梅树皮素(ampelopsin，APS)为藤茶的主要成分，是
黄酮类化合物之一［1］。近期研究证实 APS 对体外培养
的人肝癌细胞、肺癌细胞均有显著的抑制增殖及促凋亡
作用［2，6］，但其对 ＲB细胞是否有类似的作用尚未见相关
报道。本课题前期实验研究发现［3］，APS 对体外培养的
ＲB细胞亦有明显的抑制作用，并可诱导 ＲB 细胞凋亡。
本文拟对其抗肿瘤作用机制作进一步的相关研究，为临
床探索新的抗眼内肿瘤药物提供理论依据。
1 材料及方法
1． 1 材料
1． 1． 1 细胞来源:人 ＲB细胞株系 HXO-ＲB44 购自中南
大学湘雅医学院肿瘤研究所。
653 Guangxi Medical Journal，Mar． 2015，Vol． 37，No． 3
1． 1． 2 试剂:ＲPMI-1640 培养基、胎牛血清(Hyclone 公
司);DMSO液(博大泰克公司);BCA蛋白浓度测定试剂
盒(碧云天研究所);P0013B 型 ＲIPA 细胞裂解液(碧云
天研究所);ECL 化学发光试剂盒(Sigma 公司);PBS 缓
冲盐(福州迈新公司);注射用顺铂(齐鲁制药有限公
司);细胞色素 C 氧化酶(COX)-IV PolyClonal Antibody
(武汉三鹰公司);辣根酶(HＲP)标记山羊抗兔 IgG(武
汉三鹰公司)。
1． 1． 3 仪器:BIO-ＲAD 电泳仪(美国 BIO-ＲAD 公司);
Gel doc2000 凝胶成像分析系统(美国 Bio-Ｒad 公司);细
胞培养台(黄埔设备公司);CO2 细胞培养箱(美国 Thermo
Forma公司);LXJ-IIB 型低速离心机(上海安亭仪器厂);
可调微量移液器(浙江华威公司);电子天平(Mettler
Toledo);超低温冰箱(美国 Thermo Forma 公司);电热恒
温水浴箱(北京西城医疗厂);ML-902 型定时磁力搅拌
器 (绍兴设备公司);涡旋混合器(江苏贝尔仪器公司)。
1． 1． 4 药物制备:APS 购自广西中医药大学药理学研究
室，纯度 98． 50%。APS溶解于 DMSO后加入不含血清的
ＲPMI-1640细胞培养液。然后按浓度梯度以 2 /3 比例稀
释为 33． 33 μg /ml(A)、14． 84 μg /ml(B)、4． 40 μg /ml(C)，
经 0． 22 μm微孔滤过膜滤过，置于冰箱中 4℃保存。
1． 2 方法
1． 2． 1 细胞培养:在 5% CO2 培养箱中 37℃条件下用
含有 10%灭活胎牛血清的 ＲPMI-1640 细胞培养液培养
传代 HXO-ＲB44 细胞至对数生长期，制成单细胞悬液，
用计数板计数细胞，调整细胞密度至 1 × 106 /ml，并接种
于 6 孔细胞培养板中，每孔 2 ml。
1． 2． 2 药物干预:分为药物组、顺铂阳性对照组和空白
对照组，各药物组分别加入 20 μl不同浓度 APS，使得药
物终浓度分别为 4． 40 μg /ml(A 组)、14． 84 μg /ml
(B组)、33． 33 μg /ml(C 组)，每一药物浓度设 6 个重复
孔，阳性对照组加入顺铂 2． 00 μg /ml，并设空白对照孔，
对照孔均加入 20 μl 完全培养基。将细胞培养板置于
5% CO2 恒温培养箱中培养 24 h。
1． 2． 3 细胞收集:收集每孔细胞于离心管中，1 000 r /min
离心5 min，用 PBS液重悬细胞，1 000 r /min离心5 min，洗
涤细胞，共洗两次，吸管吸尽液体。离心管中加入200 μl
ＲIPA-P0013B细胞裂解液和3 μl蛋白酶抑制剂，置于冰水
上摇晃 5 min，使细胞和裂解液充分接触，共置于冰上
30 min，每 5 min 摇晃一次，在 4℃、7 000 r /min 下离心
10 min，取上清液。用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋
白浓度。
1． 2． 4 凝胶电泳:将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜铺在凝胶
