全 文 ：4期
Determination of total free amino acid content in Sauropus
spatulifolius Beille
TANJian-ning，DUCheng-zhi，LIANGChen-yan，HECui-wei
（Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，china）
Abstract：【Objective】The determination method of total free amino acid content in Sauropus spatulifolius Beille was
established， in order to provide reference for quality control and development of S. spatulifolius. 【Method】With glutamic
acid was selected as reference substance. The extraction condition of total free amino acid from Sauropus spatulifolius was
optimized by orthogonal experiments，and its content was determined by UV-vis spectrophotometry. 【Result】The results
showed that， The optimum extraction process conditions of total free amino acid from S. spatulifolius were as follows: com-
minution with 20-mesh sifter， liquid-material ratio of 25.0 ∶1， extraction time of 1.5 h. The comminution degree and ex-
tracting time have significant effects on extraction rate of total free amino acid content in S. spatulifolius（P＜0.05）. As for
glutamic acid control solution and S. spatulifolius test solution， the detection wavelength was 568 nm. The glutamic acid
showed a better linearity and good correlation within a range of 20.0-60.1 μg/mL（R2＝0.9991）. Under the optimum condi-
tions， the content of total free amino acid in six batches of S. spatulifolius ranged from 2.82% to 6.77%， the average was
4.50%. 【Conclusion】UV-vis spectrophotometry can be used to determinate content of total free amino acid in S. spatuli-
folius， which has advantages of simple operation and high accuracy， thus should be taken as quality control method of to-
tal free amino acid content in S. spatulifolius.
Key words： Sauropus spatulifolius Beille； total free amino acid； UV-vis spectrophotometry； orthogonal experiment；
determination of content
收稿日期：2015-12-08
基金项目：广西自然科学基金项目（2013GXNSFAA019171）；广西卫生厅中医药科技专项项目（GZZY13-10）
作者简介：谭建宁（1970-），高级实验师，主要从事传统中药及其制剂和食品质量控制研究工作，E-mail：aa8765@163.com
龙脷叶总游离氨基酸含量测定
