全 文 ：中国农业大学学报　２０１６，２１（５）：７６－８２
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｈｔｔｐ：∥ｘｕｅｂａｏ．ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．１１８４１／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－４３３３．２０１６．０５．１０
高效毛细管电泳法研究重瓣榆叶梅花中蛋白质的动态变化
徐毅励１　陈媛梅１＊　郑彩霞２
（１．北京林业大学 理学院，北京１０００８３；
２．北京林业大学 生物科学与技术学院，北京１０００８３）
摘　要　为验证毛细管电泳方法，研究测定重瓣榆叶梅花朵生长过程中的ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶和细胞色素Ｃ含量及
动态变化的有效性，以磷酸氢二钠溶液为提取液，超声提取重瓣榆叶梅花朵中的蛋白质作为待测液，考察缓冲溶液
种类、浓度、ｐＨ、分离电压、分离温度及进样时间等因素对 ＨＰＣＥ分离检测蛋白质的影响。确定了 ＨＰＣＥ最佳测定
条件为：运行缓冲液为ｐＨ为２．５、浓度为３０ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸氢二钠溶液，０．５ＭＰａ压力进样５ｓ，分离电压为８ｋＶ，
电泳温度为２５℃，检测波长为２５４ｎｍ。在最佳条件下，样品可在２０ｍｉｎ内完全分离，线性关系良好。该方法准
确、快速、简便，可同时检测样品中的ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶和细胞色素Ｃ。
关键词　重瓣榆叶梅；花朵；高效毛细管电泳；蛋白质；ＲＮＡ酶；ＤＮＡ酶；细胞色素Ｃ
中图分类号　Ｓ　６６２．１　　　文章编号　１００７－４３３３（２０１６）０５－００７６－０７　　　文献标志码　Ａ
收稿日期：２０１５－０６－１１
基金项目：国家自然科学青年基金项目（４１３０３０４４）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（２０１５ＺＣＱ－ＬＹ－０３）
第一作者：徐毅励，硕士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｕｙｉｌｉｑｑ＠１２６．ｃｏｍ
通讯作者：陈媛梅，副教授，主要从事天然化合物的提取分离与物理化学性质研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈｙｍ１１＠ｂｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗｅｒ　ｏｆ
Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｔｒｉｌｏｂａｆ．ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｂｙ　ＨＰＣＥ
ＸＵ　Ｙｉ－ｌｉ　１，ＣＨＥＮ　Ｙｕａｎ－ｍｅｉ　１＊，ＺＨＥＮＧ　Ｃａｉ－ｘｉａ２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８３，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｔｏ　ｖｅｒｉｆｙ　ＨＰＣＥ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ，ＲＮａｓｅ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ
ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅｉｒ　ｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｆｌｏｗｅｒ　ｏｆ　Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｔｒｉｌｏｂａｆ．ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ，ｓａｍｐｌｅｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｄｉｓｏｄｉｕｍ
ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｂｙ　ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ　ａｆｔｅｒ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
Ｔｈｅ　ｅｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐＨ　ｏｆ　ｂｕｆｅｒ，ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｖｏｌｔａｇｅ，ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｎ　ｔｈｅ
ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ：ｔｈｅ　ｒｕｎｎｉｎｇ　ｂｕｆｅｒ，３０ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄｉｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ
ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｗｉｔｈ　ｐＨ　２．５；Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ，５ｓｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｏｆ　０．５ＭＰａ；Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｖｏｌｔａｇｅ，８ｋＶ；Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，２５℃；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｗａｖｅ　ｌｅｎｇｔｈ，２５４ｎｍ．Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｉｎ　２０ｍｉｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｇｏｏｄ
ｌｉｎｅａｒ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮａｓｅ，ＲＮａｓｅ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ　ｉｎ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ｏｆ　Ａ．ｔｒｉｌｏｂａ　ｆ．ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅｓ　ｏｆ　ｈｉｇｈ
ａｃｃｕｒａｃｙ，ｆａｓｔ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｔｒｉｌｏｂａｆ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ；ｆｌｏｗｅｒｓ；ＨＰＣＥ；ｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮａｓｅ；ＤＮａｓｅ；ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ
　　重瓣榆叶梅（Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｔｒｉｌｏｂａｆ．ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ），又
名小桃红，属蔷薇科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）桃属落叶灌木或小
乔木，具有开花早、花期长、花朵大、分布地域广、耐
干燥土壤、适应性强、易成活等特点［１－２］。重瓣榆叶
梅花粉富含蛋白质、氨基酸、生物酶等化合物，ＤＮＡ
酶、ＲＮＡ酶和细胞色素Ｃ等为其中重要的蛋白质
类化合物。ＤＮＡ 酶、ＲＮＡ 酶能催化细胞内的
ＤＮＡ、ＲＡＮ水解，生成的水解产物能抗氧化、延缓
机体衰老［３］；在凋亡因子的诱导下，线粒体释放出大
量的细胞色素Ｃ；细胞色素Ｃ与活化的ＤＮＡ酶协
