全 文 ：第 29卷 第 1期
2008年 1月 　　　　　　　　　　
华南农业大学学报
JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity　　 　　　　　　　　
Vol.29, No.1
Jan.2008
　收稿日期:2007-05-01
　作者简介:张松柏(1980—), 男, 助理研究员 ,硕士;　通讯作者:李华平(1961—)男 ,教授 ,博士 , E-mail:huaping@scau.edu.cn
　基金项目:国家自然科学基金(30370929);广东省自然科学基金(C036845)
水稻橙叶病 PCR检测体系的建立
张松柏 1, 2 ,罗香文 1 ,李华平 2
(1湖南省农业科学院 植物保护研究所 , 湖南 长沙 410115;2华南农业大学 植物病毒研究室 , 广东 广州 510642)
摘要:利用植原体通用引物 sP1和 sP2, 采用 PCR法从发病的水稻植株中扩增植原体一段保守的 16SrRNA基因的
核苷酸序列.结果表明 ,从发病的水稻植株中都能够稳定扩增得到 1条 558 bp的特异性条带.对该条带进行克隆
和序列分析表明 , 该片段和 Genbank中公布的众多植原体的相应区域的核苷酸序列相似性都高达 95%以上 , 表明
利用植原体通用引物能有效扩增得到水稻橙叶病原的序列.利用此引物并优化 PCR反应条件 , 建立了水稻橙叶病
的 PCR检测方法.该方法对检测水稻橙叶病具有特异 、灵敏和有效性.应用该检测体系检测从广东信宜 、高州和
从化采集的多份疑似标样 ,结果表明 , 在这几个地区均有水稻橙叶病的发生和危害.
关键词:水稻;橙叶病;PCR检测
中图分类号:S432.41　　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-411X(2008)01-0028-04
TheEstablishmentofPCRDetectionSystemofRiceOrangeLeafDisease
ZHANGSong-bai1, 2 , LUOXiang-wen1 , LIHua-ping2
(1 InstituteofPlantProtection, HunanAcademyofAgricultureSciences, Changsha410115, China;
2LabofPlantVirology, SouthChinaAgriculturalUniversity, Guangzhou510642, China)
Abstract:Itisoneoftheimportantcontrolstrategiesofriceorangeleafdiseasebydevelopmentofarapid
diseasedetectiontechnique.ConservedgeneralprimerpairssP1 andsP2 forphytoplasmaweresynthe-
sized, andthe558 bpsegmentofthephytoplasma16SrRNAgenewasspecificalyamplifiedbyPCR.
ThesequencingresultsofthesegmentshowedthatthenucleotideacidsequenceofthisPCRproduct
sharedabove95% identicalwiththecorrespondingsegmentofotherkindsofphytoplasmainGenbank,
whichtestifiedthatthePCRproductwasfromthepathogenofriceorangeleafdisease.ThePCRdetec-
tionsystemwasestablishedbyoptimizingtheparametersofPCRreactionsystemandfoundthatthissys-
temcouldefectively, sensitively, andaccuratelydetectedthedisease.Theseveralsamplesfromthedif-
ferentlocationsofXinyi, GaozhouandConghuainGuangdongProvinceweredetectedbythePCRsys-
tem, andtheresultsrevealedriceleafdiseaseexistedintheselocations.
Keywords:rice;orangeleafdisease;PCRdetection
　　水稻橙叶病于 1960年在泰国首次发现 ,随后在
菲律宾 、印度 、马来西亚等东南亚国家也有零星发
生 ,并于 1976年证实其病原为植原体 (phytoplas-
ma)[ 1] .在我国首次报道该病发生于云南稻区 [ 2] .
20世纪 90年代 ,该病在广东省部分稻区严重发生 ,
曾给当地水稻生产带来严重损失[ 3-4] .近几年来 ,该
病在广东省茂名和广西部分稻区仍然频繁暴发 ,成
为了阻碍当地水稻生产重要的限制因子.水稻植原
体病害除水稻橙叶病外 ,在国外还发现有水稻黄萎
病的报道[ 5] .二者在危害水稻症状 、传毒介体等方
面具有明显的不同[ 4] , 在我国迄今鲜见水稻黄萎病
的报道.植原体病害主要通过无性繁殖材料 、种苗或
昆虫介体传播 ,很少或不能通过种子传播 ,而带病种
苗可以非常有效地通过高温或抗菌素处理而脱掉病
原 [ 6-7] ,故带毒植物的早期诊断是防治植原体病害的
关键.但由于植原体既不象真菌 、细菌那样容易培
养 ,也不象病毒那样易于提纯 ,因而植原体自发现后
的几十年里 ,其检测技术的发展一直没有大的突破.
