全 文 ：第 3卷 第 1期
1 97 5年 3’ 月
生 物 物 理 学 报
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几种不同条件下竹红菌甲素的光谱特性
王家珍 程龙生
( 中国科学院生物物理所 北京 )
本文报道了不同浓度竹红菌甲素的吸收光谱 。 甲素在不同比例的二甲基亚枫与 HP s E E溶液中
的荧光光谱 , 试验了甲素与几种生物物质的结合 , 说明脂溶性的甲素能与类脂很好的结合 , 甲素
光照后对红细胞膜的损伤大于白蛋白和色氨酸 , 说明生物膜是甲素光敏作用较好的靶 。
竹红菌甲素 ( 以下简称甲素 ) 是我国发现的一种新型光敏化物 , 临床已应用于光化学治
疗一些皮肤病 , 疗效显著 。 安静仪 、 张曼华等 「’ 一 “ ,对甲素的光化学和光物理方面进行了较详
细的研究 , 他们认为甲素不仅是一种有效的光疗药物 , 还是一种新的 、 优良的光敏氧化反应
的敏化剂。 为了弄清甲素对生物细胞的光敏作用机理 , 我们测定了甲素在细胞常用的缓冲液
和溶剂中的吸收光谱 、 荧光光谱和荧光量子产率 。 同时 , 我们选用了红细胞膜 、 大豆磷脂脂
质体 , 白蛋白 、 组蛋白 、 D N A等生物样品与甲素作用 , 测定了甲素与各种不同生物样品结合
后的荧光光谱的变化以及光照甲素对生物样品的光氧化作用。
材料与方法
一 、 试剂 :
甲素由云南微生物研究所提供 , 配制成 2 x 1 0“ “ M 甲素 的二甲基亚讽溶液备用 。
全组蛋白是中国科学院生物物理所生化厂产品 。
牛血清 白蛋白是西德 S E R V A公司产品 。
小牛胸腺 D N A 由本所曹恩华同志提供 。
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公司产品 。
二 、 红细胞腆的制备 与膜蛋白的侧定方法见前文 ”` ’ 。
三 、 大豆礴脂脂质体 (以下简称脂质体 ) : 经超声制成 ,浓度为7 5 m g /川 , 临用时以 10 m M
H E P sE 液稀释 (由本所三宝提供 ) 。
四 、 荧光光谱和吸收光讼的洲定 : 荧光光谱用日立 8 50 荧光分光光度计测定 , 不同 生 物
样品加入甲素后 , 在暗处放置 2 0 一 3 0分钟后测定 ,样品室温度控制在 25 ℃ 。 吸收光谱在日立 5 6
型紫外分光光度计上测定 。
五 、 荧光 t 子产率的刹定 : 甲素的荧光量子产率是以荧光素钠 (溶剂 N o H C O 3 , P H = 9 . 6)
生 物 物 理 学 报 1 98 7年
为标准 , 它的荧光量子产率小1 二 o , 85 , 甲素的量子产率咖按下式计算 , 在激发波长相同条 件
下 , 对稀溶液来说
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分别用 日立 85 0型荧光分光光度计测出试样和标准的真实发射光谱的面积 , 激发波长为 4 6 5n m
用 S P 1 7。。紫外分光光度计测出在波长 4 6 5 n m处试样和标准的吸收 , 然后用 以上公式计 算 出
试样的量子产率 。
六 、 照光条件 : 在 10 m l的烧杯内放 2 . s m l生物样品与甲素作用后 , 在 2 5 Ow碘钨灯下光 照 ,
光强 1 . 3K w / m “ , 样品放冰浴中 , 光源前按装聚光镜 , 并加以流动水层沪去红外线以降 低 光
照时的温度 。
结果与讨论
一 、 竹红 , 甲亲的光漪特性 :
1
.不 同 浓度的甲素在二 甲基亚枫 ( D M S o ) 溶液中的吸收光谱 : 将甲素溶解在 D M S O溶
液中 , 使最终浓度分别为 1 x 1 0一M , 4 x 1 0一 6 M , 4 x 1 0 “ . M , 测定它的吸收光谱。 结果 , 在
可 见光区均呈现三个吸收峰 ,
7 5%
1 0 0%
波长为 4 7 3 一 4 7 5 n m , 5 4 2 n m , 5 5 3 一 s s s n m , 它的吸收峰位 不 随
浓度改变而移位 , 谱形亦无变化 , 只是吸收值
随甲素浓度的增加而增高 (图 1) ,说明甲素在
高浓度下并不形成聚集态 。
2
. 甲 素 在不同比例浓度的溶剂中的荧光
光谱 : 我们将甲素以 5 x 1 0 “ “ M 浓度加入不 同浓
度 比例的 D M S O 一 5 0 m M H E P E S 混合液中 , 结
果如图 2 , 由图中可见甲素在不 同浓度 比例的
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第 l期 儿种不同条件下竹红菌甲素的光谱特性 3吕
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5 0m ME HPE S溶液中荧光光谱无变化 , 峰位无位移 , 仅荧光强度随二甲基亚讽比例的减
少而降低 , 不少作者认为光敏化剂的吸收光谱和荧光光谱可以受溶剂 、 P H 、浓度和温度等因素