　第５期 徐毅励等：高效毛细管电泳法研究重瓣榆叶梅花中蛋白质的动态变化
同作用，可加速诱导细胞凋亡［４］。可以从花粉中将
以上成份提取出来，用在保健食品、药品以及营养性
化妆品中［５］，寻求和开发无毒天然食用蛋白资
源［６－７］。
高效毛细管电泳（Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｃａｐｉｌａｒｙ
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＨＰＣＥ）是经典电泳技术与现代微
柱相结合的一种分析技术，具有微量、分析快、自动
化程度高等特点，已被广泛应用于氨基酸、多肽、蛋
白质、核酸、有机分子、无机离子等研究，在临床药物
分析、环境监测和生命科学等领域有重要作用［８－１１］。
ＨＰＣＥ在蛋白质分析方面的应用主要包括物化常
数的 测 定、纯 度 分 析、微 量 制 备、蛋 白 质 组 学
（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）研究、生化反应及其过程的分析、结合
蛋白质及其衍生物的研究等众多领域［１２］。与目前
常用的蛋白质分析的仪器和方法相比较，ＨＰＣＥ主
要有反应速度快、精度高，用量少、能很好地分离相
似的蛋白质［１３］等优势。目前，有关ＨＰＣＥ分离检测
重瓣榆叶梅花朵中蛋白质的研究还未见报道。本研
究主要采用超声波法［１４］提取重瓣榆叶梅花朵中蛋
白质，用 ＨＰＣＥ法来测定不同开花时间的重瓣榆叶
梅花朵中ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、细胞色素Ｃ含量，以期
了解重瓣榆叶梅花朵生长过程中这３种蛋白质含量
的动态变化规律，旨在为综合开发利用重瓣榆叶梅
花朵中蛋白质提供理论依据。
１　材料与方法
１．１　材料及试剂
材料：重瓣榆叶梅花朵采集于北京林业大学校
内，包括花苞期、开花１周、开花２周、开花３周（大
部分已凋谢）４个时期。冷藏于－３０℃冰箱中。
试剂：Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、盐酸、磷酸氢二钾、硼砂、硼酸、
乙酸、乙酸钠、羟乙基纤维素、磷酸二氢钾、丙酮、氢
氧化钠、盐酸、聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）均为分析纯。
标准品：牛血清蛋白（９５％）、细胞色素 Ｃ（９５％）
ＲＡＮ酶（９５％）、ＤＮＡ 酶（９５％）、试验用水均为超
纯水。
１．２　主要仪器
本研究使用的仪器有美国 Ａｇｉｌｅｎｔ公司的
ＨＰ３Ｄ毛细管电泳仪（配有二极管阵列检测器（ＤＡＤ）
及色谱工作站），北京时代北利离心机有限公司的
３Ｋ３０ 台 式 高 速 冷 冻 离 心 机，Ｏｈａｕｓ 公 司 的
ＩｔｅｍＡＲ２１４０电子天平，重庆万达仪器有限公司的
电热鼓风干燥箱，昆山市超声仪器有限公司的
ＫＱ５００ＤＢ型超声波清洗器，日本岛津公司的 ＵＶ－
２４５０紫外可见分光光度计。
１．３　标准溶液及样品溶液的制备
标准品溶液：准确称取０．１００ｇ牛血清蛋白，加
磷酸氢二钠溶液溶解后定容至１００ｍＬ，得到标准蛋
白储备液；分别准确称取质量均为０．０５０　０ｇ的
ＲＡＮ酶、ＤＮＡ酶、细胞色素Ｃ分别加水溶解后定
容至５０ｍＬ，得到标准样品储备液。冰箱中保存，使
用前经微孔滤膜过滤。
样品溶液：取１ｇ重瓣榆叶梅花朵，放入研钵
中，加入５０ｍｇ吡咯烷酮（ＰＶＰ），在低温下充分研
磨，在适宜的条件［１４］下进行超声提取，取上清液经
微孔滤膜过滤后，作待测液。
１．４　ＨＰＣＥ方法
分析样品之前，依次用１．０和０．１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ、
１ｍｏｌ／Ｌ　ＨＮＯ３、超纯水和缓冲液各冲洗５ｍｉｎ，以
保证检测物质的峰面积、出峰时间都具有良好的重
复性。以ｐＨ２．５的３０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠溶液为
运行缓冲液，加入适量羟乙基纤维素作为添加剂，采
用涂层熔融石英毛细管（５８．５ｃｍ×７５μｍ内径，有
效长度５０ｃｍ；河北邯郸永年光纤制造厂生产），０．５
ＭＰａ压力下进样５ｓ，于２５４ｎｍ检测波长、２５℃电
泳温度、８ｋＶ恒定电压下进行 ＨＰＣＥ。试验结束
后，依次用１ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＯＨ、１ｍｏｌ／Ｌ　ＨＮＯ３、超纯水
