全 文 ：　第 23 卷第 1 期
2004年 1月 　 　 　　　　 　
无 锡 轻 工 大 学 学 报
Journal of Wuxi University of Light Industry
　 　 　　　　Vol.23　No.1
Jan.　2004
　文章编号:1009-038X(2004)01-0017-04
　　收稿日期:2003-04-10;　修回日期:2003-09-10.
作者简介:刘萍(1970-), 女(满族),吉林长春人 , 讲师 ,工学博士 , ＊通讯作者.
松口蘑菌丝体糖蛋白 MP 的性质及其结构
刘萍1 , 2 , 　陶文沂1＊ , 　敖中华1
(1.江南大学生物工程学院 ,江苏 无锡 214036;2.中国农业大学 食品学院 ,北京 100083)
摘　要:通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 、红外 、紫外扫描 、气相色谱 、氨基酸组成 、β-消去反应等方法研
究松口蘑菌丝体糖蛋白 MP的结构性质 ,结果表明 ,该糖蛋白的相对分子质量为 57 000 ,红外扫描
有典型的多糖吸收峰 ,糖苷键为 α型;单糖组成为葡萄糖和木糖 ,摩尔比(r)为 34∶1 ,紫外扫描有蛋
白质吸收峰 ,蛋白质量分数为 75.5%,多糖为 24.5%,多糖与蛋白质为 O-糖肽键连接.
关键词:松口蘑;菌丝体;糖蛋白;结构性质
中图分类号:Q 513.2 文献标识码:A
Structural Characteristics of Glycoprotein from
Mycelium of Tricholoma Matsutake Sing.
LIU Ping1 , 2 , 　TAO Wen-yi1＊ , 　AO Zhong-hua1
(1.School of Biotechnolog y , Southern Yangtze University , Wux i 214036 , China;2.College of Food Science and Nutri-
tional Eng ineering , Chinese Ag ricultural Univ ersity , Beijing 100083 , China)
Abstract:Structural characteristics of the gly coprotein M P from the mycelium of Tricholoma
matsutake S ing.were determined by SDS-PAGE , inf ra-red scan , gas chromatog raphy , and β-
elimination reaction.The SDS-PAGE elect rophoresis results show ed that MP w as a new gly coprotein.
It s molecular weight is 57 000 containing 75.5%protein and 24.5%poly saccharide.The glycoprotein
has O- glycoside peptide bond , with Gly and Ser being the major amino-acids.It includes α- type
glycosidiclinkage , and the g lucose and xylose composition(molar)ratio in it s reduct ive sugar is 34∶1.
Key words:Tricholoma matsutake S ing ;Glycoprotein M P;structural characteristics
　　松口蘑(Tricholoma matsutake Sing.)是赤松
等树木的活体共生菌 ,又称松茸 、松蕈或松蘑.松口
蘑菇体肥厚 ,香气宜人 ,肉质鲜美 ,有很高的营养价
值与特殊功效 ,抑癌率高达 90%以上 ,列菌类之首 ,
日本人称之为“菇中之王”[ 1] .河村幸雄(1994)将松
口蘑子实体经水提取 、凝胶过滤 、阴离子交换树脂
和疏水色谱层析后获得具有抗肿瘤活性的酸性糖
蛋白[ 2] .作者发现在松口蘑深层发酵菌丝体中存在
着一种糖蛋白 ,该物质对体外培养的宫颈癌细胞
HeLa细胞和动物体内肿瘤细胞 S-180 均具有较强
的抑制增殖活性 ,是一种潜在的抗肿瘤药物[ 3] .本
实验采用气相色谱(GC)、红外光谱(IR)、紫外 、电
泳 、氨基酸分析等技术对松口蘑菌丝体糖蛋白 MP
的化学结构进行了初步的探讨.
1　材料与方法
1.1　实验材料
松口蘑菌种:购自上海农科院菌种保藏中心.
