全 文 ：食用菌学报 19 99 . 6 ( 2 ) : 1 5一 19
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e at 胶 l u l i、 uF n妙
冰箱保藏双抱蘑菇菌株的遗传特性研究
凌霞芬 郭倩 詹才新 贺冬梅 冯志勇 谭琦 陈明杰 潘迎捷 张引芳 高洪亮
(农业部食用菌遗传育种重点开放实验室 ;上海市农业遗传育种重点实验室 ;
上海市农业科学院食用菌研究所 ,上海 2 01 10 6)
摘 要 从菌落形态 、 生理生化特性和 D N A 水平等方面研究双抱蘑菇菌株于 4℃ 冰箱保存后
的遗传特性 。 结果表明 , 冰箱保存菌株的活力普遍下降 ;部分菌株的菌落形态发生变化 , 酉旨酶同工酶
也存在一些差异 ;但 R入1〕D 分析表明 ,冰箱保存菌株与生产栽培菌株无明显的遗传差异 。
关键词 双抱蘑菇 ; R A I〕D ; 冰箱保存 ; 酉旨酶同工酶
双抱蘑菇人工栽培迄今已有 30 多年历史 , 因其味道鲜美 、 营养丰富而深受人们喜爱 , 并
在世界各地广为栽培 。 近 20 年来 , 商业化蘑菇栽培发展迅猛 ,人们对良种的需求越来越迫切 。
然而 ,双抱蘑菇为二极性次级同宗配合 ,具有独特的生活周期 ,菌丝体细胞呈多核状态 ,大多数
抱子是 自身可育的 , 这极大地限制了菌株间天然杂交的机会 , 即使利用现代杂交育种技术 , 往
往也需要多年辛勤工作才能获得一个 良种 。 因而 ,如何保持现有 良种的优良性状 ,延缓种性退
化 ,成为双抱蘑菇遗传研究的重要课题 。 4℃冰箱保藏是最普遍 、最实用 、最方便有效的保种方
法 ,但在保种过程中 ,育种专家发现 ,双抱蘑菇菌株经 4℃ 冰箱长期保藏后会发生一定的变异 ,
其生长类型多样且有时发生相互转变 。 本研究基于这一现象 ,从双抱蘑菇个体出发 ,研究 4℃
冰箱保藏对双抱蘑菇菌株遗传特性的影响 ,从而为保持双抱蘑菇菌株优良性状提供理论依据 。
1 材料与方法
材料
供试菌株 本试验所用菌株列于表 1 , 这些菌株均由上海市农业科学院食用菌研究所
和上海市农业技术服务中心提供 。
表 1 供试菌株
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编号 tS ar in N认
菌株 tS ar l n s
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1
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1
.
2 供试培养基 常规 DP A 固体培养基 。
1
.
1
.
3 引物及序列 本试验所用引物为美 国饰 e or n 公司产品 iK t A , 20 个随机引物及其核
普酸序列列于表 2 。
1
.
2 试验方法
1
.
2
.
1 4℃冰箱保藏菌株 指 PD A 斜面在 4℃ 冰箱中长期保藏的菌株 , 在保藏过程中每 3 个
收稿 11期 : 一9 9 9 一 0 3 一 0 4 原稿 ; 19 99 一 0 5 一 1 1修改稿
DOI : 10. 16488 /j . cnki . 1005 -9873. 1999. 02. 004
16 食 用 菌 学 报 6 卷
表 2 2 0 个随机引物的核普酸序列
T曲k 2 1、 巴 n uc leo t ids eS q u e n c e o f 2 0 , 目如 m Pd能 sr est tde
引物 序列 ( 5’ 一 3 ’ ) 豁刁u e n e e ( 5 ’ 一 3 ’ ) 引物 P石me sr 序列 助刁u e n e e ( 5 ’ 一 3’ )
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月转管一次 。
1
.
2
.
2 生产栽培菌株 指在 4℃冰箱中保藏的菌种不断转管活化 , 约 5 一 7 次 , 直到恢复保藏
以前的生理活性 。
1
.
2
.
3 形态学分析 按参考文献〔1〕的方法 。
1
.
2
.
4 菌丝生长速度测定 按常规方法进行 〔2一 ’ 〕 。
1
.
2
.
5
1
.
2
.
6
同工酶分析 按参考文献〔4〕的方法 。
R A P D 分析 按参考文献 〔5 一 7 〕的方法 。
2 结果与分析
2
.
