全 文 :食用菌学报2014.21(4):53~57
收稿日期:2014-09-09原稿;2014-10-15修改稿
基金项目:上海市科技兴农重点攻关项目 (编号:沪农科攻字(2012)第2-9号)的部分研究内容
作者简介:韩 乐(1989-),女,在读硕士,主要从事天然化合物的分离纯化及药理活性方面的研究。
*本文通讯作者 E-mail:whan@ecust.edu.cn
文章编号:1005-9873(2014)04-0053-05
棘托竹荪液态深层发酵水提物和不同浓度乙醇提取物
的抗氧化活性及化学成分分析
韩 乐1,2,冯 娜2,冯 杰2,韩 伟1*,马 迪1,2,张劲松2
(1华东理工大学药学院,上海200237;2上海市农业科学院食用菌研究所,国家食用菌工程技术研究中心,
农业部南方食用菌资源利用重点实验室,上海市农业遗传育种重点开放实验室,上海201403)
摘 要:测定棘托竹荪(Dictyophora echinovolvata)液体发酵菌丝体和发酵液水提物及不同浓度乙醇提取物
DPPH自由基清除能力以评价其抗氧化活性。结果表明:棘托竹荪菌丝体的20%、60%乙醇提取物,发酵液的
20%、60%和95%乙醇提取物均具有较好的抗氧化能力,其清除DPPH自由基的能力强于对照品芦丁,其中棘
托竹荪发酵菌丝体的20%醇提物抗氧化活性最强,其清除 DPPH自由基的IC50值为0.012mg/mL。利用中
药材系统预实验方法鉴定了棘托竹荪发酵菌丝体和发酵液水提物及不同浓度乙醇提取物所含化学成分类型。
结果表明:棘托竹荪发酵菌丝体和发酵液的水提物及不同浓度乙醇提取物中均可能含有糖类、氨基酸和蛋白、
有机酸等物质,而黄酮体、生物碱、蒽醌和甾体等类物质在不同浓度乙醇提取物中的含量有所差异。
关键词:棘托竹荪;菌丝体;发酵液;DPPH自由基;抗氧化活性;化学成分
棘托竹荪(Dictyophora echinovolvata),属
鬼笔科(Phalaceae),竹荪属(Dictyophora),是
一种名贵的食用菌,因其营养丰富,味道鲜美可
口,素有“菌中皇后”、“山珍之花”的称谓。该菌
野生种多生长在有大量竹子残体和腐殖质的竹
林地里,目前在我国南方已有人工栽培[1,2]。由
于竹荪属真菌具有良好的防腐功能,因此关于棘
托竹荪生物活性的研究多集中在其子实体提取
物的抑菌和抗氧化能力上[3-9]。已有对棘托竹荪
子实体菌盖的水、乙醇、乙酸乙酯提取物和多糖
提取物及其孢子粉的水提物和醇提物进行体外
抗氧化活性的实验,结果表明棘托竹荪子实体菌
盖的各种提取物对 DPPH自由基、羟自由基、超
氧阴离子自由基的清除率均呈量效关系,棘托竹
荪孢子粉的水提物和醇提物也具有较高的
DPPH自由基和超氧阴离子自由基清除率和较
强的还原力[10-12]。对棘托竹荪的菌丝体和发酵
液的抑菌作用研究表明它们具有广谱的抗菌活
性[13,14],然而对于棘托竹荪的发酵菌丝体和发酵
液产物中含有物质的种类及这些物质是否具有
抗氧化活性目前尚未有深入的研究。
2,2-二 苯 基 苦 基 苯 肼 (2,2-diphenyl-1-
picrylhydrazyl,DPPH)是评价外源抗氧化剂和
植物抗氧化能力较为可行的方法[15]。因此,笔者
以芦丁和抗坏血酸作为对照品,以IC50值作为评
价指标,采用DPPH自由基法对棘托竹荪菌丝体
和发酵液的水提物及不同浓度乙醇提取物的体
外抗氧化活性进行测定和评价,并对不同提取物
进行了化学定性检验,旨在为棘托竹荪发酵产物
中抗氧化活性成分的研究与开发提供参考。
1 材料与方法
1.1材料
棘托竹荪(D.echinovolvata)ACCC 4912,
保藏于中国农业微生物保藏中心食用菌分中心。
1.2发酵培养
液体菌种制备:取母种菌块接种于PDA培
养基上,26℃避光培养待菌丝长满斜面后接种于
装有100mLPD培养基的250mL三角瓶中,摇
床培养(100r/min,26℃)14d,制得一级种子
液,然后将一级种子液按接种量10%接到新的
PD培养基中,在相同的培养条件下培养7d制备
二级种子液。
液体发酵:制备好的二级种子液,接种于装有
200mL发酵培养基(g/L:玉米粉30,葡萄糖20,
七水硫酸镁1.0,磷酸二氢钾2.0,维生素B10.01,
DOI:10.16488/j.cnki.1005-9873.2014.04.015
食 用 菌 学 报 第21卷
pH自然)的500mL三角瓶中,接种量10%,摇床
