全 文 ：第 33卷第 1期
2010年 2月
云南中医学院学报
JournalofYunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine
Vol.33No.1
2.2010
紫外可见分光光度法测定山珠半夏中总游离氨基酸的含量＊
曹玮娟 , 杨竹雅 , 梁晓原■
(云南中医学院 , 云南昆明　650500)
[摘　要 ] 目的:建立用紫外可见分光光度法测定山珠半夏中总游离氨基酸的含量。方法:山珠半夏药材粉
碎后 , 采用适当的方法前处理 , 以茚三酮为显色剂 , 以缬氨酸为对照品 , 采用紫外可见分光光度法 , 测定山珠
半夏中总游离氨基酸含量的方法。结果:在线性范围内 , 线性关系良好 , 方法稳定好 , 回收率高。结论:此方
法简便 、 稳定 , 结果可靠。
[关键词 ] 山珠半夏;总游离氨基酸;紫外可见分光光度法
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1000— 2723(2010)01— 0041— 05
山珠半夏为天南星科植物山珠半夏 Arisaema
yunnanenseBuchet的干燥块茎 , 商品名称为 “山珠
半夏 ”, 云南地区常用作 “半夏 ” 入药 , 为云南省
大宗药材之一 。其味辛 、性温 , 有毒;具有燥湿化
痰 、 消痞散结 、 止咳 、 降逆止呕的功效[ 1] 。山珠
半夏商品药材繁杂 , 各地用药情况比较混乱 , 为保
证用药安全有效 , 其质量控制就尤显重要 。除
《云南省药品标准 》 (1974版)对此药作了性状鉴
别类规定外 , 此后的各版云南省药品标准中均未对
此药收载 。 《中国药典》 (2005版)对半夏中所含
的精氨酸 、丙氨酸 、缬氨酸 、亮氨酸要求采用薄层
色谱法对其作出定性检测 [ 2] 。山珠半夏与半夏植
物来源相近 、 功用相似 , 故氨基酸对于山珠半夏的
质量控制有重要意义。笔者选用总游离氨基酸提取
量为评价指标 , 利用正交设计筛选最优醇提取方
法 , 采用紫外可见分光光度法对其含量进行测定 ,
可为山珠半夏的质量控制及充分开发利用提供参考
依据 。
1　仪器 、 试剂和材料
1.1　实验仪器及试剂
实验仪器:回流装置 , UV-2450型紫外可见
分光光度仪 (日本岛津), PercisaSX125A型电子
天平 (瑞士产)。试剂:95%乙醇 , 茚三酮 , 磷酸
二氢钾 , 氢氧化钠 (均为分析纯), 蒸馏水。标准
品:缬氨酸购于中国药品生物制品鉴定所 (批号:
140681-200401)。
1.2　实验材料
山珠半夏药材:购于昆明市菊花村药材市场 。
该药材经云南中医学院杨树德副教授鉴定为天南星
科山珠半夏 ArisaemayunnanenseBuchet的块茎。
2　试验方法及结果
2.1　溶液的配制
2.1.1　茚三酮溶液的配制
称取茚三酮 1.00g, 加乙醇使溶解成 50mL,
即得 2%茚三酮溶液 。
2.1.2　磷酸盐缓冲液的配制
取 0.2mol/L磷酸二 氢钾溶液 250mL, 加
0.2mol/L氢氧化钠溶液 118mL, 用蒸馏水稀释至
1 000mL, 摇匀 , 即得 , pH值为 6.80。
2.1.3　缬氨酸对照品溶液的制备
精密称取缬氨酸对照品 43.5mg, 用蒸馏水溶
解 、定容至 50mL, 即得 0.87mg/mL缬氨酸对照品
溶液。
2.2　供试品溶液的制备
山珠半夏总游离氨基酸的提取采用乙醇回流提
取 , 对料液比 、 乙醇浓度 , 提取时间 , 提取温度进
行单因素试验 , 并对单因素筛选出的较优条件 , 进
行四因素三水平的正交实验。每次实验将精密称取
41
＊收稿日期:2009— 11— 03　　修回日期:2010— 01— 04
作者简介:曹玮娟 (1981 ～ ), 女 , 重庆人 , 云南中医学院 2007级硕士研究生 , 主要从事天然药物质量控制研究的工
作。 ■通讯作者:梁晓原 , E-mail:liangxiaoyuan169@163.com