各冲洗８ｍｉｎ，防止缓冲液或样品残留“凝固”后将
毛细管电泳柱堵塞住。试验中所有溶液使用前均需
水膜或有机膜过滤，防止毛细管电泳柱被堵。同时，
还应在低温下超声处理７ｍｉｎ，以便除去其中的细
小气泡。
２　结果及分析
根据毛细管电泳图谱的出峰时间、峰形、分离度
以及仪器所能提供的条件等诸多方面因素，对
ＨＰＣＥ的分离蛋白质的条件进行了考察、优化。分
离条件主要包括：分离介质、电泳电压、温度及进样
时间，且分离介质的性能与所用缓冲液的种类、ｐＨ、
浓度等因素密切相关。
２．１　缓冲液体系的确定
２．１．１　缓冲溶液种类
分别用磷酸氢二钠做缓冲液、磷酸二氢钾、硼酸
缓冲液、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液作实验缓冲液体系，在相
同的其他条件下进行标准蛋白的分离。结果表明，
用磷酸氢二钠缓冲液作试验体系时出峰时间，比磷
７７
中 国 农 业 大 学 学 报 ２０１６年 第２１卷　
酸二氢钾缓冲液体系的出峰时间短，且前者基线更
稳定；虽然Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液与硼酸缓冲液体系的出
峰时间短、基线稳定，但是出峰数少、分离效果差。
这是因为在低ｐＨ 下，磷酸氢二钠做缓冲液是高浓
度低导电的缓冲液体系，吸附和电渗流值都很小，且
有很好的缓冲容量［１５］，故能更好的将蛋白质分开。
故选择磷酸氢二钠缓冲液为分离缓冲液。
２．１．２　缓冲溶液浓度
大多数情况下，缓冲容量随浓度的增大而增大，
离子强度增大，管壁和离子之间相互作用增强；然而
缓冲液浓度增大时，电渗流速降低，溶质在毛细管内
迁移速度下降［１５－２０］。本试验分别配置１０、３０、５０、
７０、９０ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸氢二钠缓冲液，在相同的其
他条 件 下 进 行 标 准 蛋 白 的 分 离，结 果 表 明，
１０ｍｍｏｌ／Ｌ的缓冲液峰值较低，３０ｍｍｏｌ／Ｌ的缓冲
液分离效果较好，而５０ｍｍｏｌ／Ｌ的缓冲液基线稳定
性差、分离度低，７０、９０ｍｍｏｌ／Ｌ的缓冲液几乎不能
出现良好的峰形。综合考虑，缓冲液浓度选择
３０ｍｍｏｌ／Ｌ为试验缓冲液浓度。
２．１．３　缓冲溶液ｐＨ
缓冲液的ｐＨ 一方面影响溶质组分的电离度，
另一方面影响电渗流的大小，从而影响溶质的迁移
速率和方向［１５－２０］。本试验考察了ｐＨ 为１．５、２．０、
２．５、３．０和３．５的磷酸氢二钠缓冲液对蛋白分离效
果的影响。结果表明，在不同ｐＨ下，标准蛋白均有
一定程度的分离，ｐＨ 为１．５和２．０时，出峰数太
少、分离度低，且基线不稳；ｐＨ 为２．５时，出峰数
多，分离度高，出峰时间较短，基线稳定；ｐＨ 为３．０
时，分离度高，但最后出峰时间长；ｐＨ为３．５时，分
离度低，出峰时间较长。综合分离效果，选择磷酸氢
二钠缓冲液的ｐＨ为２．５。
２．２　电泳条件的确定
２．２．１　电泳检测波长
本试验考察了检测波长为１９１、２００、２１４、２５４
和２８０ｎｍ时的电泳图谱［１５－１６］。结果表明，在上述５
个波长下标准蛋白的电泳图中，在２５４ｎｍ波长下，
图谱中的基线比１９１、２００和２１４ｎｍ检测波长下的
基线更稳定，且比２８０ｎｍ 波长下的出峰数更多。
综上所述，选择检测波长为２５４ｎｍ。
２．２．２　电泳进样时间
进样时间会影响分离效果，如果进样时间过小，
得到的峰面积太小，进而导致分析误差过大［１７］。进
样时间如果过大，则增加样品塞的长度，使柱效和分
离度降低，在多组成分样品定量分析中，必须使各种
被测样品离子浓度尽量保持一致［１５］。因此选择适
宜的进样时间，既能保证试验灵敏度的要求，又能获
得良好的分离效果。
试验在进样压力为０．５ＭＰａ固定不变时，考察
了进样时间为１、３、５、７和９ｓ时对分离效果的影
响。结果表明，随着进样时间的增加，峰面积加大，
且对分离效果有影响。进样时间为１、３、７和９ｓ
时，基本不能将蛋白分开，无良好的峰形出现，且基
线不稳，分离度效果很差。而只在进样时间为５ｓ
时，分离度高，有多个良好的峰形，基线稳定。综上
所述，选择进样时间为５ｓ。
２．２．３　电泳电压的确定
柱长一定时，随着操作电压的增加，迁移时间缩
短，在一定的范围内，柱效随电压增大而增大，但是
电压的过大，柱内的焦耳热较大，柱效反而下降，缓
冲液的黏度减小，使操作电压与迁移时间不呈线性