培养(100r/min,26℃)5d。发酵产物经过滤分
别得到菌丝体和发酵液,冷冻干燥,备用。
1.3样品的提取与制备
分别用95%的乙醇等体积常温(25℃)浸提棘
托竹荪的菌丝体和发酵液干物质(浸提的料液比
1∶3)24h,提取3次,合并上清,减压浓缩,挥干溶
剂,备用。将提取后的菌丝体和发酵液再依次用
60%乙醇和20%乙醇超声提取(KQ-600B型超声
清洗器,25℃,料液比1∶3,1h),提取2次,合并上
清,减压浓缩,挥干溶剂,备用。最后菌丝体和发酵
液样品用蒸馏水100℃提取1h,提取2次,合并提
取液,减压浓缩,挥干溶剂,备用。
1.4抗氧化活性实验
抗氧化活性以清除DPPH自由基能力表示,
参照陈丛瑾的方法[16]进行修改。称取各样品,用
95%乙醇配制成1.0mg/mL的样品溶液,分别取
1、2、5、10、15、20μL的样品溶液和30μLDPPH自
由基溶液(0.15mg/mL)于酶标条中,用95%乙醇
补至200μL,混匀,反应平衡后(95%乙醇提取样
品反应15min,其它样品反应60min)于517nm
处测吸光度,平行操作3次,以 Vc和的芦丁为
对照。
DPPH·清除率的计算公式如下:
清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%
式中,Ai为加样反应后 DPPH· 溶液吸
光度;
Aj为不加 DPPH·,只加样品溶液的吸
光度;
Ac为未加样品的DPPH·溶液吸光度
1.5化学成分定性检测
分别对棘托竹荪菌丝体和发酵液的各部分
提取物的化学成分进行定性检测。采用碘化铋
钾反应和硅钨酸反应检测生物碱、Fehling反应
检测糖类、茚三酮反应检测氨基酸和蛋白质、pH
试纸和溴酚蓝指示剂检测有机酸、三氯化铁实验
和香草醛酸性显色法检测酚类和鞣质、三氯化锑
反应和 Lieberman-Burchardfany 反应检测甾
体、三氯化铝荧光实验和氨熏实验检测黄酮体、
硼酸溶液和碱性反应实验检测蒽醌类等化合物,
具体方法参考文献[17]。
2 结果与分析
2.1棘托竹荪提取物的抗氧化活性
结果表明:在一定浓度范围内,DPPH自由
基清除率随着样品浓度增加而升高,样品浓度与
DPPH自由基清除率之间呈线性关系。线性方
程分别表示如下,菌丝体95%醇提物:y=15.8+
595.07x,R2=0.991;发酵液95%醇提物:y=
22.988+880.82x,R2=0.996;菌丝体60%醇提
物:y=25.397+1018.2x,R2=0.998;发酵液
60%醇提物:y=22.201+1617.2x,R2=0.992;
菌丝体20%醇提物:y=43.517+561.95x,R2=
0.975;发酵液20%醇提物:y=43.129+222.48x,
R2=0.994;菌丝体水提物:y=33.586+147.46x,
R2=0.997;发酵液水提物:y=39.047+217.68x,
R2=0.999。芦丁:y=21.862+906.92x,R2=
0.996;Vc:y=37.47+1639.9x,R2=0.997。
由各项方程分别计算得到各样品的IC50值,
结果见表1。由不同样品对DPPH自由基清除效
果的IC50值可知,各样品对DPPH自由基清除能
力从大到小依次为:维生素C>棘托竹荪菌丝体
20%醇提物>棘托竹荪发酵液60%醇提物>棘
托竹荪菌丝体60%醇提物>棘托竹荪发酵液
95%醇提物、棘托竹荪发酵液20%醇提物、芦丁
>棘托竹荪发酵液水提物>棘托竹荪菌丝体
95%醇提物>棘托竹荪菌丝体水提物。
2.2定性检测结果
对棘托竹荪菌丝体和发酵液的各部分提取
物进行化学定性检测,结果见表2。
表1 各样品溶液清除DPPH自由基的IC50值
Table 1 IC50values of different samples based on DPPH free radical-scavenging activity
菌丝体提取物
Mycelial extracts
发酵液提取物
Extracts of spentculture broth
1 2 3 4 1 2 3 4
维生素C
Vitamin
C
芦丁
Rutin
IC50值
IC50value
(mg/mL)
0.057 0.024 0.012 0.111 0.031 0.017 0.031 0.050 0.008 0.031
1:95%乙醇提取;2:60%乙醇提取;3:20%乙醇提取;4:蒸馏水提取