2010年 云南中医学院学报 第 33卷
3g药材 , 按照实验设计的条件进行回流提取 , 合
并提取液 , 回收溶剂至无醇味 , 用蒸馏水定容至
50mL, 量取 5mL溶液过 0.45μm微孔滤膜 , 将滤
液定容至 25mL, 待测。
2.3　测定吸收波长的确定
精密量取 1mL缬氨酸对照品溶液置于 10mL容
量瓶中 , 加蒸馏水定容至刻度 , 摇匀。取 1mL稀
释后的对照品溶液 , 1mL供试品溶液分别置于试管
中 , 另随行空白一份 , 分别加入 0.5mL茚三酮溶
液 , 1mL磷酸缓冲溶液 , 摇匀 , 置于沸水浴中加热
15min, 取出置于室温中冷却 15min, 加蒸馏水稀
释至 25mL, 摇匀 , 显色。结果显示对照品在
569nm处有最大吸收 (图 1), 而供试品溶液在
568nm处有最大吸收 (图 2), 故选择 568nm为本
实验的测定波长。
2.4　标准曲线的绘制
精密吸取上述缬氨酸对照品母液 0.7mL,
0.9mL, 1.1mL, 1.3mL, 1.5mL, 1.7mL分别置于
10mL容量瓶中 , 用蒸馏水稀释至刻度。分别量取
上述溶液 1mL, 按 “2.3测定吸收波长的确定” 项
下的方法显色 , 在 568nm处测定吸收度 。以缬氨
酸浓度 (mg/L)为横坐标 , 吸收度为纵坐标 , 绘
制标 准曲线 。回归方程为:Y=0.10999X+
0.02875, r=0.99942。表明缬氨酸在 2.436 ～
5.916mg/L范围内 , 呈良好的线性关系 。
2.5　样品前处理工艺
2.5.1　山珠半夏醇提工艺单因素筛选
2.5.1.1　料液比的影响
精密称取 3g药材 5份 , 置于圆底烧瓶中 , 分
别加入 70%乙醇 15mL, 30mL, 45mL, 60mL,
75mL, 于 70℃水浴中回流提取 2次 , 每次 1.5h。
将滤液制备成供试品溶液 , 按 “ 2.3测定吸收波长
的确定 ” 项下的方法显色 , 测得结果见表 1。
表 1　料液比对山珠半夏总游离氨基酸提取的影响
料液比 吸收度 含量 (‰)
1∶5 0.383 6.710
1∶10 0.368 6.426
1∶15 0.413 7.278
1∶20 0.406 7.146
1∶25 0.435 7.695
由表 1可知料液比在 1∶15以后对山珠半夏中
总游离氨基酸提取较为完全。
2.5.1.2　乙醇浓度的影响
精密称取 3g药材 5份 , 置于圆底烧瓶中 , 分
别 加 入 40%, 50%, 60%, 70%, 80%乙 醇
45mL, 于 70℃水浴中回流提取 2次 , 每次 1.5h。
将滤液制备成供试品溶液 , 按 “ 2.3测定吸收波长
的确定 ” 项下的方法显色 , 测得结果见表 2。
表 2　乙醇浓度对山珠半夏总游离氨基酸提取的影响
乙醇浓度 吸收度 含量 (‰)
40% 0.565 10.157
50% 0.536 9.608
60% 0.494 8.812
70% 0.394 6.918
80% 0.346 6.010
由表 2可知乙醇浓度越低越有利于山珠半夏总
游离氨基酸提取 , 但由于山珠半夏中含有大量淀
粉 , 故用低浓度乙醇提取时滤液粘稠过滤困难 , 综
合考虑用 50%左右的乙醇提取较为合理实际 。
42
第 1期 曹玮娟 , 等:紫外可见分光光度法测定山珠半夏中总游离氨基酸的含量　　　　　　 　　
2.5.1.3　提取时间的影响
精密称取 3g药材 5份 , 置于圆底烧瓶中 , 加
入 50%乙醇 45mL, 于 70℃水浴中分别回流提
0.5h, 1h, 1.5h, 2h, 2.5h, 提取 2次 。将滤液制
备成供试品溶液 , 按 “2.3测定吸收波长的确定 ”
项下的方法显色 , 测得结果见表 3。
表 3　提取时间对山珠半夏总游离氨基酸提取的影响
时间 吸收度 含量 (‰)
0.5h 0.521 9.323
1h 0.526 9.418