1.2　松口蘑菌丝体糖蛋白提取
松口蘑菌丝体深层培养方法参见文献[ 4] .松
口蘑菌丝体匀浆后水提取 ,上清液加入 70%饱和度
的硫酸铵盐析 ,蛋白质组分经 DEAE 离子交换柱和
Sepharose CL-6B柱层析获得菌丝体糖蛋白 MP ,经
凝胶色谱和电泳证明为相对分子质量分布均一级
组分.
1.3　实验方法
1.3.1　相对分子质量测定　将标准相对分子质量
蛋白质与 MP 进行 SDS-PAGE凝胶电泳 ,以标准蛋
白质的迁移率为纵坐标 , lgM 为横坐标 ,绘制相对分
子质量曲线.根据 MP 迁移率得出相对分子
质量[ 5] .
1.3.2　糖含量测定　苯酚-硫酸法 ,以葡萄糖为标
准品[ 6] .
1.3.3　蛋白质测定　Folin-酚试剂法 ,以牛血清白
蛋白为标准品[ 7] .
1.3.4　单糖组成分析　气相色谱法测定单糖组成
及摩尔比(r).
称取 10 mg 样品 、30 mg 硼氢化钠和 5 mg 内标
物肌醇 ,2 mL 水 ,振荡后室温下放置 1.5 h ,使糖还
原成相应的糖醇.滴入醋酸分解硼氢化钠 ,至无气
泡产生为止.溶液在 60℃下减压浓缩至干 ,加入体
积分数 0.1%盐酸甲醇溶液 2 mL ,振荡后减压蒸发
至干 ,重复 4 次以除去硼酸根.剩余物在 105 ℃烘
箱中加热 15 min除去水分 ,加入 0.5 mL吡啶和 0.
5 mL醋酸酐 ,封管后在沸水浴中反应 1 h ,反应产
物直接进行气相色谱分析.根据气相色谱分析中各
峰的面积比计算出 r.气相色谱分析条件:色谱柱为
弹性石英毛细管柱 ,内径 0.32 mm ,长 30 m;担体
为Chromosorb WAW DMCS(80-100目);固定液为
3%OV-1701;载气 N2 ,体积流量 1.5 mL/min;氢
火焰检测器(FID);气化室温度 260 ℃;检测温度
250 ℃;程序升温:180 ℃(3 min)※240 ℃(30
min).根据标准单糖与样品的保留时间比较 ,确定
组成单糖种类 ,并根据各峰面积计算出 r.
1.3.5　红外光谱分析　取 MP 10 mg 与 KBr 压
片 ,用 IR-440扫描.
1.3.6　氨基酸组成分析　准确称取MP 50 mg ,以
6 mol/ L HCl 溶解 ,封管 , 水解 24 h 后定容至 50
mL ,取 1 mL 蒸干 ,加 0.02 mol/L HCl溶解后用氨
基酸自动分析仪分析.氨基酸自动分析仪为日立-
835型.
1.3.7　紫外光谱分析　将 MP 配成 5 mg/mL 的溶
液 ,采用 UV-3000在 200 ～ 500 nm之间进行扫描.
1.3.8　MP 中糖苷键连接方式的确定　MP 用 0.2
mol/L NaOH 于 60 ℃处理 30 min;对照样品按同样
方法配制 ,配好后立即放入 4 ℃冰箱 ,测定其在 220
～ 400 nm 的吸收光谱.
2 　结果与分析
2.1　基本物理性质
MP 为白色粉末 ,易溶于水 ,不溶于乙醇等有机
溶剂.硫酸-苯酚 、硫酸-蒽酮 、硫酸-咔唑反应 ,考马
斯亮蓝反应呈阳性;菲林试剂 、碘-碘化钾反应呈阴
性 ,表明其中含有多糖 、蛋白质 、糖醛酸 ,不含还原
糖和淀粉.糖质量分数为 24.5%,蛋白质质量分数
为 75.5%.
2.2　MP的相对分子质量
经SDS-PAGE测得 MP 的亚基相对分子质量
为 57 000(见图 1).
图 1　MP的 SDS-PAGE凝胶电泳
Fig.1　The SDS-PAGE electrophorase of MP
2.3　单糖组成
GC分析结果见图 2 ,3.
