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大樱桃根癌病原细菌分类地位鉴定



全 文 :第 10 期
第 48 卷第 10期
2009 年 10月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol. 48 No.10
Oct.,2009
收稿日期:2009-07-21
基金项目:山东省科技攻关项目(No.2008GG10009028);烟台市科技攻关项目(No.2007321)
作者简介:刘保友(1981-),男,山东成武人,农艺师,主要从事植物病理学研究,(电话)13697634296(电子信箱)lbaoyou@yahoo.com.cn。
大樱桃具有较高的营养价值,口味鲜美,经济
效益显著。 在烟台市的种植面积不断增加,当前大
樱桃栽培面积达 2 万多公顷, 总产量达到 20 万 t,
均占全国的 50%以上。 在种植规模不断扩大的过程
中也出现了诸多棘手问题。 经 2007~2008年连续两
年调查,明确根癌病为目前大樱桃生产中面临的主
要生产障碍之一,并有逐渐加重的趋势,可造成树
势衰弱,降低了果品的产量和质量,个别果园病株
率可达 90%以上,给果农造成了巨大的经济损失。
根 癌 病 是 由 根 癌 土 壤 杆 菌 (Agrobacterium
tumefaciens)引起的细菌性病害。病原菌寄主范围广
泛,可侵染 640 余种高等植物,世界均有发生[1]。 在
我国,葡萄、苹果、梨树、大樱桃等主栽果树均有根
癌病的严重发生。 但不同寄主上的病菌类型有所不
同,存在较大的异质性。 目前国内针对大樱桃根癌
病的研究多集中于砧木、防治等方面 [2,3],尚未见对
大樱桃根癌病原菌分类地位的研究报道。 本研究旨
在明确大樱桃根癌病原菌的分类地位,可为大樱桃
根癌病的深入研究和防治奠定一定的理论基础。
1 方法
1.1 病原菌分离
用解剖刀把新鲜根癌病组织切成小块,将小块
放于 10%漂白粉溶液消毒 5 min 后, 灭菌水清洗 3
次。 将经上述处理的病组织小块放入研钵内,加入
适量灭菌水研碎后静置 5 min。 用接种环蘸取上清
液,在 LB培养基上划线分离。
1.2 致病性测定
以种植 45 d 的鲁番茄 7 号植株作为室内接种
实验寄主,酒精表面消毒,将 1×108Cfu / mL 细菌悬
大樱桃根癌病原细菌分类地位鉴定
刘保友,张 伟,栾炳辉,宫海鹏,盖中帅
(山东省烟台市农业科学研究院,山东 烟台 265500)
摘要:从烟台地区采集 13 份大樱桃根癌病样本,分离纯化出 26 个菌株,致病性测定表明 23 个菌株在指
示寄主番茄上具有致病性;进一步经生理生化反应、碳源利用、选择性培养基等试验鉴定出 16 个根癌病
菌菌株为 Agrobacterium tumefaciens 生物型 2,占 69.57%,为优势种群,其余 7 个菌株为生物型 1。 对大
樱桃根癌病菌分类地位的确定为今后病原菌的系统研究和病害防治提供了理论基础。
关键词:大樱桃;根癌;病原细菌;分类地位;鉴定
中图分类号:S432.4+2 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2009)10-2437-03
Taxonomic Status Study of Agrobacterium tumefaciens Isolated from Sweet Cherry
LIU Bao-you,ZHANG Wei, LUAN Bing-hui,GONG Hai-peng,GAI Zhong-shuai
(Yantai Agricultural Sci & Tech Institute, Yantai 265500, Shandong, China)
Abstract:26 strains was obtained from 13 samples of crown gall on sweet cherry in Yantai. 23 strains could form crown gall
tomato.These strains were identified further based on reactions to standard biochemical and physiological tests, by carbon
utilization and by selective media for identification. Among 23 strain, 16 strains were Agrobacterium tumefaciens biotype 2,
which made 69.57% of total amount. The other 7 strains were A. tumefaciens biotype 1. The result indicated that the
dominant biotype of A. tumefaciens was biotype 2 in Yantai. The establishment of A. tumefaciens causing crown gall disease
of sweet cherry laid the foundations for systematic study on pathogenic A. tumefaciens and disease control.
Key words:sweet cherry;crown gall;pathogenic bacteria;taxonomic status;identification