1.5h 0.520 9.305
2h 0.522 9.343
2.5h 0.515 9.210
由表 3可知山珠半夏总游离氨基酸的提取量在
0.5h～ 2.5h差异很小 , 说明 0.5h就能够比较完全
的提取山珠半夏中的总游离氨基酸 , 所以将实验提
取时间设定为 0.5h。
2.5.1.4　提取温度的影响
精密称取 3g药材 5份 , 置于圆底烧瓶中 , 加
50%乙醇 45mL, 分别置于 50℃, 60℃, 70℃,
80℃, 90℃的水浴中回流提取 2次 , 每次 0.5h。
将滤液制备成供试品溶液 , 按 “2.3测定吸收波长
的确定” 项下的方法显色 , 测得结果见表 4。
表 4　提取温度对山珠半夏总游离氨基酸提取的影响
温度 吸收度 含量 (‰)
50℃ 0.528 9.456
60℃ 0.553 9.930
70℃ 0.577 10.384
80℃ 0.567 10.951
90℃ 0.562 10.100
由表 4可知提取温度在 60℃ ～ 90℃时山珠半
夏总游离氨基酸的提取量都较高 , 但温度过高时 ,
提取液过稠 , 滤过非常困难 , 故提取温度选择在
60℃ ～ 80℃比较适宜。
2.5.2　正交优化
通过单因素试验 , 确定了需要因素的适宜范
围 , 结合实验实际 , 我们将以料液比 , 乙醇浓度 ,
提取温度 , 提取次数为影响因素 , 作正交优化实
验 , 实验安排见表 5, 结果见表 6、 表 7。
表 5　正交实验因素及水平
水平
因　　素
料液比
(A)
乙醇浓度
(B)
提取温度
(C)
提取次数
(D)
1 1∶15 40% 60℃ 1
2 1∶20 50% 70℃ 2
3 1∶25 60% 80℃ 3
表 6　正交实验结果
实验号
因　素 结　果
A B C D y1 (‰) y2 (‰) y3 (‰) ∑y(‰)
1 1 1 1 1 9.581 9.612 9.611 28.804
2 1 2 2 2 10.314 10.458 10.314 31.086
3 1 3 3 3 9.898 10.025 9.945 29.868
4 2 1 2 3 10.308 10.343 10.195 30.846
5 2 2 3 1 10.587 10.114 10.407 31.108
6 2 3 1 2 10.380 10.067 10.151 30.598
7 3 1 3 2 9.473 9.685 9.012 28.170
8 3 2 1 3 10.584 10.186 10.372 31.142
9 3 3 2 1 10.337 10.273 10.329 30.939
Ⅰ j 9.973 9.758 10.060 10.095
Ⅱ j 10.284 10.371 10.319 9.984
Ⅲ j 10.028 10.156 9.905 10.206
R 0.494 1.741 0.787 0.223
43
2010年 云南中医学院学报 第 33卷
表 7　方差分析表
方差来源 离差平方和 自由度 方差 F值 显著性
A 0.494 2 0.247 8.517 P<0.01
B 1.741 2 0.871 30.034 P<0.01
C 0.787 2 0.394 13.586 P<0.01
D 0.223 2 0.112 3.862 P<0.05
误差 SS 0.520 18 0.029
　　F0.05 (2, 18) =3.555　　F0.01 (2, 18) =6.013
由方差分析结果可知 , 因素 A, B, C, D对
实验结果均有显著性影响 , 提取的最佳条件为:
A2B2C2D3 , 即 50%的乙醇 , 20倍量 , 70℃水浴
中 , 提取 3次 。
2.5.3　验证试验
取山珠半夏药材粉末 3g, 按上述最佳工艺进
行验证试验 , 总氨基酸的含量分别为:10.418‰,
10.569‰, 10.451‰, 10.669‰, 10.645‰, 平均
含量为 10.550‰, RSD=1.07%.