关系［１５］；因此，常需选择最佳操作电压。本试验考
察了电压为４、６、８、１０、１２ｋＶ 时对分离效果的影
响。结果表明，当电压为４ｋＶ时，峰形太宽，且基
线不稳。电压为６ｋＶ时分离时间不如８ｋＶ时短；
虽然随着电压增大，迁移时间变短，然而电压为
１０ｋＶ时，有些信号不能接收到，电压为１２ｋＶ时，
基线不稳且“噪声”明显增大。综合所述，选择电泳
电压为８ｋＶ。
２．２．４　电泳温度的确定
温度不仅影响分离的重现性，而且改变缓冲液
的粘度，影响电渗流速，使峰展宽，进而影响分离效
率［１５－２０］。本试验考察了电泳温度为１０、１５、２０、２５和
３０℃时对分离效果的影响。结果表明，当温度为
１０℃ 时，分离效果不错，但是分离时间较长，而在
当温度为２０℃时，不如２５℃分离效果好。随着温
度的升高，出峰时间缩短，但３０℃时分离度下降，且
测得含量降低。从分离度、出峰时间、避免降解等方
面综合考虑，选择电泳温度为２５℃
综上，最终确定 ＨＰＣＥ分析蛋白质的最佳条件
为：ｐＨ２．５、浓度为３０ｍｍｏｌ／Ｌ的磷酸氢二钠溶液
为缓冲液体系，分离电压为８ｋＶ、进样时间为５ｓ、
检测波长为２５４ｎｍ、温度为２５℃。
２．３　标准曲线的建立
分别吸取一定量的标准品储备液，配置一系列
浓度的 ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶和细胞色素Ｃ的标准溶
液。按照上述最佳条件进行５次平行试验，以质量
８７
　第５期 徐毅励等：高效毛细管电泳法研究重瓣榆叶梅花中蛋白质的动态变化
浓度（ｘ）为横坐标，峰面积（ｙ）为纵坐标绘制标准曲
线，结果见图１。由图１可知，ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶和细
图１　３种标准样品的标准曲线
Ｆｉｇ．１　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅｓ　ｏｆ　ＤＮａｓｅ，ＲＮａｓｅ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ
胞色素Ｃ的线性方程分别为：ｙ＝１　４５２．２ｘ＋１．７３２　０、
ｒ２＝０．９９８　３，ｙ＝１　６５７．８ｘ＋４．１２４　０、ｒ２＝０．９９７　９，
ｙ＝２　０６５．２ｘ＋２．５７２　０、ｒ２＝０．９９８　８，且均在０．０１～
０．１ｍｇ／Ｌ内，峰面积与质量浓度线性关系良好，出
峰时间分别为９．８９５、１６．０７６和１３．８８９ｍｉｎ。
２．４　精密度试验
分别取含有０．１０ｍｇ／Ｌ　ＤＮＡ酶、０．１０ｍｇ／Ｌ
细胞色素Ｃ和０．１０ｍｇ／Ｌ　ＲＮＡ酶的标准品溶液，
在最佳 ＨＰＣＥ条件下重复进样５次，结果见表１，从
表１中可知该方法测定３种标准样品的含量，ＲＳＤ
值均较低，表明本方法的精密度高，方法稳定可行。
２．５　重复性试验
取开花２周的样品５份，按照“１．３”方法制备待
测液，在最佳 ＨＰＣＥ条件下进行分别试验。测得
ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、细胞色素Ｃ的峰面积的ＲＳＤ值
分别为３．０１％、１．０１％、１．６７％，出峰时间的 ＲＳＤ
值分别为０．４９６％、０．３０１％、０．１８６％，从结果可知，
出峰时间和峰面积的ＲＳＤ值均较低，说明该试验方
法重复性好，稳定性高。
２．６　回收试验
准确称取开花２周的重瓣榆叶梅花朵样品１ｇ，
加入不同含量的标样进行试验。平行５次，求得
ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、细胞色素Ｃ的平均回收率分别
为９２．２％、９０．９％、９０．３％，回收率的ＲＳＤ值分别
为０．９４２％、１．１１％、０．７４５％，说明该方法适用于测
定重瓣榆叶梅花朵中的ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、细胞色
素Ｃ的含量。
表１　精密度试验结果
Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ
类别
Ｃａｔｅｇｏｒｙ
ＤＮＡ酶峰
面积／Ａｕ
ＤＮａｓｅ
ＤＮＡ酶出峰
时间／ｍｉｎ
ＤＮａｓｅ
ＲＮＡ酶峰
面积／Ａｕ
ＲＮａｓｅ
ＲＮＡ酶出峰
时间／ｍｉｎ
ＲＮａｓｅ
细胞色素
Ｃ峰面积／Ａｕ
Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ
细胞色素
