全 文 ：·科技简报·
［基金项目］重庆市重大科技专项资助课题［编号：渝科发计字（２００４）２７号］　［作者简介］王继生，男，药理学博士，副主任药师，电话：０８１－
６２２７００７２，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｊｓ３２７＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ　［通讯作者］邱宗荫，男，教授，电话：０８１６－２２７００７２，Ｅ－ｍａｉｌ：２４４７５４３４＠ｑｑ．ｃｏｍ
茅莓总皂苷提取分离工艺考察
王继生１，邱宗荫２，夏永鹏２，李惠芝２　（１．绵阳市第三
人民医院，四川 绵阳６２１０００；２．重庆医科大学药学院，重庆
４０００１６）
［摘要］　目的：研究Ｄ１０１大孔吸附树脂富集、纯化茅莓总皂
苷的工艺条件及参数。方法：以茅莓总皂苷的洗脱率和纯度
为考察指标，研究大孔吸附树脂富集、纯化茅莓总皂苷的吸
附性能和洗脱参数。结果：茅莓提取液上大孔吸附树脂柱，
用不同体积分数的乙醇依次洗脱，茅莓总皂苷富集于４０％乙
醇洗脱液部分。结论：通过大孔吸附树脂富集、纯化后，茅莓
总皂苷的洗脱率在７５．４％以上，总固物中茅莓总皂苷含量可
达６４．４％。
［关键词］　大孔吸附树脂；茅莓总皂苷；纯化工艺
［中图分类号］Ｒ２８４．２　　［文献标识码］Ａ　　［文章编号］１００１－
５２１３（２０１１）１３－１１３８－０２
　　茅莓总皂苷对脑缺血再灌注大鼠有保护作用，能改善大
鼠的行为学症状，减少脑梗死体积，降低脑含水量，降低血脑
屏障通透性，不同程度提高脑缺血再灌注损伤时脑组织中的
ＳＯＤ和ＧＳＨ－Ｐｘ活性，降低脑组织的 ＭＤＡ含量；减低缺血周
边区凋亡细胞的数目；促使抗凋亡基因Ｂｃｌ－２的表达上调，促
使凋亡基因Ｂａｘ表达下调。降低ＥＥＡ含量，降低细胞内钙离
子浓度，其抗脑缺血的机制可能与抗氧化和抗凋亡有关［１－２］。
如何寻找一种高效、实用的提取工艺是该总皂苷作为有效部
位进一步开发研究的主要环节。大孔吸附树脂为一种有机高
聚吸附剂，具有选择性好、吸附容量大、解吸容易、再生简便等
优点，应用于皂苷类成分的富集纯化有较好的效果。本实验
通过对Ｄ１０１型大孔吸附树脂富集、纯化茅莓总皂苷工艺条件
与参数的研究，探索其分离纯化工艺流程，同时建立相应的含
量测定方法，从而确立富集、纯化茅莓总皂苷的可行路线。
１　材料
茅莓药材样品采自重庆市璧山县，经重庆市中药研究院
生药栽培室李泉森副研究员鉴定为悬钩子属植物茅莓Ｒｕｂｕｓ
ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ　Ｌ；Ｄ１０１大孔吸附树脂（天津农药股份有限公
司）；可见紫外分光光度计（日本岛津公司）；试剂均为分析
纯。
２　方法与结果
２．１　茅莓总皂苷分析方法的建立［３］　我们对水提正丁醇萃
取物、大孔吸附树脂洗脱物采用相同的方法测定茅莓总皂苷
含量。
２．２　茅莓提取工艺
２．２．１　提取溶媒的选择　取同批茅莓药材分别以水、５０％，
７０％，９５％乙醇提取，提取液分别减压回收乙醇并浓缩，按照
测定方法中样品的制备方法项下的方法制备样品，测定茅莓
总皂苷的含量，结果见表１。结果表明７０％乙醇提取较好。
表１　提取溶媒比较
Ｔａｂ　１　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｏｌｖｅｎｔｓ
提取溶媒 含量／％ ＲＳＤ／％
