全 文 ：收稿日期:2000-04-25初稿;2000-06-08修改稿
基金项目:福建省自然科学基金资助项目(C 9820005)
　食用菌学报　2000.7(3):11～ 15
　Acta Edulis Fungi
一个与双孢蘑菇子实体品质相关的
DNA 片段的克隆
宋思扬1　曾　伟1 , 2　陈　融1　王泽生2　苏文金1
(1厦门大学肿瘤细胞工程国家专业实验室 , 厦门　361005;
2　福建省轻工业研究所 , 福州　350005)
摘　要　利用 20 个十碱基随机引物 , 在基因组水平上对双孢蘑菇(Agaricus bisporus)的优质
低产型(G 型)及低质高产型(H 型)菌株进行了 RAPD差异显示 , 获得一个与双孢蘑菇子实体品质
相关的大小约为2000bp的差异 DNA片段 , 将其克隆 ,并应用点杂交及 RFLP 技术对其区分两类菌
株的有效性进行了检验。这为进一步建立特异性探针或 PCR引物 , 从分子水平上提高双孢蘑菇菌
种性状早期预测的准确性奠定了基础。
关键词　双孢蘑菇;RAPD;子实体品质;DNA 克隆;RFLP
80年代后期以来 , DNA分子遗传标记在双孢蘑菇[ Agaricus bisporus (Lange)Imbach.]
的遗传育种研究中得到了广泛的应用 ,如菌株间亲缘关系的分析 、同核体的分离 、遗传杂交的
鉴定以及物种多态性的调查等〔1 ～ 3〗〕。研究还进一步从 DNA 分子水平上证实 ,双孢蘑菇担子
中减数分裂后形成的四个单倍体核确有非姐妹核进入同一孢子的非随机迁移倾向〔4 ,5〕 。这些
DNA分子遗传标记主要包括 RFLP(Restriction Fragment Leng th Polymo rphism ,限制性片段
长度多态性)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA ,随机引物扩增多态性 DNA)、rDNA
重复序列等。尽管 DNA分子遗传标记的引入已将双孢蘑菇的基础遗传研究及杂交育种水平
提升到一个新的高度 ,然而 ,与双孢蘑菇的重要农学性状相关的 DNA 分子遗传标记迄今却鲜
有报道。
本文将报道一个由 RAPD 技术进行差异显示得到的与双孢蘑菇子实体品质相关的 DNA
片段的克隆 ,并对其区分不同菌株的有效性进行了初步检验 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　菌株及培养基
10株双孢蘑菇菌株均为福建省轻工业研究所蘑菇菌种研究推广站保存菌株 ,其中包括优
DOI :10.16488/j.cnki.1005-9873.2000.03.003
质低产型菌株(G 型):8213 、8211 、C1 、福罐 4(FG4)、闽一号(M1#),及低质高产型菌株(H
型):02 、176 、111 、13D 、01 ,常规 PDA培养基培养。大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株(包
括无质粒菌株及带有质粒 pUC19的菌株)为本实验室保存菌株 ,常规 LB培养基培养。
1.1.2　主要试剂及随机引物
本实验所用的主要分子生物学试剂购自华美生物公司及美国 Promega 公司。20 个十碱
基随机引物购自中国科学院遗传所 ,编号及核苷酸序列见表 1 。
表 1　供试随机引物编号及核苷酸序列
Table 1　Commercial numbers and nucleotide sequences of random primers tested
编号
Numbers
核苷酸序列(5 ※3 )
Sequence of nucleotide
编号
Numbers
核苷酸序列(5 ※3 )
S equence of nucleotide
OPU01 ACGGACGTCA OPU11 AGACCCAGAC
OPU02 CTGAGGTCTC OPU12 TCACCAGCCA
OPU03 CTATGCCGAC OPU13 GGCTGGTTCC
OPU04 ACCTTCGGAC OPU14 TGGGTCCCTC
OPU05 T TGGCGGCCT OPU15 ACGGGCCAGT
OPU06 ACCTTTGCGG OPU16 CTGCGCTGGA
OPU07 CCTGCTCATC OPU17 ACCTGGGGAG
OPU08 GGCGAAGGT T OPU18 GAGGTCCACA
OPU09 CCACATCGGT OPU19 GTCAGTGCGG
OPU10 ACCTCGGCAC OPU20 ACAGCCCCCA
1.2　方法
1.2.1　总 DNA的提取及随机引物 PCR扩增
双孢蘑菇总 DNA的提取方法及随机引物 PCR扩增方法参见文献〔6〕, DNA差异带用低
熔点胶法进行回收并纯化〔7〕 , DNA 差异带的标记 、点杂交及 Southern杂交方法参考文献〔7〕
及德国宝灵曼公司提供的地高辛(DIG)标记试剂手册。
1.2.2　DNA差异带的克隆
由于 Taq DNA聚合酶具有非模板依赖的在PCR产物 3 末端加上腺嘌呤的活性 ,因此 ,在
克隆 PCR产物之前 ,我们将其用 Klenow 片段进行平端化处理 ,而后将其克隆入事先已由平切酶
SmaI线性化的pUC19质粒中。实验方法及其后的转化 、重组质粒的鉴定方法均参见文献〔7〕。
2　结果
2.1　RAPD差异显示
本实验选取两组 10株菌株 ,一组为 5株优质低产型菌株(G 型),另一组为 5株低质高产
型菌株(H 型),用 20个随机引物对其总 DNA进行扩增 ,在基因组水平上进行 RAPD 差异显