上，用 5 ml 移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
在凝胶 /PVDF膜外再包一张 3 mm滤纸(预先用转移缓冲
液浸湿)，将凝胶夹在中间。将上述装置放入缓冲液槽
中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶，开始电泳转移，转移结
束后，弃去凝胶，PVDF 膜在 1 × TBS-T 中室温漂洗
10 min ×3次，而后置于 20 ml封闭缓冲液中，放于平缓摇
动的摇床上，室温封闭 2 h，1 × TBS-T 液洗膜 3 次，每次
10 min。
1． 2． 5 孵育处理:加入抗体(1 ∶ 500 比例稀释加入)，置
于平缓摇动的摇床上室温孵育 2 h，4℃ 孵育过夜。
PVDF膜于 1 × TBS-T液中震荡清洗 3 次，每次 5 min，加
入 HＲP标记的山羊抗兔二抗抗体(1 ∶ 1 000 比例稀释加
入)，置于平缓摇动的摇床上，室温孵育 2 h。TBS-T 洗
涤 10 min × 4 次，TBS洗涤 1 次，5 min。
1． 2． 6 蛋白质印迹分析(Western Blot)法测定灰度值:
显影混合液 A及 B各 1 ml，PVDF膜浸没其中，约 5 min。
观察有无蛋白显色带。如出现条带，ddH2O 漂洗 PVDF
膜以终止反应。结果用 Gel doc2000 凝胶成像分析系统
摄像，测定各 APS 药物组及空白对照组条带的灰度值。
用 β-actin蛋白灰度值作为目标蛋白的相对灰度值进行
计算。
1． 3 统计学分析 采用 SPSS 13． 0 统计软件进行统计
学处理，计量资料以(x ± s)表示，采用单因素方差分析
及均数两两比较的 SNK-q检验，以 P ＜ 0． 05 为差异有统
计学意义。
2 结 果
2． 1 COX-IV蛋白表达 不同APS药物浓度组的 COX-IV
条带荧光显影较空白对照组淡(图 1)。各个 APS药物组
的 COX-IV相对灰度值与空白对照组比较，差异均有统计
学意义(P ＜0． 05);各个药物浓度组间比较差异有统计学
意义(P ＜0． 05)，其中 A组(4． 40 μg /ml)的 COX-IV活性
表达降低最为明显，其相对灰度值为(0． 112 ±0． 032)。各
APS药物组间并不呈现随药物浓度增加，COX-IV活性表
达降低的现象;顺铂阳性对照组(2 μg /ml)COX-IV相对灰
度值与各个 APS药物组进行组间比较，差异均有统计学意
义(P ＜0． 05)，其中 A组(4． 40 μg /ml)的相对灰度值低于顺
铂阳性对照组(P ＜0． 05)，即低药物浓度组 COX-IV活性表
达较顺铂阳性对照组低，而 B 组(14． 84 μg /ml)及 C 组
(33． 33 μg /ml)COX-IV 的活性表达均高于顺铂阳性对
照组(P ＜ 0． 05)，见表 1。
图 1 顺铂组、空白组、APS各组 COX-IV活性表达
753广西医学 2015 年 3 月第 37 卷第 3 期
表 1 各组 COX-IV活性表达的比较(x ± s)
组别 n COX-IV蛋白表达灰度值
A组 6 0． 112 ± 0． 032
B组 6 0． 302 ± 0． 035
C组 6 0． 266 ± 0． 030
阳性对照组 6 0． 173 ± 0． 009
空白对照组 6 0． 454 ± 0． 031
F值 118． 090
P值 ＜ 0． 001
3 讨 论
ＲB在发达国家的新生儿发病率大约为 1 ∶ 15 000［4］，
大多发生于 3 岁之前。国内目前以眼球摘除术为主，放
疗、化疗作为手术治疗后的辅助治疗。但手术治疗存在
破坏性，由于外观畸形严重影响患儿身心发育和生活质
量，而放疗和化疗有较明显的毒副作用及并发症。近年
来，中药及其有效成分在抗肿瘤药物研究领域中越来越
被人们所重视。其不易产生耐药性且毒副作用低，还具
有多效应、多环节、多靶点的特点，可通过诱导细胞凋
亡、调节细胞信号传导、抑制端粒酶活性等途径发挥抗
肿瘤作用。
APS又名二氢杨梅素、蛇葡萄素、双氢杨梅素，广泛