2.6　精密度试验
取本品 3g, 按供试品溶液制备方法得供试品
溶液 , 取同一供试品溶液按 “ 2.3测定吸收波长的
确定 ” 项下的方法显色后连续进样 5次 , 记录其
吸收值 (A), 计算 RSD, RSD=0.197%, 表明仪
器精密度良好 。结果见表 8。
表 8　仪器精密度试验结果
供试液 吸收值 (A) RSD(%)
样品溶液 0.579 0.579 0.578 0.580 0.581 0.197
2.7　稳定性实验
取本品 3g, 按供试品溶液制备方法得供试品
溶液 , 取同一供试品溶液按 “ 2.3测定吸收波长的
确定 ” 项下的方法显色后 , 在 4h内 , 分别在 0h,
1h, 2h, 3h, 4h时间点进行测定 , 记录吸收值
(A), 计算 RSD, RSD=0.604%, 结果表明样品
在 4h内稳定。结果见表 9。
表 9　稳定性试验结果
供试液 吸收值 (A) RSD(%)
样品溶液 0.571 0.571 0.570 0.567 0.563 0.604
2.8　重复性试验
取本品 5份 , 每份 3g, 按供试品溶液制备方
法得供试品溶液 , 取供试品溶液按 “2.3测定吸收
波长的确定 ” 项下的方法显色后 , 测得结果 , RSD
=1.068%, 结果表明该实验重现性良好 。结果见
表 10。
表 10　重现性实验结果
样品溶液 1 2 3 4 5 RSD(%)
总游离氨
基酸含量
(‰)
10.418 10.569 10.451 10.669 10.645 1.068
2.9　加样回收试验
取本品 5份 , 每份 3g, 按供试品溶液制备方
法得供试品溶液 , 分别精密加入标准品 , 按 “2.3
测定吸收波长的确定 ” 项下的方法显色后测得结
果 , 计算回收率 。平均回收率为 99.622%, RSD=
0.114。结果见表 11。
表 11　加样回收率试验结果
样品中总游离氨基酸
的量 (mg)
加入缬氨酸的量
(mg)
实测值
(mg)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
2.896 3 5.873 99.61
2.901 3 5.890 99.81
2.891 3 5.869 99.62 99.622 0.114
2.905 3 5.879 99.56
2.893 3 5.864 99.51
44
第 1期 曹玮娟 , 等:紫外可见分光光度法测定山珠半夏中总游离氨基酸的含量　　　　　　 　　
3　结果与讨论
通过正交实验及方差分析结果 , 得出各个因素
对山珠半夏总游离氨基酸提取影响依次为:乙醇浓
度 >提出时间 >料液比 >提取次数 。最终确定山珠
半夏总游离氨基酸提取最佳工艺为:50%的乙醇 ,
20倍量 , 70℃水浴中 , 提取 3次 。
山珠半夏是云南大宗药材之一 , 应用非常广
泛。笔者通过查阅相关文献资料发现 , 目前对于山
珠半夏的研究报道非常少 , 还未见到有关其提取工
艺方面的报道 。本文拟定以山珠半夏总游离氨基酸
提取量为指标 , 对其提取工艺进行优选研究 , 其结
果经验证实验确认该提取工艺条件可行 , 为其进一
步的开发利用和研究提供一定的实验资料 。
[参考文献 ]
[ 1] 云南省药材公司.云南中药资源名录 [ M] .北京:
科学出版社 , 1993:619.
[ 2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部)
[ M] .北京:化学工业出版社 , 2005:78.
[ 3] 匡海学.中药化学 [ M] .北京:中国中医药出版社 ,
2003:396.