水 ２．０　 ３．６
５０％乙醇 ２．３８　 ２．２
７０％乙醇 ２．５　 ３．３
９５％乙醇 ２．４　 ２．７
２．２．２　茅莓提取方法选择　取同批茅莓药材分别用７０％乙
醇回流提取，索氏提取及超声提取，提取液分别回收乙醇并
浓缩，按样品制备方法项下方法制备样品，测定茅莓提取物
中茅莓总皂苷的含量，结果为回流提取平均含量为２．８％
（ＲＳＤ为２．８％），超声提取平均含量为２．２％（ＲＳＤ为２．７％）
索氏提取提取平均含量为２．７％（ＲＳＤ为３．２％）。结果表明
采用回流提取效果最好。
２．２．３　茅莓药材总皂苷提取条件的筛选　根据茅莓药材总
皂苷确定的提取方法，选择乙醇体积分数、提取时间、提取次
数、乙醇用量４个因素，每个因素３个水平，按Ｌ９（３４）正交表
试验。以其中所得的总皂苷含量最高者作为样品制备的条
件进行实验。取同一产地相同批次药材粗粉（１０目），分别精
密称取此粗粉１　ｇ置５０　ｍＬ烧瓶中，回流提取，根据因素－水
平表，进行逐一试验。结果见表２，３，图１。
表２　Ｌ９（３４）因素－水平表
Ｔａｂ　２　Ｌ９（３４）Ｆａｃｔｏｒ－ｌｅｖｅｌ　ｔａｂｌｅ
水平
因素
Ａ（乙醇／％）Ｂ（提取时间／ｈ）Ｃ（提取次数）Ｄ（溶剂用量／倍）
１　 ５０　 ０．５　 ２　 １０
２　 ７０　 １　 ３　 ２０
３　 ９５　 １．５　 ４　 ３０
表３　茅莓提取条件的正交数据
Ｔａｂ　３　Ｔｈｅ　ｄａｔａ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｆｏｒ　ｔｏｔａｌ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｆｒｏｍＲｕｂｕｓ　ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ
实验序号 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ 吸光度 总皂苷含量／％
１　 １　 １　 １　 １　 ０．５３９　２　 ２．０５
２　 １　 ２　 ２　 ２　 ０．７０２　８　 ２．６５
３　 １　 ３　 ３　 ３　 ０．７１５　４　 ２．７１
４　 ２　 １　 ２　 ３　 ０．７４７　３　 ２．８２
５　 ２　 ２　 ３　 １　 ０．７２２　４　 ２．７３
６　 ２　 ３　 １　 ２　 ０．６０８　７　 ２．３１
７　 ３　 １　 ３　 ２　 ０．５４２　１　 ２．０６
８　 ３　 ２　 １　 ３　 ０．６０２　１　 ２．２９
９　 ３　 ３　 ２　 １　 ０．５９５　２　 ２．２６
Ｋ１／３ ０．６５２　０．６１０　０．５８３　０．６１９
Ｋ２／３ ０．６９３　０．６７６　０．６８２　０．６１８
Ｋ３／３ ０．５８３　０．６４０　０．６６０　０．６８８
Ｒ　 ０．１１３　０．０６６　０．０９９　０．０７０
　　实验结果直观分析，确定茅莓药材提取的最佳条件为
Ａ２Ｂ２Ｃ２Ｄ３，即茅莓药材粗粉１　ｇ用７０％乙醇３０　ｍＬ回流提
取３次，每次２　ｈ。
３　茅莓总皂苷的精制工艺
３．１　茅莓提取物的上柱前处理
３．１．１　大孔树脂的前处理　取Ｄ１０１大孔吸附树脂装入索
氏提取器中，以９５％乙醇提取以除去树脂中有机残留物，每
天１２　ｈ，至醇洗脱液加数倍水后不浑浊，且醇提取液在２００～
·８３１１· 中国医院药学杂志２０１１年第３１卷第１３期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１１　Ｊｕｌ，Ｖｏｌ　３１，Ｎｏ．１３