Extracts: 1:95%EtOH;2:60%EtOH;3:20%EtOH;4:dd H2O
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第4期 韩 乐,等:棘托竹荪液态深层发酵水提物和不同浓度乙醇提取物的抗氧化活性及化学成分分析
表2 定性检测结果
Table 2 Qualitative test data
检测物质
Compound type
试剂
Test reagent
菌丝体提取物
Mycelial extracts
1 2 3 4
发酵液提取物
Extracts of spentculture broth
1 2 3 4
生物碱
Alkaloid
碘化铋钾
Wagners reagent
+ - - - - - - -
硅钨酸
Tungstosilicic acid
- - + - - - + -
糖类
Disaccharides
费林
Fehlings solution
+ + + + + + + +
氨基酸、蛋白
Amino acids/protein
茚三酮
Ninhydrin
+ + + + + + + +
有机酸
Organic acids
溴酚蓝
Bromophenol blue
+ + + - + - - -
pH试纸
pH test strips
+ + + + + + + +
酚类化合物
和鞣质
Phenols and tannins
1%三氯化铁
Ferric trichloride(1%)
- - - - + - - -
香草醛-盐酸
Vanilin-hydrochloric acid
- - - - - - - -
甾体
(或三萜)
Steroids
(or terpenes)
三氯化锑
Antimonytrichloride
+ - - - + + + -
醋酐-浓硫酸
Acetic anhydride-
concentrated sulphuric acid
+ - - - + + + -
黄酮体
Flavonoids
1%三氯化铝
Alchlor(1%)
+ + + - + + + -
浓氨水
Ammonia
+ + + - + + - -
蒽醌
Anthraquinones
1%硼酸
Boric acid(1%)
+ + + - + + + +
10%氢氧化钾
KOH(10%)
+ + + - + + + -
1:95%乙醇提取;2:60%乙醇提取;3:20%乙醇提取;4:蒸馏水提取
Extracts:1:95%EtOH;2:60%EtOH;3:20%EtOH;4:dd H2O
从试验结果可以初步判断,蛋白、氨基酸类、
糖类物质、有机酸类、黄酮类化合物和蒽醌类化
合物可能存在于棘托竹荪发酵菌丝体的95%、
60%和20%乙醇提取物中,生物碱可能存在于棘
托竹荪发酵菌丝体的95%和20%乙醇提取物中,
甾体或三萜类化合物可能存在于棘托竹荪发酵
菌丝体的95%醇提物中。
棘托竹荪发酵液的不同浓度乙醇提取物中
同样可能存在蛋白、氨基酸类、糖类、有机酸类物
质,黄酮类化合物可能存在于棘托竹荪发酵液的
95%和60%乙醇提取物中,蒽醌类、甾体或三萜
类化合物可能存在于棘托竹荪发酵液的95%、
60%和20%乙醇提取物中,生物碱可能存在于
20%乙醇提取物中。
3 结论
通过对棘托竹荪发酵得到的菌丝体和发酵
液的不同提取物进行的抗氧化活性的测定和比
较可知,棘托竹荪菌丝体的20%、60%乙醇提取
液,发酵液的20%、60%和95%乙醇提取物均具
有较好的抗氧化能力,其清除DPPH自由基的能
力强于芦丁,尤其是棘托竹荪发酵菌丝体的20%
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食 用 菌 学 报 第21卷
乙醇提取物具有较强的清除 DPPH自由基的能
力(IC50为0.012mg/mL)。综合定性检测结果,
推测棘托竹荪提取物清除 DPPH自由基的作用
可能与棘托竹荪发酵菌丝体和发酵液中的糖类、
蒽醌类以及黄酮类化合物的存在有关,这有待进
一步实验验证。
棘托竹荪作为名贵菌种,其子实体已有人工
栽培,但其生产周期过长,产量较低,价格较为昂
贵,这样势必造成了开发利用成本过高[18],且棘
托竹荪子实体的生长受环境因素的影响较大,品
质较难掌控,不利于抗氧化产品的开发。而液体
发酵技术相比较而言,具有发酵速度快,生产周
期短、成本低的优势,且由于各个环节均人为可
控,所以产品品质稳定,重复性好。利用棘托竹