在确定一种植物病害是否由植原体引起时 ,一般先
根据病害症状初步推测 ,然后对植物注射或喷洒植
原体敏感的四环素类物质 ,若症状受到抑制 ,就说明
其病原物可能是植原体 ,最后通过电子显微镜观察
加以确定[ 2, 7] .近 10多年来 ,血清学和以 DNA为基
础的分子生物学技术用来鉴定和区分植原体 ,才使
得植原体的鉴定研究有了较快的发展.植原体 16S
rRNA基因序列同源性分析是目前国际上植原体分
类鉴定的最重要的方法之一 ,目前大多数植原体的
鉴定通过植原体 16SrRNA、23SrRNA和 16S～ 23S
rRNA间隔区等保守的 DNA序列进行分子生物学检
测和鉴定[ 7-8] .水稻橙叶病的分子生物学检测方法
至今鲜见报道.就水稻橙叶病而言 ,病害防治的关键
时期 ,主要是在水稻秧苗期发现病害后 ,及早拔除病
株 、并喷施化学农药用以杀灭传毒昆虫介体 ,从而杜
绝或减少病害的发生 [ 3-4] .本文利用 PCR方法建立
了水稻橙叶病的分子生物学检测方法 ,这为生产中水
稻早期快速检测该病害发生 ,从而采取相应防治措施
用以控制该病害的发生和危害奠定了基础.
1　材料与方法
1.1　植物材料
水稻疑似病株分别采集于广东省茂名市信宜的
水稻品种博优 3550和从化 、高州的水稻品种博优
3550、博优 903.采集的标样种植于华南农业大学植
物病毒研究室的防虫网室和直接保存于 -70 ℃冰箱
待用.
1.2　菌种
EscherichiacoliJM109菌株为华南农业大学植物
病毒研究室保存.pMD18-T载体购自 TaKaRa生物
有限公司.
1.3　引物的设计
根据 Ahrens等[ 9]报道的植原体 16SrRNA基因
的一段保守序列 ,合成了引物对 sP1和 sP2 ,引物对由
上海生工生物工程有限公司合成.扩增片断约 558
bp,引物序列分别为:
sP1:5′-ACGAAAGCGTGGGGAGCAAA-3′,
sP2:5′-GAAGTCGAGTTGCAGACTT-3′.
1.4　水稻组织 DNA的抽提
为了从发病水稻组织中抽提获得较好的 DNA
用作 PCR扩增的模板 ,本文对报道的几种抽提方法
进行了试验比较.这些方法包括:方法 I(w=0.5%
的 SDS)[ 8] 、方法 I(w=1.5%的 SDS)[ 9] 、方法 II(w
=1.0%的 CTAB)[ 10] 、方法 IV(w=2.0%的
CTAB)[ 11]和方法 V(简易法)[ 12] .将抽提的 DNA经
DUR-640型紫外分析仪测定和通过 8 g/L琼脂糖
凝胶电泳分析进行比较.
1.5　PCR检测体系的建立
PCR反应体系为:1 ×reactionbufer、 2 mmol/L
Mg2 +、100 μmol/LdNTPs、5 μmol/L上下游引物 、
0.25μLTaq酶 、1μLDNA模板 ,总体积 20μL.PCR
扩增参数为:94℃预变性 2min、30个循环包括 94 ℃
变性 1 min、 50 ℃退火 0.5 min、72 ℃延伸 1 min,循
环结束后 72 ℃延伸 10min.反应结束后 ,取 PCR扩
增产物 10μL与 2μL6×载样缓冲液(w=0.25%的
溴酚兰 , w=40%的蔗糖)混匀 , DNAmarkerDL2000,
10g/L的琼脂糖(含 0.5 μg/mL溴化乙锭)于 0.5×
TBE缓冲液(45 mmol/LTris-硼酸 , 1.0mmol/LED-
TA, pH8.0)在 5 V/cm电场强度下电泳约 1 h, 用
UVP凝胶成像系统观察和照相.
1.6　PCR产物序列的测定
用 PCR产物回收试剂盒(华美生物工程公司)
回收 558 bp的目的 DNA,具体步骤参照试剂盒说
明;采用常规克隆方法将扩增片段克隆入 pMD18-T
载体 ,转化 E.coli,阳性克隆抽提质粒后 ,送大连宝
生物(华运)工程公司完成核苷酸序列测定.