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2009.10.044
湖 北 农 业 科 学 2009 年
浮液接种于创伤处,用带水棉球保湿 48 h,待发病
时检查结果。
1.3 生理生化反应
1.3.1 生长温度实验 把分离的细菌菌株接种于
LB 液体培养基中,然后置于 37℃培养箱中培养,48
h检查细菌是否繁殖生长。
1.3.2 耐盐性实验 把细菌菌株接种于含有 2%
NaCl 的 LB 液体培养基中, 放于 28℃培养箱中培
养,48 h检查细菌是否繁殖生长。
1.3.3 3-酮基乳糖实验 将细菌菌株接种培养基
(1 L 培养基中含有酵母膏 1 g,乳糖 10 g,琼脂粉 12
g)平板上,28℃培养 48 h,向培养基中注入 Benedict
试剂 (将 173 g 柠檬酸钠和 100 g 无水 CaCO3溶于
600 mL水中,过滤并加水至 850 mL;另将 17.3 g Cu-
SO4溶于 100 mL 蒸馏水中,并加水到 150 mL,将硫
酸铜溶液缓缓加入到前一溶液中去,边加边搅拌),
室温放置 0.5 h 以上。 菌落周围产生黄色物质即为
阳性反应。
1.4 碳源利用实验
1.4.1 Ayers 基础培养基组分 (NH4)2SO4 2.0 g,
MgSO4·7H2O 0.2 g,NaH2PO4·H2O 0.5 g,CaCl2·2H2O
0.1 g,K2HPO4 0.5 g,蒸馏水 1 000 mL。
1.4.2 碳源利用实验 在 Ayers 培养基中加 1%的
蔗糖、乙醇,接菌培养。
1.5 选择性培养基实验
1.5.1 培养基种类 ①Schroth 培养基组分 [4]:甘露
醇 10.0 g,MgCl2·6H2O 2.0 g,MgHPO4·3H2O 0.2 g,
NaHCO3 0.075 g,NaNO3 4.0 g, 丙 酸 钙 1.2 g,
MgSO4·7H2O 0.1 g,MgCO3 0.075 g, 琼脂粉 12.0 g,
蒸馏水1 000 mL,调 pH值为 7.1;②Kerr & Brisbane
培养基组分[5]:L(-)阿拉伯醇 3.04 g,NH4NO3 0.16 g,
KH2PO4 0.54 g,K2HPO4 1.04 g,MgSO4·7H2O 0.25 g,
牛磺胆酸钠 0.29 g,1%结晶紫水溶液 2 mL,琼脂粉
12.0 g,蒸馏水 1 000 mL。 倒平板前,每 100 mL培养
基中加入 2%放线菌酮水溶液 1 mL,1%亚硒酸钠 1
mL。 ③Roy & Sasser 培养基组分 [6]:MgSO4 0.2 g,
K2HPO4 0.9 g,KH2PO4 0.7 g,核糖醇 4.0 g,酵母提取
物 0.14g,NaCl 0.2 g, 硼酸 1.0 g, 琼脂粉 12.0 g,调
pH值为 7.2。
1.5.2 选择培养 将细菌菌株接种在 Schroth 培养
基、Kerr & Brisbane 培养基和 Roy & Sasser 培养
基上,检查细菌生长情况。
2 结果
从烟台各县市区共采集大樱桃根癌样本 13
份,经典型培养性状观察,分离纯化菌株 26 个(表
1), 以生防菌 K84 和葡萄根癌菌株作为对照菌株,
这 28 株细菌在 LB 培养基上均形成具有光泽、稍隆
起、边缘完整、半透明、呈乳白色的粘稠圆形菌落。
经指示植物番茄的致病性试验(图 1),筛选出 23 株
大樱桃根癌病菌、1 株葡萄根癌菌株具有致病性,
K84 无致病性(表 2),进一步采用区分标准对 23 株
表 1 大樱桃根癌病原菌菌株样本情况
序号
1
2
3
4
5
6
7
作物
大樱桃
大樱桃
大樱桃
大樱桃
大樱桃
大樱桃
葡萄
品种
美早
红灯
8-102
美早
岱红
萨米托
红提
样数
1
2
2
3
3
2
1
菌株数
3
5
3
5
7
3
1
采集时间//年-月-日
2007-05-18
2007-05-18
2007-11-19
2007-11-19
2007-11-21
2007-11-21
2007-08-24
菌株编号
YTGA-04~06
YTGA-07~11
YTGA-12~14
YTGA-15~19
YTGA-24~30
YTGA-33~35
PTGA-02
菌株来源
福山东关村
福山青龙山南
烟台市牟平区观水镇
莱阳市大樱桃砧木实验基地
蓬莱市北沟镇
蓬莱市北沟镇
龙口前妙果
大樱桃根癌病菌菌株进行了系统鉴定。
A. tumefaciens 的 3 个生物型均不可在 37℃环
境中生长; 生物型 1和 3均可在含有 2%NaCl 的培
养基上生长;生物型 1在 3-酮基乳糖实验中表现为
阳性;生物型 1 可利用蔗糖和乙醇,生物型 3 只可
利用蔗糖,而生物型 2 不可利用蔗糖和乙醇;生物
型 1、2 和 3 分别在 Schroth 培养基 、Kerry & Bris-
bane培养基和 Roy & Sasser 培养基上生长,根据以
上生物型区分标准进行试验,结果表明,大樱桃根
癌病菌 23 个菌株中有 16 个菌株属于 A. tumefa-
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第 10 期
表 2 大樱桃根癌病菌分类地位鉴定结果
菌株编号
YTGA-04
YTGA-05
YTGA-06
YTGA-07
YTGA-09
YTGA-10
YTGA-11
YTGA-12
YTGA-13
YTGA-14
YTGA-15
YTGA-16
YTGA-17
YTGA-18
YTGA-19
YTGA-24
YTGA-26
YTGA-28
YTGA-29
YTGA-30
YTGA-33
YTGA-34
YTGA-35
PTGA-02
K84
37℃生长

