存在于藤黄科、杨梅科及杜鹃科等植物中，是黄酮类化
合物之一。黄酮类化合物具有广泛抗肿瘤作用，可以抑
制肿瘤细胞蛋白酶体的活性及体内致癌物质的激活;增
强机体的解毒系统功能、拓扑异构酶Ⅱ的活性、脂肪酸
合成酶的活性及多种耐药基因的表达等［5］。APS 作为
黄酮类化合物之一，也具有抗肿瘤作用，但是具体的作
用机制尚未完全明了。张玉萌等［6］发现 APS 能增强抑
癌基因 p53 表达水平，升高癌细胞内钙水平及增加癌细
胞 Caspase-3 活性，从而诱导细胞凋亡，发挥其抗肿瘤的
作用。
COX是呼吸链的第四个中心酶复合物，是线粒体呼
吸酶系的关键酶。当 COX 活性受到抑制时，就会造成
细胞的“化学窒息”，ATP 合成下降，细胞内活性氧
(ＲOS)增加及胞质中的 Ca2 +升高。其 IV 亚基在保持
COX酶活性中心的疏水环境、酶分子的结构、活性调节
等方面有重要作用。当 IV 亚基的正常表达受到干扰，
COX应不能正常装配，功能显著下降，细胞状态不稳
定［7］。
本实验采用 Western Blot 法检测 COX-IV 亚基蛋白
活性表达水平的变化，进而反映线粒体中 COX 的活性
表达及功能改变。本文结果显示，不同浓度的 APS 干预
ＲB细胞 24 h后，与空白对照组比较，细胞内 COX-IV 蛋
白活性表达均明显下降(P ＜ 0． 05)。COX 是唯一能将
电子传递给氧分子的细胞色素，当 COX 活性受到抑制
时，就会造成细胞的“化学窒息”。而其 IV 亚基在保持
COX酶活性中心的疏水环境、酶分子的结构、活性调节
等方面有重要作用。APS 可通过抑制细胞色素 C 氧化
酶的正常表达，使线粒体呼吸链传递电子功能受到抑
制，甚至被阻断，引起线粒体损伤，从而诱导肿瘤细胞凋
亡，这可能是 APS抗肿瘤作用机制之一(图 2)。
图 2 APS抗 ＲB作用机制示意图
与顺铂阳性对照组相比，APS低药物浓度组COX-IV活
性更低，而 APS 中药物浓度组及高药物浓度组 COX-IV活
性表达高于阳性对照组。APS各药物组 COX-IV并不呈现
随药物浓度升高，表达降低越明显的特性。由此我们推测，
COX-IV亚基的合成及其基因表达的调控机制在其中起
着重要作用，并且可能存在调控启动阈值，当外界因素
干预达到一定程度时，其调控机制才会被激活。有研究
表明［8］，缺氧时 COXI 和 IV 的 mＲNA 稳定量增加的同
时，并不伴有线粒体内蛋白含量的变化，说明亚基蛋白
含量与 COX亚基 I和 IV的 mＲNA稳态量之间并没有直
接关系，推测转录后或翻译后调节机制参与了线粒体内
COX亚基 I和 IV蛋白含量的调整。线粒体内未组装的
COX蛋白亚基分解速率增加，亚基之间的结合，以及亚
基与酶辅基的结合，可以明显增加亚基蛋白的稳定性。
对 COX-IV蛋白而言，它在胞浆中合成后转运到线粒体，
与 mtDNA编码亚基组装，其跨线粒体内膜的转运以及
在线粒体内全酶的组装也可能参与了线粒体内 COX-IV
蛋白稳定量的调节［9］。COX 是一种多亚基、多形式、多
基因组来源的复合体，其基因的表达调控相当复杂，每
个亚基可能都有自己独特的作用机制，从而对外部刺激
产生不同的反应。细胞核 －线粒体两个编码系统的相
互作用也影响着 COX 的基因表达，在完全抑制线粒体
DNA 表达的情况下，COX 核编码亚基的表达只是部分
抑制，但降解速度加快［10］。鉴于 COX 在细胞能量代谢
中的特殊地位，进一步研究其基因表达及调控，有助于
揭示线粒体在细胞病理改变的分子机理。
(下转第 367 页)
853 Guangxi Medical Journal，Mar． 2015，Vol． 37，No． 3
者登记管理机制尚未成熟，造成了广西平均接受率的下
滑。随着广西 TB /HIV双重感染防治综合管理模式的全
面推广应用，该工作已逐渐趋于完善。各地更加重视结
核病防治机构和艾滋病防治机构的合作，建立并完善以
卫生行政部门为管理核心，结核病防治机构、艾滋病防
治机构、综合医疗机构及社会团体各司其职的合作机制
和专家小组病例讨论例会制度。在有效的网络化管理
和诊疗信息共享化模式下，患者的服务可及性得到了有