Ｃ出峰时间／ｍｉｎ
Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ
１　 １４９．３４２　 ９．８８９　 １６７．９３８　 １６．０４２　 ２０７．９６７　 １３．９０９
２　 １４７．９８８　 ９．９６４　 １６９．０１１　 １６．０３７　 ２０９．４５３　 １３．９５４
３　 １４８．７８５　 ９．８５９　 １７３．０８３　 １５．９０３　 ２０６．８９７　 １３．６６７
４　 １５０．０６７　 １０．０４５　 １６８．２１４　 １６．１１３　 ２０７．８６３　 １４．０１９
５　 １４９．２８４　 ９．７９５　 １６９．７２６　 １６．０３６　 ２０８．３２１　 １３．８５４
平均值 １４９．０９３　 ９．９１０　 １６９．５９４　 １６．０２６　 ２０８．１００　 １３．８８１
相对偏差／％ ０．５１６　 ０．９７６　 １．２２０　 ０．４７５　 ０．４４３　 ０．９６４
９７
中 国 农 业 大 学 学 报 ２０１６年 第２１卷　
２．７　重瓣榆叶梅花朵的测定
图２为样品溶液与添加了ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、
细胞色素 Ｃ标样的样品溶液的电泳图谱。比较
图２（ａ）和（ｂ）可知，添加标样的样品图谱中 ＤＮＡ
酶、ＲＮＡ酶、细胞色素Ｃ的峰均比未加标样时的峰
明显增高，峰面积明显增大，表明样品中含有ＤＮＡ
酶、ＲＮＡ酶、细胞色素Ｃ。
图３为不同时期重瓣榆叶梅花朵中蛋白质的电
泳图谱。利用图３可得到不同时期样品中的ＤＮＡ
酶、细胞色素 Ｃ、ＲＮＡ 酶的含量，结果见表２。从
表２与图３可知，花苞期中ＲＮＡ酶、细胞色素Ｃ的
含量分别为０．０３２和０．４０８ｍｇ／ｇ，未检测到ＤＮＡ
酶，而在开花１周后花中的ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、细胞
色素Ｃ的含量分别为０．８０１、０．０３５和０．１３６ｍｇ／ｇ。
开花２周后花中ＤＮＡ酶、细胞色素Ｃ、ＲＮＡ酶的含
量分别为０．０３０、０．１３５和０．２８７ｍｇ／ｇ，ＲＮＡ酶的
含量最多。在开花３周后只有细胞色素Ｃ和ＲＮＡ
酶，分别为０．４７１和０．０７４ｍｇ／ｇ，检测到少量的
ＤＮＡ酶。植物细胞中的ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶的主要
作用分别是水解细胞中的ＤＮＡ、ＲＮＡ，而细胞色素
Ｃ是生物呼吸电子传递体，参与细胞呼吸过程，且一
定浓度细胞色素Ｃ可诱导细胞凋亡［４］。从图４可
知，ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶在花的生长过程中含量的变化
趋势均是先增加后降低，而花中细胞色素Ｃ的含量
的变化趋势为先降低后增加。这３种蛋白质在花中
含量的动态变化均与花的生长过程中的生理代谢对
１，ＤＮＡ酶 ＤＮａｓｅ；２，细胞色素Ｃ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ；３，ＲＮＡ酶 ＲＮａｓｅ。
图２　未加标样（ａ）和加标样（ｂ）样品图谱
Ｆｉｇ．２　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ（ａ）ａｎｄ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｂ）
（ａ）花苞期 （ｂ）开花１周 （ｃ）开花２周 （ｄ）开花３周。
（ａ）Ｂｕｄｓ；（ｂ）Ｏｎｅ－ｗｅｅｋ　ａｆｔｅｒ　ａｎｔｈｅｓｉｓ；（ｃ）Ｔｗｏ－ｗｅｅｋ　ａｆｔｅｒ　ａｎｔｈｅｓｉｓ；（ｄ）Ｔｈｒｅｅ－ｗｅｅｋ　ａｆｔｅｒ　ａｎｔｈｅｓｉｓ．
图３　不同时期的重瓣榆叶梅花朵的样品溶液的ＨＰＣＥ图谱
Ｆｉｇ．３　ＨＰＣＥ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ｏｆ　Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｔｒｉｌｏｂａｆ．ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｌｏｏｍｉｎｇ　ｐｅｒｉｏｄｓ
０８
　第５期 徐毅励等：高效毛细管电泳法研究重瓣榆叶梅花中蛋白质的动态变化
表２　不同时期重瓣榆叶梅花朵中ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、细胞色素Ｃ含量
Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｏｎｔｅｎｓ　ｏｆ　ＤＮａｓｅ，ＲＮａｓｅ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ　ｉｎ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ｏｆ
Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｔｒｉｌｏｂａｆ．ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｆｏｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｌｏｏｍｉｎｇ　ｐｅｒｉｏｄｓ　ｍｇ／ｇ
组分
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
ＤＮＡ酶
ＤＮａｓｅ
ＲＮＡ酶
ＲＮａｓｅ
细胞色素Ｃ
Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ
花苞期 ０．０００　 ０．０３２　 ０．４０８
开花１周 ０．８０１　 ０．０３５　 ０．１３６
开花２周 ０．０３０　 ０．２８７　 ０．１３５
开花３周 ０．０００　 ０．０７４　 ０．４７１
　　（ａ）花苞期，（ｂ）开花１周，（ｃ）开花２周，（ｄ）开花３周。
（ａ）Ｂｕｄｓ；（ｂ）Ｏｎｅ－ｗｅｅｋ　ａｆｔｅｒ　ａｎｔｈｅｓｉｓ；（ｃ）Ｔｗｏ－ｗｅｅｋ　ａｆｔｅｒ
ａｎｔｈｅｓｉｓ；（ｄ）Ｔｈｒｅｅ－ｗｅｅｋ　ａｆｔｅｒ　ａｎｔｈｅｓｉｓ．
图４　重瓣榆叶梅花朵生长过程中蛋白质的含量变化曲线
Ｆｉｇ．４　Ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｌｏｗｅｒｓ　ｏｆ
Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｔｒｉｌｏｂａ　ｆ．ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｂｌｏｏｍｉｎｇ　ｐｅｒｉｏｄｓ
这３种蛋白质的需求量的变化相一致。根据结果可
知，在开花２周的重瓣榆叶梅花朵中均能检测到
ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、细胞色素Ｃ，并且在这时期花中
蛋白质最丰富，故选择开花２周的重瓣榆叶梅花朵
作为最佳综合开发利用的食品与生物性化妆品
原料。
３　结　论
本研究利用 ＨＰＣＥ分离与测定多种蛋白质的
方法，在最佳 ＨＰＣＥ条件下分离和测定了不同开花
时间的重瓣榆叶梅花朵中的ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶、细
胞色素Ｃ的含量。结果表明，在花的生长过程中，
ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶的含量是先增加后降低，这２种蛋
白质含量均在盛花期达到最高，而花中细胞色素Ｃ
的含量是先降低后增加，在开花一周后花中含量最
低。在开花２周后花中蛋白质最丰富。因此，开花
２周的重瓣榆叶梅花朵中的蛋白质应用于食品、化
妆品等方面的价值最高。
与凝胶电泳分离蛋白相比较，ＨＰＣＥ法灵敏度
明显提高。利用 ＨＰＣＥ法分离测定了花在生长过
程中ＤＮＡ酶、ＲＮＡ酶和细胞色素Ｃ的含量，揭示
了重瓣榆叶梅花朵生长过程中蛋白质含量的动态变
化规律。这为寻求和开发天然食用蛋白资源等提供
了方法，也为重瓣榆叶梅花朵中蛋白质的开发利用
提供了参考资料。
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ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｃａｐｉｌａｒｙ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｅｉｊｉｎｇ
Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０（６）：９－１２（ｉｎ　Ｃｈｉｎｅｓｅ）
责任编辑：王燕华
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