谭建宁，杜成智，梁臣艳，何翠薇
（广西中医药大学，南宁 530200）
摘要：【目的】建立龙脷叶总游离氨基酸含量的测定方法，为龙脷叶药材质量控制及其开发利用提供参考依据。
【方法】以谷氨酸为对照品，通过正交试验优化龙脷叶总游离氨基酸的提取条件，并利用紫外—可见分光光度法测定
其含量。【结果】龙脷叶总游离氨基酸最佳提取条件为：龙脷叶粉碎过20目筛、液料比25.0∶1、提取时间1.5 h，其中粉碎
度和提取时间对龙脷叶总游离氨基酸提取效果的影响显著（P＜0.05）。568 nm是龙脷叶供试品溶液和谷氨酸对照品溶
液的检测波长；谷氨酸在20.0~60.1 μg/mL范围内与吸光值呈良好的线性关系（R2=0.9991）。在最佳提取条件下，测得6
批龙脷叶总游离氨基酸含量（以谷氨酸计）在2.82%~6.77%，平均含量为4.50%。【结论】采用紫外—可见分光光度法测
定龙脷叶总游离氨基酸含量，操作简便、结果准确，可作为龙脷叶总游离氨基酸的质量控制方法。
关键词：龙脷叶；总游离氨基酸；紫外—可见分光光度法；正交试验；含量测定
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）04-0645-05
0 引言
【研究意义】龙脷叶为大戟科植物龙脷叶（Sauro-
pus spatulifolius Beille）的干燥叶（国家药典委员会，
2015），主要分布于广西、广东、福建等地，作为广西常
用中草药已被《广西本草选编》（广西壮族自治区革命
委员会卫生局，1974）和《广西药用植物名录》（广西壮
族自治区中医药研究所，1986）收载。龙脷叶为广西特
色中药，具有通气道、润肺止咳、滑肠通便等功效，是
DOI：10.3969/j：issn.2095-1191.2016.04.645
南方农业学报 Journal of Southern Agriculture 2016，47（4）：645-649
ISSN 2095-1191；CODEN NNXAAB http：//www.nfnyxb.com
南 方 农 业 学 报 47卷
临床上常用壮药（广西壮族自治区食品药品监督管理
局，2008）。龙脷叶既可药用，又可食用，华南地区民间
常用其煲凉茶以祛痰化湿，也可与瘦猪肉或猪肺同
煮，对肺热咳嗽、失音、喉痛、急性支气管炎、上呼吸道
炎等症具有一定的保健作用。广西龙脷叶资源丰富，
深入研究其药用成分，对龙脷叶的药用开发与利用具
有重要意义，也有利于促进广西中药民族医药的可持
续发展。【前人研究进展】龙脷叶含有皂苷、甾体类和
氨基酸等成分（广东省食品药品监督管理局，2004），
但目前有关龙脷叶化学成分研究的文献报道较少，且
主要集中在龙脷叶水提物的作用研究。汪小根和邱蔚
芬（2007）采用气—质联用分析法从龙脷叶挥发油中
鉴定出16种成分，主成分为棕榈酸（28.43%）、金合欢
基丙酮（8.82%）等。刘蓉（2009）的研究结果表明，龙脷
叶的水提物为低毒性，对急、慢性炎症均有明显的拮
抗作用，并有较强的抑菌作用。黄燕等（2014）采用连
续二倍梯度琼脂稀释法研究龙脷叶水提液和50%、
70%、95%乙醇提取物的抑菌活性，结果显示，龙脷叶
水提液和50%乙醇提取物的正丁醇部位对6种试验菌
株有明显的抑制作用。陈珍（2014）采用薄层鉴别法考
察龙脷叶水提液的正丁醇萃物，并对皂苷和氨基酸部
分进行定性鉴别，显色后，可见明显的斑点出现。何鹏
等（2014）采用高效液相色谱法对15批龙脷叶中具有
抗炎、止咳、解痉、抗溃疡等功效的黄酮苷成分山柰酚-
3-O-龙胆二糖苷的含量进行测定，得知其平均含量为
0.0446%。【本研究切入点】游离氨基酸是一种重要生
物活性物质，参与植物中氮和蛋白质的代谢（Egydio
et al.，2013）。龙脷叶水提液中含有氨基酸，但至今未
见有关龙脷叶中总游离氨基酸含量测定的研究报道。
【拟解决的关键问题】以谷氨酸为对照品，通过正交试
验对龙脷叶总游离氨基酸的提取条件进行优化，并利
用紫外—可见分光光度法测定其含量，建立一种快
速、准确测定龙脷叶总游离氨基酸含量的方法，为龙
脷叶药材质量控制及其开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1. 1试验材料
龙脷叶药材于2014年6~10月分3次购自玉林药材
批发市场，其中批号141001和141002（产地：广西靖西
县）购于6月，批号141003、141005（产地：广西梧州市）
和批号141004（产地：广西玉林市）购于8月，批号
141006（产地：广西梧州市）购于10月。
谷氨酸对照品（批号140690-201203）购自中国食
品药品检定研究院；95%乙醇、冰乙酸、茚三酮、醋酸
钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、邻苯二甲酸氢钾、氢氧
化钠均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
试验用水为去离子水。主要仪器设备：8453型紫外—
可见分光光度计（美国安捷伦公司）、BP211D电子天
平（德国赛多利斯公司）、CD-UPT超纯水机、KQ5200B
型超声提取仪、DK-98-∏A恒温水浴锅、FW135型中草
药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、PHS-25
pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）、BT600电子
天平（南通市启东友铭衡器有限公司）。
1. 2溶液配制
1. 2. 1 谷氨酸对照品溶液制备 精密称取25.06 mg
谷氨酸置于25 mL容量瓶中，以去离子水溶解，定容至
刻度，作为储备液。精密吸取上述储备液5.0 mL置于
50 mL容量瓶中，以去离子水定容至刻度，制得100.2
μg/mL谷氨酸对照品溶液。
1. 2. 2 供试品溶液制备 精密称量龙脷叶药材（批
号141005）粉末（过20目筛）4.0 g置于250 mL具塞锥形
瓶中，加入100.0 mL去离子水，称定重量，提取1.5 h；
补足重量，摇匀，静置后以0.45 μm微孔滤膜过滤，取
滤液作为供试品储备液。精密吸取上述供试品储备液
0.5 mL置于25 mL容量瓶中，以去离子水稀释至刻度，
作为供试品溶液。
1. 2. 3 pH 6.0缓冲溶液配制 取醋酸钠54.6 g，加
20.0 mL 1 mol/L醋酸溶液溶解后，加水稀释至500.0
mL，即得pH 6.0缓冲溶液。
1. 3检测波长选择
精密吸取供试品溶液和谷氨酸对照品溶液各1.0
mL，分别置于10 mL试管中，再加入pH 6.0缓冲溶液
2.0 mL和2.0%茚三酮溶液1.5 mL，置于沸水中加热15
min，显色。采用紫外—可见分光光度法，用1 cm比色
皿，以试剂空白作参比，在400~800 nm范围内扫描吸
收曲线，确定检测波长。
1. 4标准工作曲线绘制
准确吸取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL谷氨酸对照品
溶液分别置于10 mL容量瓶中，以去离子水定容至刻
度，摇匀，作为谷氨酸标准溶液系列液；依次吸取1.0
mL置于10 mL试管中，分别加入pH 6.0缓冲溶液2.0
mL和2.0%茚三酮溶液1.5 mL，沸水中加热15 min，显
色。以试剂空白作参比，于568 nm处测定吸光值。以谷
氨酸质量浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准
工作曲线（图1），其回归方程为：y=0.0128x+0.0424
（R2=0.9991）。谷氨酸在20.0~60.1 μg/mL范围内与吸
光值的线性关系良好。
1. 5龙脷叶总游离氨基酸提取正交试验
在预试验的基础上，选择以去离子水超声波提取
龙脷叶总游离氨基酸。选取对龙脷叶总游离氨基酸提
取影响较大的药材粉碎度（A）、提取时间（B）、液料
比（C）作为考察因素，进行L9（34）正交试验。称取龙脷
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4期 谭建宁等：龙脷叶总游离氨基酸含量测定
图 1 谷氨酸标准工作曲线
Fig.1 Standard curve of glutamic acid
叶药材（批号141005）9份，按照1.2.2的方法制备供试
品溶液，按照1.4的方法显色，于568 nm处测定吸光
值。正交试验因素水平设计见表1。
1. 6验证试验
取龙脷叶药材（批号141005）粉末（过20目筛）5
份，在最佳提取工艺下进行总游离氨基酸提取，按照
1.2.2的方法制备供试品溶液，按照1.4的方法显色后，
于568 nm处测定吸光值，验证最佳提取工艺的可靠性。
1. 7龙脷叶总游离氨基酸含量测定
精密称量6批龙脷叶药材，按照1.2.2的方法制备
供试品溶液，分别精密吸取1.0 mL置于10 mL试管中，
摇匀；按照1.4的方法显色后，以试剂空白作参比，于
568 nm波长处测定吸光值，每个样品平行测定3次，计
算龙脷叶总游离氨基酸含量（以谷氨酸计）。计算
公式如下：
总游离氨基酸含量（%）=C×5000×V×100/（M×106）
式中，C为供试品溶液测得的吸光值代入标准工
作曲线后计算的谷氨酸质量浓度（μg/mL），V为供试
