全 文 ：食月J I省学报 2 9 9 8. 5 ( 4 ) : 6一 2 0
A ( la E口u l,、 厂 ,之 , 29 2
双抱蘑菇三种类型菌株的 R A P D 扩增研究 `
陈美元 廖剑华 王泽生
(福建省轻工 、I卜研究所 , 福 州 3 5 0 0 0 5 )
摘 要 用 7 2 个随机引物 , 又`r三利,类型双抱蘑菇菌株 2 7 9 6 (杂交型 ) 、 8 2 1 1 (优质型 ) 、 0 1 ( 高产
型 )等进行 R A P D 扩增 , 发现 26 个引物均产 生三种不同的带型 。 用该 2 6 个引物进 一步作三种类型
9 株双饱蘑菇白色菌株的 R A P D 扩增 , 发现引物 U l民 U 20 、 B l 、 H 4 、 H S 、 M 7 能很 好地区分 三类菌株 ,
尤以 U ZO 和 H S 为佳 , 其产生的三种带 型稳定整齐 , 差异带明显 , 为双饱蘑菇菌株特性的旱期预测提
供 J D N A 水平的标记
关键词 双饱蘑菇 ; R A P D ; 菌株类 烈
继同核不育单抱分离物配对杂交育种 、 原生质体融合等细胞水平的育种技术之后 , 双袍蘑
菇的遗传育种 已达到分子水平 , 其成果主要有同工酶电泳法鉴定种性 L`〕 , 染色体混合标记连
锁图的建立圈 , 纤维素酶 、 漆酶基 因的克隆 3L, “ 」 , 性因子 的定位图 等 。 而每个成果的取得都离
不开各种遗传标记在该物种研究上的应用及不断更新 。
随机扩增多态 D N A ( R A I〕 D , R a n d o m A m p l if ; e d P o l帅 o r p l飞iC D N A )技术在生命科学的许多
研究领域 已得到广泛应用 , 包括遗传多态性 研究 、 分类研究 、 遗 传关系分析 、 某些特定基因标
记 、 作连锁图谱等 。 这种以 P C R 反应为基础的技术克服 了同工酶和 R F L P 技术的一些缺点 ,
具有快速 、 安全 、 简便 、 灵敏度高 、 需样量少的特点 。 在双抱蘑菇育种研究中 , X u 等人 以 R FI .P
和 R A P D 标记为辅助将性 因子定位在染色体 1_ 上川 , 美 国 A m yc el 公司找到了一个与双饱蘑
菇子实体颜色性状强度连锁的 R A P D 标记五 , lK l us h 等则用该技术作了双泡蘑菇遗传亲子的
分析 〔7〕 。 但由于缺少合适的引物和系统的菌株 , 至今在双抱蘑菇遗传育种上 尚未得到更为有
效的应用 。 本研究通过多个引物和菌株的 R A P D 试验 , 以期找出一种适用于双抱蘑菇菌株种
性预测的 、 操作快速准确的遗 传标记 。
材料与方法
1
.
1 菌株
双抱蘑菇 ( A卯 二 i e , ` 、 占i功 o r “ 、 )杂交菌株 (同工酶表型 〔` 〕H G 4 ) 2 7 9 6 、 3 0 0 3 , 优质菌株 ( 同工酶
表型 G ) 8 2 1 1 、 C l 、 福罐 4 , 高产菌株 (同工酶表型 1 ) 0 1 、 02 、 沙洲 24 一 3 、 1 26 , 均由福建省蘑菇菌
种研究推广站提供 。
1
.
2 P C R 试剂
l
,
2
.
1 T aq 酶 P or m eg a 产品 , 使用前稀释成 O . S U /川、
1
.
2
.
2 1 0 入 b u f f e : P r o m e g a 产品 。
1
.
2
.
3 M g CI : rP
o m eg a 产品 , 浓度为 2 5n 飞M
{}丈稿 }l 期 ; 19 9 7 一 1 1 一 3 初稿 : 19 9 8 一 3 一 4 修改稿
砖 本文山福建省 自然科学 鹅金 资助
DOI : 10. 16488 /j . cnki . 1005 -9873. 1998. 04. 002
4 期 陈美元等 :双抱蘑菇三种类型菌株的 RA D P扩增研究
1
.
2
.
4 随机 引物 Sa n g on 产品 , 稀释成约 3 . 7拼M 使用 , 编号为 U l 一 U 20 , B l 一 B 10 , H l -
H 10
,
X l 一 X 10 , M l 一 M 1 0
,
R l 一 R 1 0 , W l
,
W Z
。
1
.
2
.
5 dN T P S 华美公司产品 , 总 2 . s m M 。
1
.
3 总 D N A 模板的提取
按朱衡等的方法 〔8〕稍作改动 。 从 P D A 斜面上刮下蘑菇菌丝 (约 0 . 1 9 ) , 冰冻后砸碎 , 置
1
.
s m I
J
E p p e n d o r f 管中 , 加 5 0 0拌L 提取缓冲液 ( 10 o m M T r i s 一 e l , 4 o m M E D T A , p H S . 0 )混匀 ,
加 10 0拜L 10 % S D S , 3 0 0产L 氯化节 , 旋 涡振 荡成乳状 , 5 0℃ 水浴 l h (每隔 r s m i n 颠倒 混匀一
次 ) , 加 3 0 0拼 IJ 3 M N aA e ( p H S . 2 )混 匀 , 冰 浴 l h , 台式冷 冻离心 机 上 10 0 0 0 r/ m i n 4℃ 离 心
10 m in
,上清液吸至另一离心管 中 , 加入等体积异丙醇 , 室温沉淀 20 itn n , 台式离心机 1 3 0 0 r /
m sn 离心 10m in , 沉淀用 7 0 % 乙醇洗一次 , 吹干后溶于 2 0拼L T E ( l o m M T r i s 一 e 一, l m M E D T A ,
p H S
.