图１　茅莓总皂苷提取正交试验效应曲线图
Ｆｉｇ　１　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｆｆｅｃｔ　ｇｒａｐｈ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｏｔａｌ　ｓａｐｏ－
ｎｉｎｓ　ｆｒｏｍＲｕｂｕｓ　ｐａｒｖｉｆｏｌｉｕｓ
４００　ｎｍ处吸光度小于０．１为止。由此可认为，有机残留物基
本洗净。树脂再用纯化水洗去乙醇，装柱即可。
３．１．２　上柱前药液的前处理　药液中有大量微粒存在，会
堵塞大孔吸附树脂表面的微孔，影响吸附，故上柱前药液需
要经过澄清处理，取茅莓７０％醇提取液，回收乙醇，离心取上
清液，按样品制备下方法，制备供试液；沉淀加水混悬，同法
处理，均定容至相同浓度（含生药量相等），分别比较样品中
茅莓总皂苷的含量（２．５％），茅莓总皂苷大部分可溶于上清
液中（２．３％），沉淀中也有少量皂苷（０．２％），加强对沉淀的
洗涤可能会减少总皂苷的损失。
３．２　大孔吸附树脂吸附容量的考察　选用近年来使用较多
的Ｄ１０１树脂１　ｇ（干树脂），加无水乙醇充分溶胀，用纯化水
洗净，置三角瓶中，加茅莓提取物，２０℃恒温振摇２４　ｈ，比较
茅莓提取物加如前后的总皂苷含量的变化，即可得树脂的吸
附容量。吸附后的树脂用纯化水洗至 Ｍｏｌｉｓｈ反应呈阴性，
再加入９５％乙醇５０　ｍＬ，２０℃恒温振摇２４　ｈ，取吸附前后药
液，按照分光光度法制备项下方法制备样品，测定醇洗脱液
中茅莓总皂苷的量，计算得树脂的洗脱率，本实验所得的洗
脱率为７５．４％。
３．３　大孔吸附树脂洗脱溶剂的选择　分别取Ｄ１０１大孔吸
附树脂４份，每份１　ｇ（干重），用无水乙醇充分溶胀，用纯化
水洗净，装柱（直径１　ｃｍ，柱高１５　ｃｍ），用同上处理的茅莓提
取液上样（上样量相当于生药量１０　ｇ），用纯化水洗至 Ｍｏｌｉｓｈ
反应阴性，分别用２０％，４０％，６０％乙醇洗脱，收集洗脱液，每
１０　ｍＬ为一份，按顺序编号，从每份中吸取０．５　ｍＬ，减压抽
干，采用比色法测定总皂苷量，绘制洗脱曲线，见图２。
图２　不同体积分数乙醇的洗脱曲线
—◆—２０％乙醇；—■—４０％乙醇；—▲—６０％乙醇
Ｆｉｇ　２　Ｅｌｕｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｌｃｏｈｏｌ
—◆—２０％ａｌｃｏｈｏｌ；—■—４０％ａｌｃｏｈｏｌ；—▲—６０％ａｌｃｏｈｏｌ
　　图２显示，茅莓总皂苷主要集中在４０％乙醇洗脱液中，
６０％乙醇洗脱液中茅莓总皂苷已很少。故确定洗脱条件为：
先用纯化水洗去水溶性杂质，再用４０％乙醇洗脱茅莓总皂
苷，收集４０％乙醇洗脱部分。
３．４　茅莓总皂苷精制方法的验证试验　取５　ｇ（干重）Ｄ１０１
大孔吸附树脂，加无水乙醇充分溶胀，用纯化水洗净，装柱
（柱的径高比为１∶１２）。取茅莓提取液１０　ｍＬ（相当于生药１０
ｇ）上柱，流出液皂苷反应阴性，再用水洗至 Ｍｏｌｉｓｈ反应阴性
后，以４０％乙醇洗脱，收集洗脱液，至Ｌｉｂｅｒｍａｎ反应阴性。
减压浓缩、真空干燥，即得茅莓总皂苷。分别测定上柱前后
茅莓样品中的总皂苷含量，结果见表４。
表４　大孔吸附树脂纯化前后茅莓总皂苷的纯度比较
Ｔａｂ　４　Ｐｕｒｉｔｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＳＲＰ　ａｆｔｅｒ　ｍａｃｒｏ－