1.鼠李糖;2.阿拉伯糖;3.木糖;4.甘露糖;5.葡萄糖;6.半乳糖
图 2　标准单糖的气相色谱
Fig.2　GC of Standard Sugars
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图 3　MP水解物的气相色谱
Fig.3　GC of Hydrolysates of MP
　　从标准单糖和 MP 的单糖组成气相色谱中可
以看出 ,MP 含有葡萄糖和木糖 ,葡萄糖与木糖摩尔
比为 34∶1.
2.4　红外光谱分析
从图 4中可以看出 ,MP 在 1 530 , 1 630和3 420
cm-1有明显吸收峰.根据文献 , 在 3 200 ～ 3 600
cm-1之间的吸收峰主要是由多糖游离羟基的伸缩
振动引起的;在 2 800 ～ 3 000cm-1的吸收峰是 C-H
伸缩振动 ,这一区域的吸收峰是糖类的特征吸收
峰.1 630cm-1处的吸收峰是-CHO 的 C=O 伸缩
振动造成的 ,为肽链上酰胺羰基的吸收峰 ,在 840
cm
-1处有一明显的吸收峰 ,这是 α-型 C-H 变角振
动的特征吸收峰 ,表明存在 α-糖苷键.本品在 1 530
cm-1 ,1 630 cm-1 ,3 420 cm-1处明显的吸收峰 ,表
明样品既含蛋白质又含有糖 ,为糖蛋白[ 8] .
图 4　MP 的红外光谱
Fig.4　The infrared spectrum of MP from the mycelium
of T.Matsutake
2.5　氨基酸组成
MP 的氨基酸组成见表 1.从表中可以看出 ,
MP 以Gly和 Ser含量最高 ,其次是Glu ,Asp ,Val和
Lys.
表 1　MP 糖蛋白氨基酸组成及质量分数
Tab.1　The amino acid composition and content of glycopro-
tein MP
氨基酸种类 质量分数/ % 氨基酸种类 质量分数/ %
Asp 8.363 Ile 2.523
Thr 4.953 Leu 5.832
Ser 11.88 Tyr 0.778
Glu 9.664 Phe 3.844
Gly 29.243 Lys 6.172
Val 8.857 His 1.671
Met 1.656 Arg 4.560
2.6　紫外光谱分析及 β-消除反应
从图 5 , 6中可以看出 , MP 在 260 nm 处无吸
收 ,在 280 nm 左右有一肩形峰 ,这是蛋白结合多糖
的特征吸收峰.在植物糖蛋白中 ,目前主要发现的
糖肽键有 2种类型 ,一种是 N-型糖肽键 ,另一种是
O-型糖肽键.前者对碱稳定;后者极易被碱打开 ,在
糖肽连接处 ,若为丝氨酸即转变成 α-氨基丙烯酸 ,
若为苏氨酸 ,则转变为 α-氨基丁烯酸.这两种不饱
和氨基酸 ,均在 230 ～ 240 nm 处有特征紫外吸收.
MP 经碱处理后在 240 nm 处产生明显的特征吸收
峰 ,说明 MP 中的糖肽键为O-糖肽键[ 9] .
图 5　MP 的紫外光谱
Fig.5　UV Spectrum of MP
图 6　MP经 β-消除反应后的紫外光谱
Fig.6　UV Spectrum of MP after β-reaction
19　第 1期 刘萍等:松口蘑菌丝体糖蛋白 MP 的性质及其结构
3　结　论
本实验对松口蘑菌丝体抗肿瘤活性物质 MP
的理化性质与结构进行了初步研究 ,发现 MP 为白
色粉末 , 含蛋白质与多糖 , 相对分子质量约为
57 000 ,含有蛋白质质量分数 75.5%,多糖质量分
数24.5%.综合红外光谱 、紫外光谱 、β-消除反应 、
氨基酸组成等的检定结果表明 ,MP 为含有 O-糖肽
键的糖蛋白 ,多糖主要由葡萄糖和木糖组成 ,摩尔
比为 34∶1 ,含糖基类型为 α-型 ,氨基酸组成以 Gly
和 Ser为主要氨基酸.
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(责任编辑:杨 萌)
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(责任编辑:杨 勇)
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