示。经筛选发现 ,OPU17 的各菌株扩增图谱可以得到很好的重复 ,引物 OPU17 可在 G型菌
株中扩增出一分子量约为 2000bp的差异带(图 1),命名为 G172000 。
2.2　目的 DNA片段的克隆及重组子的酶切鉴定
差异 DNA片段 G172000采用低熔点胶法进行回收与纯化(图 2)。纯化的差异 DNA片段
用 Klenow 片段的 3 到 5 的外切酶活性将因 TaqDNA聚合酶非模板依赖活性在 3 末端加上
的腺嘌呤去除 , 进行平端化处理 。而后用 T 4 连接酶将其克隆入由平切酶 SmaI 线性化的
pUC19质粒中。
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M.分子量标准　λDNA/HindIII marker
1-5.H 型菌株 02 、176 、111 、13D、01的扩增产物
Amplification products of type H st rains 02 , 176 ,
111 , 13D , 01
6-10.G 型菌株 8213 、8211 、M1#、C1 、FG4的扩增产物
Amplification products of type G strains 8213 ,
8211 , M1# , C1 , FG4
图 1　随机引物 OPU17扩增图谱
Fig.1　Ampli fication pattern of random primer OPU17
M.分子量标准　λDNA/HindIII+EcoRI marker
1.引物OPU17扩增的菌株 02的 PCR产物
PCR product of strain 02 ampli fied by OPU17
2.引物OPU17扩增的菌株 8213的 PCR产物
PCR product of strain 8213 ampli fied by OPU17
3.纯化的G172000 DNA片段
Pu rifi ed DNA fragmen t of G172000
图 2　差异 DNA片段 G172000的纯化结果
Fig.2　Purification resul t of specific DNA fragment G172000
经酶切实验证实 ,pUC19 的单切酶 SacI 在差异 DNA 片段 G172000上无位点 ,因此 ,选择
SacI 作为 pUC19-G172000重组子的鉴定用酶。将重组子线性化后 ,发现分子量大致与预期值
4600bp相符 。原空载体 pUC19的大小为 2690bp 。由此初步认定克隆正确(图 3)。但酶切鉴
定重组子缺乏严格意义上的确证性。进一步以 pUC19 空载体为阴性对照及以未标记片段
G172000PCR产物为阳性对照 ,用 DIG标记的片段 G172000PCR产物作为探针进行点杂交验证 ,
结果也说明该重组子克隆有目的 DNA 片段(图 4)。
　　M.分子量标准　λDNA/HindIII +EcoRI marker
　　1.S acI 线性化的 pUC 19
pUC 19 plasmid digested wi th SacI
　　2.S acI 线性化的重组质粒
Recombinated-plasmid digested with S acI
图 3　G172000克隆子的酶切鉴定
Fig.3　Digesting identi fication of G172000
recombinated-plasmid
1.阳性对照 Posit ive cont rol
2.重组质粒 Recombinated-plasmid
3.阴性对照 Negative cont rol
图 4　G172000克隆子的点杂交鉴定
Fig.4　Identification of G172000 recombinated-plasmid
by dot hybridization
2.3　G172000探针有效性初检
分别用点杂交及 RFLP 分析对 G172000探针区分 H 型及 G 型菌株的有效性进行初步分
析。点杂交结果显示 , DIG 标记的 G172000探针无法区分 H 型及 G 型菌株 。而在进一步的
RFLP分析中 ,用 HaeIII 先将 RAPD筛选中选用的 G型菌株 8213及 H 型菌株 02的总 DNA
133 期　　　　　　　　　宋思扬等:一个与双孢蘑菇子实体品质相关的 DNA 片段的克隆
进行酶解 ,然后用由 DIG标记的 G172000探针与各酶解物进行杂交 。实验结果显示 ,G172000探
针与两类总 DNA的 HaeIII的酶解物的杂交结果不同 ,可很好地区分两类不同的菌株(图 5)。
　　M.分子量标准　λDNA/HindⅢ marker
　　1.HaeIII 酶解的菌株 02的总 DNA　Genomic DNA of strain 02 digested by HaeⅢ
　　2.HaeIII 酶解的菌株 8213的总 DNA　Genomic DNA of strain 8213 digested by HaeⅢ
图 5　探针 G172000与 HaeIII酶解的 02与 8213总 DNA 的 Southern杂交
Fig.5　Southern blot hybridization of probe G172000 with genomic DNA of strains 02 and 8213 digested by HaeⅢ
3　讨论
RAPD技术是在 PCR的基础上发展而来的 ,利用十碱基随机引物对模板基因组 DNA进
行PCR扩增来展示物种个体间的差异。配合分析个体间的遗传背景 , 寻找与性状相关的