1 菌落形态分析
从表 3 可以看出 , M G I 、 MGZ 、 M G 3 、 M 6G 、 M G 7 和 M GS 冰箱保藏菌株的菌丝体 、菌落形
态与生产菌株相比没有显著变化 ,而 M 4G 、 M gG 、 M G 10 发生了较大的变化 。 M 4G 在 4℃冰箱
内长期保存后 ,直接转到 P l 〕A 平板上 , 菌落为典型的甸甸型 ,基内菌丝发达 ,菌丝贴生 ,菌落呈
不规则椭圆形 ,菌索明显 。 但经多次转管复壮到生产栽培菌株水平后 ,转为半气生型 ; M gG 经
4℃ 冰箱长期保存后 ,直接转到 P l ) A 培养基上 ,菌落呈甸甸型 ,接种点为粉状贴生菌丝 ,边缘有
岛状或扇形气生菌丝 ,菌落为不规则椭圆形 , 经多次转管复壮到生产栽培菌株水平后 , 转为气
生型 ; M G 10 冰箱保存菌株和生产栽培菌株虽都为半气生型 , 但形态明显不一样 ,前者菌落为
不规则椭圆形 ,菌索明显 ,基内菌丝发达 ,边缘有岛状 、扇形气生菌丝 ;而后者菌落为不规则圆
形 ,接种点有贴生圈 , 其外是圆环状气生菌丝 ,基内菌丝不发达 , 无菌索 。 这表明不同菌株经
4℃冰箱保藏后 ,其菌丝发生不同程度的变异 ,适应环境的能力也相应下降 , 从而表现出不同的
菌落形态 。
2
.
2 菌丝生长速度
由图 1 可以看出 ,在 PD A 平板上 , 冰箱保存菌株与栽培菌株相比 ,平均生长速度较慢 , 除
M G 6 和 M 7G 外 ,其余菌株差别较大 ,说明经低温保存后 ,菌株生活力下降 。
2
.
3 冰箱保藏菌株与栽培菌株酣酶同工酶分析
比较图 2 和图 3 可知 ,醋酶同工酶在 9 个菌株中共有 8 个电泳表型 ,共分离出 1 条 fR 值
不同的同工酶谱带 。 冰箱保存菌株与栽培菌株相 比 , 菌株之间相似性模式没有发生变化 :
M 3G
、
M 6G
、
M G 7 呈一个模式 ; M G I 、 M G 4 、 M G 10 为一个模式 , MGZ 与这个模式类似 ; M G S 和
2 期 凌霞芬 :冰箱保藏双抱蘑菇菌株的遗传特性研究
裹 3 4℃冰箱保存菌株在 PD A 平板上菌落形态的变化
Ta ble 3 劝 e c抽毋罗 of A 泊妇脚邢 口肠yn 侧 .印物 h玲沙 in p D A p . t e s t优ed in 4℃ 比 ifr 攀 r at仪
供试菌株
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菌落形态 M or p怕峨必 of o c】o n y
栽培菌株 (为n l n l e r e i l a s t r aisn 4℃保存菌株 tS ir a-sn s ot edr at 4℃ efr ir ge r aotr
甸旬型 C r e iP gn fo mr
半气生型 段m i一 aer il a fo mr
气生型 eA ir l a fo m l
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甸甸型 C er p in g fo mr
气生型 eA ir l a fo mr
半气生型 段 n l i一 e air l a公〕 n l l
甸甸型 C r e p ign f o mr
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甸甸型 C r e e p ign fo m 】
气生型 eA ir l a fo mr
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~ 栽培菌株
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4 ℃保存菌株
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5 t r d i n s s t o r e d d t 4℃
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MG 1 MGZ MG3 M( ; 4 MG6 M(二7 M( ; 8 MGg MG 10
菌株 s t r ai n s
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图 1 供试菌株菌丝生长速度 比较
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菌株 S画ns
注 : 宽带表示 强带 , 窄带表示 弱带
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菌株 S tar in s
注 : 同图 2
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圈 3 双抱曲菇冰箱保存 , 株亩醉同工醉圈借
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18 食 用 菌 学 报 6卷
M G g 仍为独特的模式 , 这与栽培菌株形成的模式一样 。 但每个菌株都发生 了不同的变化 : 其
中 MG Z 的变化最大 ,增加了一条强带 , 少了其它两条弱带 ;其余菌株的主要酶谱没有发生变
化 , 只是在酶谱强弱和弱带方面有所不同 。
2
.
4 R A P D 分析
为了进一步探讨冰箱保存对双抱蘑菇菌株遗传特性的影响 ,利用现代分子生物学 P C R 技
术对冰箱保存菌株和栽培菌株的基因组 D N A 多态性进行分析 。 由图 5 可知 , 9 个菌株的冰箱
保存菌株和栽培菌株各 自为一小类 , 平均相似系数达 0 . 995 , 最高达 1 . 0 ( M 6G 、 M G 7 ) , 最低
也达 0 . 9 84( M G 1 0 ) 。 同工酶酶谱分析和基因组 D N A 多态性分析表明 ,长期低温保存并不改
变双抱蘑菇菌株的遗传物质 。
相似系数
M G I一 I
M G I一 2
M G 4一 l
M G 4一 2
M G 】0 一 1
M G 10 一 2
M G 3一 1
M G 3一 2
M G 6 一 l
M G 7一 1
M G 6 一 2
M G 7 一 2
M G Z一 l
M G Z一 2
M G S一 l
M G S一 2
M G g 一 l
M G g 一 2
菌株
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注 : 1 . 栽培菌株 , 2 4℃冰箱保存菌株
图 4
N o t e
:
1
.