力保障。
从治疗转归看，2010 ～2013年登记转归的 TB /HIV双
重感染患者抗 TB 成功治疗率为 65． 83%，TB 病死率为
1． 24%(39 /3 140)，与 WHO 2011 年发布的 HIV/AIDS 中
1 /4死于 MTB 感染的数据［9］相比，有非常明显的下降。
但是，治疗失败、失访及其他转归仍然占 22． 71%。这一
结果体现了 TB /HIV双重感染患者开展治疗的困难性和
复杂性。肺外 TB的成功治疗率较低，因此应该加大这类
患者的治疗、管理和关怀。
综上所述，广西的 TB /HIV 双重感染疫情随着
TB /HIV双重感染防治综合管理模式的全面实施而得到了
有效的控制。但是，TB /HIV 患者的治疗工作难度较大，
今后应建立有效的部门沟通合作机制，加强对患者的治疗
管理和关怀，尽可能减少治疗失败和死亡。
参 考 文 献
［1］ Shafer ＲW，Edlin BＲ． Tuberculosis in patients infected with
human immunodeficiency virus:perspective on the past dec-
ade［J］． Clin Infect Dis，1996，22(4):683 －704．
［2］ Lawn SD，Churchyard G． Epidemiology of HIV-associated tu-
berculosis［J］． Curr Opin HIV AIDS，2009，4(4):325 －333．
［3］ Getahun H，Gunneberg C，Granich Ｒ，et al． HIV Infection-asso-
ciated tuberculosis:the epidemiology and the response［J］． Clin
Infect Dis，2010，50(Suppl 3):S201 －207．
［4］ Minniear TD，Gilmore B，Arnold SＲ，et al． Implementation of
and barriers to routine HIV screening for adolescents［J］．
Pediatrics，2009，124(4) :1 076 －1 084．
［5］ 中华人民共和国卫生部．全国结核菌 /艾滋病病毒双重感
染防治工作实施方案(试行)［EB /OL］． (2010-08-03)
［2014-11-04］http:/ /www． moh． gov． cn /publicfiles /busi-
ness /htmlfiles /mohjbyfkzj / s3589 /201008 /48342． htm．
［6］ 徐广保，周昌明，崔哲哲，等．广西第五轮全球基金 TB/HIV
双重感染项目分析和评价［J］． 中国防痨杂志，2009，31
(11):641 － 644．
［7］ Corbett EL，Watt CJ，Walker N，et al． The growing burden of
tuberculosis:global trends and interactions with the HIV epi-
demic［J］． Arch Intern Med，2003，163(9) :1 009 － 1 021．
［8］ 王黎霞，成诗明，周 林，等．结核菌 /艾滋病病毒双重感
染防治工作技术指导手册［M］．北京:人民卫生出版社，
2012:20 － 23．
［9］ WHO． Guidelines for intensified tuberculosis case-finding and
isoniazid preventive therapy for people living with HIV in re-
source constrained settings［Ｒ］． Geneva:Switzerland，2011．
(收稿日期:2014 －10 －11 修回日期:2015 －01 －23)
(上接第 358 页)
本课题前期研究从细胞形态学改变证实了 APS 可