DNA序列或进行基因定位 ,是 RAPD技术的一个重要目标 ,其具体应用主要有近等基因系分
析(Near Isogenic Line Analy sis , N ILA)和混合分离个体分析(Bulked Segregant Analysis ,
BSA)。近等基因系分析法是通过多代回交的方法来消除子代因杂交引起的与亲本间的本底
差异 。而混合分离个体分析法则是通过建立差异库并扩大样品数量的方法来消除本底差异的
干扰〔8〕。本研究的 RAPD分析虽由于双孢蘑菇生长周期长 ,杂交又须将子实体产生的孢子进
行同 、异核分离等客观因素的限制而事先未能按上述方法建立完整的遗传品系 ,但研究是以混
合分离个体分析为出发点 ,选择了两类具不同典型性状的双孢蘑菇品系作为分析差异的两个
DNA库 。此外 ,双孢蘑菇种内遗传相似性也为差异分析提供了客观上的便利〔5 , 9〕 ,进一步降
低了两个 DNA库的本底差异 。
对两类具不同性状的双孢蘑菇进行 RAPD差异分析后 ,将得到的差异 DNA 片段制成探
针的目的在于期望能够循此进一步建立一套 DNA探针 ,为用点杂交 ,或更简便地 ,用原位杂
交的方法进行菌种性状的早期预测提供有效的 DNA 遗传标记 。但将探针直接返回与 H 型及
G 型菌株进行点杂交 ,并不能区分这两类菌株 ,而 RFLP 分析则可以区分这两类菌株。原因可
能是 , RAPD展示差异的基础在于根据分子量的大小来区分扩增产物的差异 ,这种差异主要是
由模板 DNA上与引物结合位点的有无及其距离所决定的。随机引物的结合位点的变迁或两
位点间的距离过大导致差异带的阴性扩增 ,并不意味着整个差异带序列在基因组上的消失 。
因而两种类型的菌株用点杂交法不能区分也就不足为奇了 。而 RFLP 显示差异则是由于不同
基因组 DNA上具有不同的限制性内切酶位点 ,酶切后产生的片段长度不一样 ,这样 ,相同的
探针与它们杂交后 ,差异就得到了显现。简单说 , RAPD可显示基因组 DNA 上随机引物结合
位点的变化 ,而 RFLP 则显示基因组 DNA 上限制性内切酶位点的变化。因此 ,进一步的研究
拟对差异片段 G172000进行测序 ,并根据其内部序列来设计特异性探针或 PCR引物来区分这
14 食　用　菌　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　7 卷
两类菌株 。
近年来 ,无论是转化载体的构建 ,还是外源 DNA 的导入 ,双孢蘑菇的原生质体转化技术
均有了较大的提高〔10〕 , 但缺乏合适有效的外源 DNA 片段成了转化育种发展的“瓶颈” 。
RAPD提供了一种高效简便的寻找性状相关 DNA片段 ,进而可进行基因定位的分子生物学技
术 ,可为今后双孢蘑菇转化育种的发展突破“瓶颈”带来新的契机 。
参　考　文　献
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Cloning of a DNA Fragment Correlated to
the Quality of Agaricus bisporus Fruitbody
Song Siyang1　Zeng Wei1 , 2　Chen Rong1　Wang Zesheng2　Su Wenjin1
(1 State Laboratory fo r Tumor Cell Engineering , Xiamen University , Xiamen　361005;
2　Fujian Research Institute of Light Industry , Fuzhou　350005)
Abstract　With 20 ten-mers random primers , the genomic differences betw een tw o types of Agaricus bis-
porus strain-good quality with low yield(G type)v s.poor quality with high yield (H type), were display ed by
Random Amplified Polymorphic DNA(RAPD)technique.A 2000bp specific DNA fragment correlated to the quali-
ty of Agaricus bisporus fruitbody was obtained and cloned.Then dot hybridization and RFLP technique were used
to determine the effectiv eness of distinguishing two types o f A .bisporus strains.And it was considered that our
study had laid a foundation fo r further establishing a specific probe o r PCR primer and fo r improving the accuracy of
early predicting the characteristics o f A.bisporus strains at molecular level.
Key words　Agaricus bisporus;RAPD;F ruitbody;Cloning;RFLP
153 期　　　　　　　　　宋思扬等:一个与双孢蘑菇子实体品质相关的 DNA 片段的克隆