C ol ll r l z e r e i a l s t r ia n s
,
2
.
S t r a i n s 、 t o r e d i n t h e r c f r一g e r a t: 。 r a t 4℃
18 个双抱芍菇菌株 1) N A 相似系列聚类图
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3 讨论
优良菌株是双抱蘑菇高产的基本条件 。 育种专家广泛进行双抱蘑菇菌株的遗传改良 ,不
断地为菇农提供高产优质菌株 。 然而 , 双抱蘑菇菌株在 4℃常规保存后 , 菌株之间或多或少会
产生差异 , 其生长类型多样且时常相互转变 ,但对于产生这种现象的原因还知之甚少 , 有必要
对其进行深人研究 , 以提高保种效率 ,延长优良菌株的使用年限 。
经对 9 个常规双抱蘑菇菌株从菌落形态 生理生化特性和 D N A 分子水平进行的系统研
究发现 ,双抱蘑菇菌株经 4℃冰箱长期保存后 ,不同菌株的菌落形态会发生 不同的变化 ; 冰箱
保存菌株在 P l〕A 培养基上的生长速度低于栽培菌株 ,其活力普遍下降 。 另外 , 比较不同菌株
的菌落形态和生长速度可以发现 , 菌落形态发生较大变化的 M 4G 、 M gG 和 M G 10 ,其生长速度
2 期 凌霞芬 : 冰箱保藏双抱蘑菇菌株的遗传特性研究
的降幅也最大 ,分别达到 o . 0 6 c6 时 d 、 o . 0 5 c2 时 d 和 0 . 0 9 c8 司 d 。 这说明 ,经 4℃冰箱保藏后 ,菌
株活力的下降与菌株菌落形态变异有一定的相关性 ,在双抱蘑菇提纯复壮过程中 ,应选择与原
菌株菌落形态尽量相近的部位 ,这样能获得菌丝活力更强 的转管后代 。 冰箱保存菌株与栽培
菌株的醋酶同工酶比较发现 , 冰箱保存菌株普遍丢失部分弱酶带 (但 MGZ 例外 , 新增加一条
强酶带 ) ;但菌株之间酶带的相似性与栽培菌株之间没有区别 ,说明不同菌株经冰箱保存后 内
部生理生化变化的模式也不尽相同。 虽然在菌落形态和生理生化水平上发生 了较大的变化 ,
但 R A PI〕分析结果说明 ,在 D N A 水平上 ,冰箱保存菌株的结构稳定 ,表现出极高的相似性 ,未
发现与出发菌株间明显的遗传差异 。 从遗传角度也说明 , 经多次转管复壮 ,这种非 D N A 水平
上的变化是可修复的 。 因而 ,可以预见 ,双抱蘑菇菌株经严格提纯复壮后 ,能阻抑其退化进程 。
这为双抱蘑菇的保种提供了理论基础 。 但最终结果的验证 ,还需进行进一步的栽培试验 。
参 考 文 献
1 金健康 , 徐鹤林 . 双抱蘑菇气生型与甸甸型的比较研究 (续 ) . 中国食用菌 , 1990 , 9( 5 ) : 12 一 29
2 马爱民 , 贺冬梅 ,潘迎捷 . 双饱萝菇同核原生质体育种技术研究 · 食用菌学报 , 19 95 , 2( 3) : 1一 5 ·
3 詹才新 ,凌霞芬 . 双抱蘑菇菌落形态和产质量性状间相关性研究 . 食用菌学报 , 199 7 , 4 (3 ) : l 一 6 .
4 莽克强 . 聚丙烯酞胺凝胶电泳 .北京 :科学出版社 , 19 76 . 10 一 20 .
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,
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八g “ r 诬e u : 厉、加 r u 、 . pA p lied a n d E n vi or n . M i e or b iol , 1992 , 58 (9 ) : 2 97 1一 29 77 .
6 马爱民 , 潘迎捷 ,关海山等 . 双抱蘑菇原生质体同核体及杂交异核体的 R叼 〕D 分析 . 食用菌学报 , 1998 , 5
( 3 )
:
l 一 5 ,
7 詹才新 ,张引芳 , 凌霞芬等 . 中国主栽双抱蘑菇菌株的 D N A 多态性 . 食用菌学报 , 19 98 , 5( 2) : 1一 7 .
A S t u d y o n t h e G e n e t i c C h a r a c t e r i s t i e s o f
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C h e n M in gj i e P a n Y i n gj i e
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