ｐｏｒｏｕｓ　ｒｅｓｉｎ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
样品名
总固体含量
／ｍｇ
总皂苷量
／ｍｇ
提取物的纯度／％
（以总皂苷计）
上柱前 ２８７　 ８．６　 ２．６
纯化后 ６．２　 ４．０　 ６４．４
４　讨论
本研究中所用的Ｄ１０１型大孔吸附树脂用于皂苷类、苷
类、黄酮类等成分的富集、纯化有较好的效果［７］。与传统中
药制剂工艺相比，应用大孔树脂吸附纯化后的提取物体积
小、不吸潮、容易制成各种外形美观的制剂，可以改变传统中
药制剂粗、大、黑的现象，有利于中药制剂的升级换代，促进
了中药现代化的发展。
茅莓的化学成分，除三萜皂苷外，还含有糖、鞣质、酚性
物质、色素及黄酮苷等，而其主要有效成分茅莓总皂苷含量
约２．５％。本实验样品在上大孔吸附树脂前，于树脂顶端，覆
以脱脂棉少许，加聚酰胺０．５　ｇ，吸附除去少量鞣质、酚性物
质、色素及黄酮苷等杂质，大孔吸附树脂吸附皂苷，用水洗去
糖与无机盐等水溶性成分，最后选用４０％乙醇使总皂苷解吸
附。实验证明采用大孔吸附树脂制备的茅莓总皂苷和正丁
醇萃取法萃取得到的茅莓总皂苷理化指标基本相同，经过药
效学验证，相同含量的茅莓总皂苷药效学无显著性差异。
茅莓总皂苷属于三萜皂苷，由亲脂性的苷元和亲水性的
寡糖链组成，这类皂苷提取方法有２种，一种是采用正丁醇
萃取法，另一种是大孔吸附树脂法。正丁醇萃取过程中需耗
用大量的溶剂；且正丁醇沸点较高，回收困难，不适合大规模
制备。大孔吸附树脂法克服了正丁醇萃取法的缺点，可以在
温和的条件大规模制备。经过含量测定，本研究用２种方法
所得到固体粉末中茅莓总皂苷的含量都大于５０％，均符合中
药新药有效部位的相关要求。其中采用Ｄ１０１大孔吸附树脂
所得到固体粉末中茅莓总皂苷的含量能达到６４．４％。
参考文献：
［１］　王继生，邱宗荫，夏永鹏，等．茅莓总皂苷对大鼠局灶性脑缺血
的保护作用［Ｊ］．中国中药杂志，２００６，３２（２）：１４１－１４３．
［２］　王继生，邱宗荫，夏永鹏，等．茅莓总皂苷对大鼠局灶性脑缺
血／再灌注后神经细胞凋亡及相关蛋白Ｂｃｌ－２，Ｂａｘ表达的影响
［Ｊ］．中国药理学通报，２００６，２２（２）：２２４－２２８．
［３］　任凌燕，李惠芝，王继生，等．茅莓总皂苷的含量测定［Ｊ］．重庆
医科大学学报，２００５，３０（６）：８５４－８５６．
［４］　都述虎，饶金华．大孔吸附树脂茅莓总皂苷富集纯化茅莓总皂
苷工艺研究［Ｊ］．中成药，２００３，２５（３）：１８５－１８８．
［５］　李慧丽，刘信顺．大孔吸附树脂分离出悬钩子皂苷Ｒ１［Ｊ］．中
药新药与临床药理，２０００，１１（１）：３７－３８．
［６］　朱靖宇，宋纯清．大孔吸附树脂在中草药研究中的应用研究
［Ｊ］．中成药，２００１，２３（２）：９１４－９１７．
［７］　王帅，孟宪生，包永睿，等．树脂联用富集与纯化柴胡总皂苷
［Ｊ］．医药导报，２０１１，４：４２３－４２６．
［８］　蔡雄，刘中秋，王培训，等．大孔吸附树脂富集纯化人参皂苷工
艺［Ｊ］．中成药，２００１，２３（９）：６３１－６３４．
［收稿日期］２０１０－１０－１９
·９３１１·中国医院药学杂志２０１１年第３１卷第１３期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，２０１１　Ｊｕｌ，Ｖｏｌ　３１，Ｎｏ．１３