2%NaCl 生长

























3-酮基乳糖

























蔗糖

























乙醇

























Schroth 培养基

























Kerr&Brisbane 培养基

























Roy&Sasser 培养基

























致病性测定

























生理生化反应 碳源利用 选择性培养基
注:“+”表示阳性,“-”表示阴性。
ciens 生物型 2,7 株属于 A. tumefaciens 生物型 1;
葡萄根癌病菌属于 A. tumefaciens 生物型 3;K84 属
于 A. tumefaciens 生物型 2。
3 结论
根癌病是一种危害性极大的世界性细菌病害。
本研究从烟台各县市区采集根癌病样本,通过培养
形态观察和致病性测定实验, 筛选出 23 个典型的
大樱桃根癌菌株以供确定其分类地位,经生理生化
反应、碳源利用、选择性培养基筛选等试验测定,对
比《伯杰细菌鉴定手册》土壤杆菌菌种的鉴定手册[7]
和选择性培养基[4-6]的鉴定标准,引起大樱桃根癌病
菌的 16 个菌株确定为 A. tumefaciens 生物型 2,占
69.6%,为优势种群,其余 7个菌株为生物型 1。大樱
桃根癌病菌分类地位的确定可为今后病原菌的深
入研究和有针对性地防治提供一定的理论基础。
参考文献:
[1] CLARE B G,KERR A,JONES D A. Characteristics of the
nopaline catabolic plasmid in Agrobacterium strains K84 and
K1026 used for biological control of crown gall disease [J].
Plasmid, 1990,23:126-137.
[2] 侯纪展 ,王钦伦 ,田宝江 ,等 .大樱桃根癌病的发生与防治试
验[J]. 果农之友,2006(5):11-20.
[3] 赵玉辉 ,周 宇 ,张开春 ,等 .樱桃砧木根癌病敏感性评价方
法[J].沈阳农业大学学报, 2005,36(5):609-611.
[4] SCHROTH M N,THOMPSON J P,HILDEBRAND D C. Isola-
tion of the Agrobacterium tumefaciens -A. radiobacter group
from soil[J]. Phytopathology,1965,55:645-647.
[5] NEW P B,KERR A. A selective medium for Agrobacterium
radiobacter biotype 2 [J]. Journal of Applied Bacteriology,
1971,34(1):233-236.
[6] ROY M A, SASSER M. A selective medium for Agrobacteri-
um tumefaciens biotype 3[J]. Phytopathology,1983,73:810.
[7] 布坎南 R E,吉本斯 N E. 伯杰细菌鉴定手册 [M].第八版 .北
京:科学出版社,1984.340-348.
(责任编辑 王贵春)
刘保友等:大樱桃根癌病原细菌分类地位鉴定 2439