1.7　PCR产物 DNA序列同源性比较
DNA序列同源性比较通过国际互联网在美国国
家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnolo-
gyInformation, NCBI)网站 (htp://www.ncbi.nlm.
nih.gov/)上进行分析.
2　结果与分析
2.1　PCR检测方法的建立
2.1.1　水稻 DNA抽提方法的比较分析　为了获得
最简便和有效的方法抽提水稻 DNA,比较了简易法 、
1.0%CTAB、2.0%CTAB、0.5%SDS、1.5%SDS5种
方法抽提水稻基因组 DNA的效果.抽提的 DNA经
DUR-640型紫外分析仪测定及通过 8 g/L琼脂糖
凝胶电泳分析比较 , 结果表明 (表 1):2.0%CTAB
法 、1.0%CTAB法 、简易法均有较高的 DNA产率 ,其
中 1.0%CTAB法取得的核酸的纯度最高 ,但其总核
酸量少于 2.0%CTAB法;而 0.5%SDS法 、1.5%SDS
法抽提的总核酸量明显要比其他 3种方法抽提的量
要少得多 ,只有上述 3种方法的 1 /8 ～ 1/4,而且得到
的总核酸的纯度也相对要低得多.简易法抽提的总
核酸纯度及产率都不及 1.0%CTAB法和 2.0%
CTAB法 ,但其试验步骤简单 ,花费时间少 、节约试验
材料.鉴于 2.0%CTAB法有最高的 DNA产率和较
高的纯度 ,因此本文随后所作试验的 DNA抽提均采
用 2.0%CTAB法进行.
2.1.2　PCR体系优化及 PCR的灵敏度　以 sP1、
sP2为引物 、以病株所抽提的总核酸为模板 ,通过改
变 PCR反应体系中某一组分的量 ,对各组分用量及
29　第 1期 　　　　　张松柏等:水稻橙叶病 PCR检测体系的建立 　　　
表 1　几种 DNA抽提方法提取水稻总 DNA效果比较 1)
Tab.1　ComparisonoftheeffectsextractingDNAonricetissueswithdiferentextractionmethods
项目 item 1.0%CTAB 2.0%CTAB 0.5%SDS 1.5%SDS 简易法simplemethods
D260nm/D280nm 2.208±0.116 2.072±0.121 1.807±0.203 1.356±0.227 2.012±0.152
ρDNA/(ng·μL-1) 84.700±24.841 93.500±29.726 14.900±8.033 14.100±3.943 44.400±13.164
　1)10次重复的平均值 ±标准误
退火温度和反应条件进行了优化.在试验过程中发
现 ,在相当宽松的条件下 ,都能够得到准确的扩增结
果.但当退火温度大于 60 ℃时却得不到扩增的结
果;PCR反应对 DNA的纯度要求不是很高 ,只要不
含有太多的抑制物质 (例如:多糖 、酚类以及蛋白
质), DNA的量在 50 ～ 500 ng范围内不会影响扩增
结果;每个反应 Taq酶用量约为 1 ～ 2U,引物有效的
浓度范围为 0.05 ～ 2.00μmol/L, Mg2+的浓度按照常
规的用量为 1.5 ～ 2.0 mmol/L, dNTPs的用量在 100
～ 200 μmol/L范围内效果较好.
取显症的水稻叶片 200 mg抽提总 DNA溶于
100μLTE中 ,抽提液用双蒸水 10倍系列稀释后进
行 PCR扩增 ,电泳结果 (图 1)表明:DNA抽提液在
稀释 10-6后仍能扩增出 588 bp的特异条带 ,即 PCR
法能够检出相当于 50 ng病叶中的植原体.
1:DNAmarkerDL2000;2:清水对照;3 ～ 9:病株总 DNA稀释梯度
(10-1 ～ 10-7)
1:DNAmarkerDL2000;2:watercontrol;3-9:dilutiondensityoftotal
DNAsfromdiseasedplant(10-1 -10-7)
图 1　水稻橙叶病株的 PCR扩增体系的灵敏度分析
Fig.1　AnalysisofsensitivityinPCRamplificationsystemforde-
tectionofricediseasedleaves
2.1.3　PCR法检测水稻不同部位　利用显症的水
稻不同组织部位进行检测时发现 , PCR法能够有效
地对水稻的根 、茎 、叶进行检测而得到特异扩增产
物 ,而健康水稻组织对照未得到目的条带(图 2).