品溶液体积（mL），M为龙脷叶药材质量（g）。
2 结果与分析
2. 1检测波长的确定
在400~800 nm范围内扫描龙脷叶供试品溶液与
谷氨酸对照品溶液的吸收曲线，结果（图2）显示，供试
品溶液与谷氨酸对照品溶液的最大吸收波长均为
568 nm，因此，确定568 nm作为检测波长。
2. 2龙脷叶总游离氨基酸提取条件的确定
由表2可知，影响龙脷叶总游离氨基酸提取效果
的因素主次排序为：A>B>C，即粉碎度是主要影响因
素，其次为提取时间，而液料比的影响相对较小；其
中，粉碎度和提取时间对龙脷叶总游离氨基酸提取
效果有显著影响（P<0.05）（表3）。最佳提取工艺组合为
A3B3C2，即龙脷叶总游离氨基酸最佳提取工艺条件为：
粉碎过20目筛、提取时间1.5 h、液料比25.0∶1。
表 1 正交试验因素与水平
Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平 因素 Factor
Level A：粉碎度（目） B：提取时间（h） C：液料比（mL/g） D：空白
Comminution Extraction Liquid-material Blank
degree（mesh） time ratio
1 干燥叶子 0.5 12.5∶1 1
2 10 1.0 25.0∶1 2
3 20 1.5 50.0∶1 3
图 2 谷氨酸对照品溶液和龙脷叶供试品溶液的吸收光谱图
Fig.2 Absorption spectrogram of glutamic acid control solution
and S. spatulifolius test solution
表 2 正交试验结果
Tab.2 Results of orthogonal experiment
1 1 1 1 1 4.18
2 1 2 2 2 4.88
3 1 3 3 3 5.31
4 2 1 2 3 5.52
5 2 2 3 1 5.84
6 2 3 1 2 5.90
7 3 1 3 2 5.68
8 3 2 1 3 6.05
9 3 3 2 1 6.55
K1 4.79 5.13 5.38 5.52
K2 5.75 5.59 5.65 5.49
K3 6.09 5.92 5.61 5.63
R 1.30 0.79 0.27 0.14
试验
号
Test
No.
A：粉碎度（目）
Comminution
degree（mesh）
B：提取
时间（h）
Extraction
time
C：液料比
（mL/g）
Liquid-
material ratio
D：空白
Blank
总游离氨基
酸含量（%）
Total free
amino acid
content
因素 Factor
表 3 方差分析结果
Tab.3 Variance analysis
方差来源 离差平方和 自由度 F F临界值 显著性
Source of Sum of df F critical Signi-
variance squares value ficance
A 2.742 2 85.688 19 *
B 0.953 2 29.781 19 *
C 0.131 2 4.094 19
D（误差）Error 0.030 2
*表示该因素对龙脷叶总游离氨基酸提取效果影响显著（P＜0.05）
* represented significant effect of factors on extraction rate of total free
amino acid from S. spatulifolius（P＜0.05）
吸
光
值
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
谷氨酸质量浓度（μg/mL）
Massconcertrationofglutamicacid
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0.900
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0
y=0.0128x+0.0424
R2=0.9991
吸收波长（nm）Wavelength
吸
光
值
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
供试品溶液
Test solution
谷氨酸对照品溶液
Glutamic acid control
solution
750
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南 方 农 业 学 报 47卷
2. 3验证试验结果