[ 4] 林文津 , 徐榕青 , 张亚敏.正交实验优化中药太子参
氨基酸超声提取工艺 [ J] .海峡药学 , 2006, 18
(1):33-35.
(编辑:迟　越)
TheMeasurementofTotalFreeAminoAcidinArisaemayunnanenseBuchetbyUV-Vis
CAOWei-juan, YANGZhu-ya, LIANGXiao-yuan
(YunnanUnivercityofTCM, KunmingYunnan650500, China)
[ ABSTRACT] Objective:ThemeasurementmethodoftotalfreeaminoacidinArisaemayunnanenseBuchet
isestablished.Methods:theabsorptionismeasuredusingUV-Vis, whileNinhydrinisusedasthereagentand
Valineisthestandard.Results:Inthelinearrange, thelinearcorrelationisfine, themethodisstableandthe
meanrecoveryisfoundwithintherange.Conclusion:Thismethodisrapid, simpleandaccurate.
[ KEYWORDS] ArisaemayunnanenseBuchet;TotalFreeAminoAcid;UV-Vis
(上接第 40页)
至 10mL量瓶中 , 并用流动相稀释至刻度 , 0.45μm
微孔滤膜滤过 , 测定含量 , 并计算转移率。结果见表
4。白头翁皂苷 B4转移率按下式进行计算:
转移率(%)=醇沉液中白头翁皂苷 B4浓度(mg/mL)水提液中白头翁皂苷 B4浓度(mg/mL)×100%
表 4　醇沉浓度考查结果
醇沉浓度
(%)
Ⅰ号样
转移率 (%)
Ⅱ号样
转移率 (%)
平均
转移率 (%)
40 79.56 77.12 78.34
50 76.67 77.30 76.98
60 71.50 69.34 70.42
　　F(2, 2) 0.05=19.00
从表 4结果可以看出 , 醇沉浓度越高 , 白头翁皂
苷 B4损失越大 , 醇沉浓度从 30%提高到 40%时 , 白
头翁皂苷 B4 损失增加不多 , 而从 40%提高到 50%
时 , 损失则明显增加 , 考虑到成型及溶化性检查的需
要 , 醇沉浓度选用 40%.
3　讨论
在测定白头翁皂苷 B4含量时发现 , 如果用甲醇溶
解样品 , 则会出现双峰 , 与文献报道一致[ 4] , 而用流
动相溶解则峰形较好 , 故本实验采用流动相溶解样品。
提取液浓缩程度对醇沉也有较大影响。实验中发
现 , 当 浓缩液相对密度大于 1.10时 , 将产生较多的
絮状沉淀 , 这些沉淀的吸附作用可能使有效成分有较
大损失 , 因此 , 本方醇沉时浓缩液比一般醇沉时相对
较稀 , 相对密度控制在 1.05 ～ 1.10 (60℃)。
为达到溶化性检查的要求 , 一般中药复方可溶性
颗粒剂的醇沉浓度在 50%以上 , 但本方醇沉时 , 醇
沉浓度大于 50%时 , 产生的沉淀量过多 , 导致白头
翁皂苷 B4转移率下降 , 但醇沉浓度低于 40%时 , 成
品溶化性又不符合要求 , 因此 , 本实验中 , 醇沉浓度
选用 40%.
[参考文献 ]
[ 1] 时维静 , 崔全民.白头翁汤提取工艺试验研究 [ J] .
中国实验方剂学杂志 , 2006, 12 (5):1-3.
[ 2] 时维静 , 张伟 , 王海侠 , 等.正交试验法优选白头翁
醇提工艺 [ J] .中华中医药杂志 , 2008, 32 (2):
156-158.
[ 3] 钟长斌 , 李祥.白头翁的化学成分及药理作用研究述
要 [ J] .中医药学刊 , 2003, 21 (8):1338.
[ 4] 冯果 , 刘文 , 刘梦莹 , 等.HPLC测定白头翁药材中
白头翁皂苷 B
4
的含量 [ J] .中国民族民间医药杂志 ,
2007, 25 (6):331-333.
(编辑:迟　越)
45