荪的发酵产物来进行抗氧化活性的验证,可以为
其在食品、医药、保健品或化妆品领域的天然抗
氧化产品的开发和应用提供实验依据。
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Major Chemical Components and Antioxidant Activity
of Aqueous and Ethanolic Extracts of Dictyophora
echinovolvata Mycelia and Spent Culture Broth
HAN Le 1,2,FENG Na 2,FENG Jie2,HAN Wei 1*,MA Di 1,2,ZHANG Jingsong2
[1School of Pharmacy,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China;
2Institute of Edible Fungi,Shanghai Academy of Agricultural Sciences,National Engineering Research Center
of Edible Fungi,Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization(South),Ministry of Agriculture,
P.R.China,Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai,Shanghai 201403,China]
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第4期 韩 乐,等:棘托竹荪液态深层发酵水提物和不同浓度乙醇提取物的抗氧化活性及化学成分分析
Abstract:Antioxidant activity of aqueous and ethanolic (20%,60% and 95%)extracts of Dictyophora
echinovolvata mycelium and spent culture broth was determined using the DPPH free radical-scavenging
assay.Mycelial extracts prepared with 20%and 60%EtOH,and material extracted from spent culture broth
using al three EtOH concentrations,exhibited higher antioxidant activity compared with rutin controls.
Highest overal antioxidant activity(IC50value=0.012mg/mL)was recorded with material extracted from
D.echinovolvata mycelium with 20%EtOH.Qualitative determination of the major chemical components of
each extract sample was carried out using Traditional Chinese Medicine experimental methods.Al the
extracts contained sugars,organic acids,amino acids and protein,but there was considerable variation in the
flavonoid,alkaloid,anthraquinone and steroid distribution patterns.
Key words:Dictyophora echinovolvata;fungal mycelia;spent culture broth;DPPH free radical-scavenging
activity;antioxidant activity;chemical composition
[本文编辑] 朱丽娜
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