验证试验结果表明，在工艺组合A3B3C2的提取条
件下，龙脷叶总游离氨基酸平均含量为6.77%，高于正
交试验各组合的含量，说明正交试验结果可靠。龙脷
叶总游离氨基酸最佳提取条件确定为：过20目筛粉
碎、提取时间1.5 h、液料比25.0∶1。
2. 4龙脷叶总游离氨基酸含量的测定结果
从表4可以看出，6批龙脷叶总游离氨基酸含量存
在较大差异，以购于8月批号141005（产地：广西梧州
市）的含量最高，为6.77%；其次是同样购于8月的批
号141003（产地：广西梧州市），其总游离氨基酸含量为
6.50%；总游离氨基酸含量最低的是批号141001（产
地：广西靖西县），为2.82%；6批龙脷叶总游离氨基
酸的平均含量为4.50%。
3 讨论
氨基酸成分的测定常采用紫外—可见分光光度
法、氨基酸自动分析仪法、高效液相色谱法、气相色谱
法等。其中，氨基酸自动分析仪法测定的氨基酸为盐
酸水解蛋白质和植物本身含有的游离氨基酸，但过层
析柱后需与水合茚三酮衍生剂衍生，造成峰形变宽，
分辨率降低；高效液相色谱分析法测定的是在分离蛋
白或限制蛋白水解条件下各游离氨基酸含量，分析时
需在过层析柱前衍生，易污染色谱柱，造成柱效降低；
气相色谱法需把氨基酸衍生为易气化的物质，且适用
于氨基酸衍生的衍生试剂不多，衍生操作复杂（刘荣
森等，2007；吴琴燕等，2014）。紫外—可见分光光度法
常用于测定总游离氨基酸，显色剂主要有茚三酮、吲
哚醌等（曾俊和苏俊黎，2003；黄松等，2010），可直观
反映植物中本身含有的游离氨基酸含量，操作简便，
准确可靠，且仪器价格低廉。
本研究采用紫外—可见分光光度法测定龙脷叶
总游离氨基酸含量，结果显示，不同批次间的龙脷叶
总游离氨基酸含量差异较明显，含量最高和最低相差
近2.5倍。广西靖西县的两批龙脷叶总游离氨基酸含量
在6批药材中最低，仅为2.82%和2.74%；购于8月的3批
龙脷叶药材中有广西梧州和玉林市两个产地，其中广
西梧州市的两批药材含量高，分别达6.50%和6.77%，
广西玉林市的龙脷叶总游离氨基酸含量仅3.66%，相
差近1.8倍；分别购于8月和10月的龙脷叶，产地同为广
西梧州市，购于10月的龙脷叶总游离氨基酸含量相较
于8月的含量有所下降，为4.51%。因此推测龙脷叶总
游离氨基酸含量受产地、采收时间等因素影响较大，
但具体原因有待进一步探究。氨基酸含量高低决定植
物的品质，6批龙脷叶总游离氨基酸的平均含量为
4.50%（以谷氨酸计），高于铁皮石斛总氨基酸含量
0.327%（以天冬氨酸计）（王培培等，2013），提示龙脷
叶品质高，可作为保健食品进一步开发和利用。
氨基酸的存在形式一般有两种，一种是游离态，
一种是结合到蛋白质中。游离氨基酸的抗感染能力显
著，有研究表明，游离氨基酸中的组氨酸、苏氨酸缺乏
可促使小鼠对伤寒沙门氏菌的易感性增高，赖氨酸缺
乏导致小鼠对炭疽芽孢杆菌的抵抗力下降，而皮下注
射半胱氨酸可增强动物一些非特异性免疫功能及对
葡萄糖球菌毒素的抵抗力（徐琪寿，1996）。本课题组
前期研究发现，龙脷叶中含有谷氨酸、组氨酸、苏氨
酸、赖氨酸等多种游离氨基酸；本研究测定龙脷叶总
游离氨基酸含量，可为深入研究龙脷叶抑菌、抗炎、镇
痛等活性成分提供实验基础。下一步将对多种游离氨
基酸的含量进行测定，为龙脷叶药材资源的综合利用
提供更多理论依据。
4 结论
采用紫外—可见分光光度法测定龙脷叶总游离
氨基酸含量，操作简便、结果准确，可作为龙脷叶总游
离氨基酸的质量控制方法。
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表 4 龙脷叶总游离氨基酸含量的测定结果
Tab.4 Results of total free amino acid content in S. spatuli-
folius
批号 总游离氨基酸含量（%） 平均值 RSD（%）
Batch No. Total free amino acid content Average
141001 2.84 2.82 0.55
2.82
2.81
141002 2.75 2.74 0.85
2.71
2.75
141003 6.52 6.50 0.54
6.52
6.46
141004 3.65 3.66 0.42
3.66
3.68
141005 6.78 6.77 0.15
6.76
6.77
141006 4.49 4.51 0.26
4.51
4.49
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（责任编辑 罗 丽）
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