0 )
。 使用前用无菌去离子水约 巧 倍稀释 , 使 D N A 终浓度约为 15 一 20 gn /拼 I J 。
1
·
4 R A p D 扩增反应 〔9〕
采用 1 5拜L 扩增体系 。 在 0 . 2m L p C R 管 ( p E 公司产品 )中加入 7 . 3胖L 纯水 , 1 . 5拌L l。 只
b u f f e r
,
1
.
2拜L M g C 12 (终浓度 2 . o m M ) , 1拜L d N T p s (终浓度 0 . 17m M ) , l 拼L 随机引物 (终浓度
0 2 5m M )
,
1产L 模板 D N A ( 1 5 一 2 0 n g ) , 2“ L T a q 酶 ( I U ) , 混匀后置 p E 9 6 0 0 G e n e A m p p C R
S y s t e n
l 上进行扩增反应 ; 9 4℃ Zm i n l 个循环 ; 9 4℃ 30 5 , 4 5℃ 3 0 5 , 7 2℃ l m i n , 共 4 2 个循环 ;
72 ℃ s m in , 降至 4℃ 。 P C R 产物加入 5 “ L 上样缓冲液 ( 50 % 蔗糖 , 0 . 2 % 嗅酚蓝 ) , 在 1 . 5 % 琼脂
糖凝胶上电泳分离 , E B 染色照相 。
2 结果与分析
2
.
1 模板 D N A 提取
用本方法提取双抱蘑菇总 D N A , 得率不太高 , 一支斜面约得 3 一 5滩 D N A , 且混有少量杂
蛋 白 , 但这并不影响它成为 P C R 反应的良好模板 , 因该反应只需微量 D N A 粗制品 。 该法所用
的破壁试剂氯化节的极性与苯酚相近 , 在破壁的同时可抽提 部分蛋 白 , 故可省去蛋 白抽提步
骤阁 。 且因少量提取 , 故操作简便快速 , 可成批提取大量菌株 , 这对大量菌株 (如成批的融合
子再生株 )的实验室早期 D N A 鉴定将十分有利 。
2
·
2 R A P D 扩增反应
以代表双抱蘑菇三种类型的典型菌株 2 7 9 6( 杂交型或 H G 4 型 ) 、 8 2 1 1( 优 质型或 G 型 ) 、
BS 6 5 或 01 (高产型或 H 型 )的总 D N A 为模板 , 使用 7 2 个随机引物进行 R A P D 扩增 , 发现结果
不明朗 (无带或带模糊 )的引物 6 个 , 只产生一种带型的引物 10 个 , 产生两种带型的引物 30
个 , 产生三种带型的引物 2 6 个 (结果 未显示 ) 。 这 2 6 个引物为 U l 、 U 7 、 U S 、 U 10 、 U l l 、 U 1 2 、
U 1 6
、
U 18
、
U 2 0
、
B l
、
B S
、
B S
、
B 10
、
H l
、
H 4
、
H S
、
H 7
、
H S
、
X S
、
X 7
、
X g
、
M Z
、
M 4
、
M S
、
M 7
、
M S
。 用这
2 6 个随机引物对三种类型 9 株双抱蘑菇 白色菌株 ( 2 7 9 6 、 3 0 0 3 ; 8 2 1 1 , C I , 福罐 4 ; 0 1 , 0 2 , 沙洲
24
一 3 , 1 26 )再次进行 R A P D 扩增 , 发现有 6 个引物可很好地区分三种类型菌株 , 它们是 U 1 6 、
U 20
、
B I
、
4H
、
H S
、
M 7
, 其核普酸序列分别为 C T G C G C T G G A 、 A C A G C C C C C A 、 G T T T CG C T C C 、
G G A A G T C G C C
、
A G T C G T C C C C
、
C C G T G A C T C A
。
其中引物 U ZO和 H S 产生的带型稳定清晰整齐 ,谱带差异明显 , 分型效果最好 , U 16 扩增
带强弱差异显著 , 但位置相同 ; B l 与 H 4 的带型不够清晰 , 希望通过扩增反应某些参数的变化


l ( ) 食 J {l 菌 、贷 报 5 卷
) /
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.
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J 萨姆布鲁克 , E F 弗里奇 , T 曼尼阿蒂斯著 (金冬雁等译 ) 分子克隆实验指南 (第二版 ) . 北京 : 科学出版
社 , 1 9 9 5 . 6 7 2 一 6 8 3 .
A S t u d y o n t h e R A P D A m P l i f i c a t i o n
o f A g口 r 乙C “ S b i s P o r u s S t r a i n s o f T h r e e T y P e s
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《微生物学杂志》 1 9 9 9 年征订启事
《微生物学杂志》是包括工业 微生物学 、 农业微 ’ { 物学 、 医 ` 、户医药微生物学 、 兽医微生物学 、 食 用菌及生物
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应 川 ” 、 “ 专题译述 ” 、 “ 技术讲座 ” 、 “ 科技信急与服务 ” J之“ 会议简 讯 ” 等 ` 读者对象为本学科的科技工 作者 、 大中
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