2.1.4　引物的特异性　利用引物对 sP1、sP2电泳 ,
结果(图 1、2)表明 ,得到 558 bp的目的片断 ,而清水
与健康水稻样品对照未出现条带 ,说明此引物具有
较高的特异性.将此 PCR扩增片断进行克隆和测
序 ,结果表明该片断与 Genbank中报道的众多植原
体的 16SrRNA基因的相应序列的相似率达到 95%
1:DNAmarkerDL2000;2、 3:根;4、5:茎;6～ 8:叶;9:健康植株对照
1:DNAmarkerDL2000;2, 3:root;4, 5:stem;6-8:leaf;9:healthycon-
trol
图 2　PCR检测发病水稻植株不同部位的电泳分析
Fig.2　PCRdetectionanalysisofdiferentricetissuesofdis-
easedplants
以上(数据未显示).这揭示扩增的 558bp片断是对发
生于水稻中的植原体(水稻橙叶病原)的专化性扩增.
2.2　检测方法的应用
用上述建立的 PCR鉴定体系 ,对分别采自广东
省茂名市的信宜 、高州 、和广州从化的标样进行 PCR
检测.结果(图 3、4)表明:从来自信宜和高州的 13
1、 10:DNAmarkerDL2000;2～ 7、12 ～ 18:标样;8、 11:清水对照;9:健
康对照
1, 10:DNAmarkerDL2000;2-7, 12-18:samples;8, 11:watercontrol;
9:healthycontrol
图 3　PCR检测采集于信宜和高州标样的电泳分析
Fig.3　PCRdetectionanalysisofricesamplesfromXinyiand
Gaozhou
30 　　 华　南　农　业　大　学　学　报　　　 第 29卷　
1、 10:DNAmarkerDL2000;2 ～ 8、11～ 18:标样;9:健康对照
1, 10:DNAmarkerDL2000;2-8, 11-18:samples;9:healthycontrol
图 4　PCR检测采集于从化标样的电泳分析
Fig.4　PCRdetectionanalysisofricesamplesfromConghua
个具有疑似症状的标样中 ,发现有 9个标样能扩增
出目的片段;在从化的 15个样品中 ,有 9个样品扩
增出目的条带.这说明该分子检测方法可以有效地
检测出该病害 ,同时也说明在这些地区存在该病害
危害.
3　讨论与结论
水稻橙叶病是导致水稻部分产区严重经济损失
的病害之一 ,近年来 ,在东南亚和我国的华南一带均
有发生 ,且有逐渐扩大蔓延的趋势 [ 1-4] .目前国内外
关于该病害的分子生物学方面的研究报道还很少 ,
也鲜见关于该病害的分子生物学检测的报道.目前
该病害的检测方法还是依赖于症状观察 ,再进行超
薄切片和电镜观察予以证实.这些方法不但繁琐 、不
可靠 ,而且更重要的是耗时较长 ,难于在较短时间内
对疑似标样进行快速和准确检测.而控制该病害的
关键在于尽早发现病害 ,即在病害发生早期和病害
尚未通过虫媒大面积传播早期 ,及时拔除病株 ,并喷
洒杀虫剂消灭和控制传毒虫媒的数量[ 3-4] .因此建
立快速 、可靠和有效的检测方法是当前防治该病害
的当务之急.
本研究采用 PCR方法 ,建立了水稻橙叶病的一
套分子生物学检测方法和技术.该方法从病样 DNA
抽提 、PCR扩增体系和反应程序等各方面都进行了
优化 ,发现任何显症的水稻病样都能扩增出特异条
带 ,并且能够从发病植株的叶 、茎和根等不同部位均
能检测 ,多次检测的结果一致 ,其检测所需的材料量
仅相当于 50 ng病叶 ,这表明本试验建立的 PCR检
测法特异性和稳定性强 、检测灵敏度高.该方法的建
立为水稻橙叶病发病早期鉴定病害 、进而采取有效
防治措施控制病害的传播和危害奠定了重要基础.
长期以来根据水稻橙叶病田间发病症状 、四环
素对病株具有一定延缓死亡的特征 、以及组织切片
的电镜观察 ,人们一致认为该病仅在广东省茂名地
区(包括信宜 、高州)的稻区发生 ,而且主要集中在粤
西信宜市稻区[ 3] .通过本研究建立的方法检测来源
于信宜 、高州和粤中地区的从化市稻区的疑似病株 ,
结果发现不仅在信宜和高州存在该病害 ,而且在从
未报道的粤中从化稻区也发现了该病害.这表明病
害正在向粤中和粤东等地区蔓延 ,更大规模和范围
的病害检测和普查工作急待进行 ,并需在此基础上
采取相应防控措施 ,以阻止病害造成更大的危害.
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【责任编辑　周志红】
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