以诱导体外培养的 ＲB细胞凋亡，凋亡率随 APS 的浓度
的增加而增高［3］。本实验用 Western Blot 法从分子生物
学水平进一步揭示了 APS 诱导体外培养的 ＲB 细胞凋
亡的可能的作用机理。我们认为 ABS 与目前在临床上
应用的抗 ＲB西药顺铂具有相同的抗肿瘤作用，其在临
床上具有一定的开发前景，但对眼内其他正常组织是否
具有毒副作用还有待进一步研究。
参 考 文 献
［1］ 钟正贤，覃洁萍，周桂芬，等． 广西瑶族藤茶中双氢杨梅
树皮素的药理研究［J］．中国民族医药杂志，1998，4(3):
42 － 44．
［2］ 郑作文，唐云丽，张玉萌．藤茶双氢杨梅树皮素对人肝癌
BEL-7404 细胞增殖的抑制作用［J］． 中国药物应用与监
测，2008，5(1):4 － 6．
［3］ 唐 琪，郑作文，蒋林志，等． 藤茶双氢杨梅树皮素对人
视网膜母细胞瘤 HXO-ＲB44 细胞凋亡的诱导作用［J］．
实用肿瘤杂志，2014，29(3):223 － 227．
［4］ Tamboli A，Podgor MJ，Horm JW． The incidence of retino-
blastoma in the United States:1974 through 1985［J］． Arch
Ophthalmol，1990，108(1) :128 － 132．
［5］ Ｒamos S． Effects of dietary flavonoids on apoptotic pathways
related to cancer chemoprevention［J］． J Nutr Biochem，
2007，18(7) :427 － 442．
［6］ 张玉萌，郑作文，郭成贤，等． 藤茶双氢杨梅树皮素诱导
人肺癌 A549 细胞凋亡及其机制研究［J］．中国药物应用
与监测，2008，5(5):16 － 18．
［7］ Li Y，Park JS，Deng JH，et al． Cytochrome c oxidase subunit
IV is essential for assembly and respiratory function of the
enzyme complex［J］． J Bioenerg Biomembr，2006，38(5 － 6) :
283 －291．
［8］ Nakai T，Mera Y，Yasuhara T，et al． Divalent metal ion-de-
pendent mitochondrial degration of unassembled subunits 2
and 3 of cytochrome c oxidase［J］． J Biochem，1994，116
(4) :752 － 758．
［9］ Suzuki H，Hosokawa Y，Nishikimi M，et al． Existence of
common homologous elements in the transcriptional regulato-
ry regions of human nuclear genes and mitochondrial gene
for the oxidative phosphorylation system［J］． J Biol Chem，
1991，266(4) :2 333 － 2 338．
［10］ Nijtmans LG，Spelbrink JN，Van Galen MJ，et al． Expression
and fate of the nuclearly encoded subunits of cytochrome-c
oxidase in cultured human cells depleted of mitochondrial
gene products［J］． Biochim Biophys Acta，1995，1 265(2 －3):
117 － 126．
(收稿日期:2014 － 12 － 27 修回日期:2015 － 03 － 11)
763广西医学 2015 年 3 月第 37 卷第 3 期