的影响 ` 7 一川 , 但甲素在不同溶剂中 , 它的荧光强度与溶剂的电介常数和极性无关 , 而与溶剂
的粘度有关 `名 , 。 由此可见 , 在研究敏化剂与生物分子或细胞作用时需选择适宜 的溶剂 。
甲素在不同 p H溶剂中的荧光光谱 : 我们将 D M S O 一 H E P E s混合液 ( v/ v = 1八 ) 及 1 0 m M 。
H E P ES 液以 N a 0 H和 H CI 分别调成不同 P H条件 , 再加入甲素 , 使最终浓度为 1 0 “ SM , 结果见图 3
由图中可见 甲素在两种溶剂系统中均 以 p H 中性条件时荧光强度最木, 在硷性条 件 下 甲 素
由红色转变成绿色 , 荧光强度降低 , 不同的是甲素在 10 m M H E P E S溶液中 , 在 p H = 9 时 , 原
有 甲素 的发射峰降低 , 在 65 6n m 处的肩峰明显增高 , 当溶液 p H = n 时 , 原有的荧光峰消失 ,
而红移至 6 5 8 n m 处 。 若将此样品随即由强硷条件调回至中性 PH , 荧光谱几乎全部消失 , 同时
测定的吸收谱 , 在强硷条件下 , 它呈现两个吸收峰 , 除原有 4 7 5n m处的最大吸收峰外 , 在 6 3 o n m
处 出现另一较大吸收峰 , 同样将此样品调回至中性后 P H , 由双峰变成仅 5 0 5 n m处的一个单峰 。
3
. 甲 素的荧光量子产率 : 荧光量子产率是光敏特性的重要参量 , 它不仅有助于了解物
质发光的能力 , 还能说明各种不同环境条件对发光物质的影响 。 为此 , 我们选用细胞常用的
缓冲液 , 测定了甲素在此溶液 中的量子产率以及在不 同P H条件下量子产率的变化 。 结果是甲
素在 D M S O 一 l o m M H E p E S混合液中 , p H为 7 . e时 , 量子产率为 0 . 0 2 , 而在 1 0m M H E p E s溶液
中 , P H为 7 . 3时 , 量子产率为 0 . 0 0 2。
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甲素在不同 p H 溶液中的量子产率 见
图 4 。
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由图中可见 甲素在中性 PH条件下量子产率最大 , 其荧光强度也最大。 甲素在苯溶液中的荧光
量子产率为 0 . 09 ` ” , 我们在 50 %的二甲基亚枫中的荧光量子产率为。 . 02 。 看来 , 甲素在不向
溶剂中的荧光量子产率的变化主要是溶剂的影响 。
二 、 竹红菌甲紊对生物分子的光敏作用 :
1
. 甲素对不 同生物分子的作用 : 为了解甲素对生物作用的靶物质是什么 ? 我们选用了红
细胞膜 、 脂质体 、 牛血清白蛋白与脂质体的混合液 、 牛血清白蛋白 、 组蛋白和 D N A等生物样品
与甲素结合后荧光光谱的变化 , 结果见图 5。
从图中可见红细胞膜 、 脂质体和牛血清白蛋白混合后在 37 ℃温育 30 分钟后的混合液和脂质体
与 甲素结合荧光光谱的变化极为相似 , 它们的峰位无位移 , 但它们与甲素结合后荧光相对强
泌 生 物 物 理 学 报 1 08 7年
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度明显增加 , 且随样品浓度的增加而递增 , 其中以脂质体增加的百分率最高 , 如在 20 。“ g / m l
浓度的样品组中 , 甲素一脂质体结合荧光峰强度与不加脂 质 体 的 甲 素 荧 光 峰 强度 相 比
增加了2 56 % , 甲素一脂质体 、 白蛋白结合峰增加了 2 16 % , 甲素一红细胞膜结合峰增加了 135
%
, 但甲素一白蛋白结合峰 , 甲素一组蛋白结合峰和甲素一 D N A结合峰的荧光光谱除它们的
峰位无变化外亦不随生物样品浓度的改变呈规律性变化 。 同时以激发波长为 2 8 0 n m测定的 内
源蛋白荧光强度都随生物样品浓度的增加而递增 , 从荧光光谱的这一结果来看 , 可能是由于
甲素为脂溶性光敏化剂 , 它易与类脂结合 , 因此它与脂质体 、 脂质体与白蛋白混合物和红细
胞膜作用后 , 它们的荧光强度随生物样品浓度的增加 , 即甲素与类脂结合的增多而增高。 但
甲素与单独的生物蛋白和 D N A作用后 , 未能观察到它们的结合作用 。
2
. 甲素 对生物样品的光敏化作用 : 蛋白内源荧光主要来自色氨酸 、 酪氨酸 , 同时也可
反应它们环境的变化 。 我们观察了含有 1 0 一 ` M甲素的红细胞膜 、 白蛋白和色氨酸 , 经光照 30
分钟后 , 它们的蛋白内源荧光的变化 , 结果见图 6 。
它们的荧光强度分别下降了90 % 、 72 % 、 31 % , 其中以膜蛋白的内源荧光下降最为显著。 甲
素对红细胞膜蛋白的光氧化 , 不仅使色氨酸 、 酪氨酸光氧化 。 还引起组氨酸 、 半胧氨酸的光
氧化 ”` , , 因而使膜蛋白结构发生变化 , 致使荧光强度明显下降 , 而白蛋白中氨基酸的成份与
膜蛋白不 同 , 因此荧光强度下降的程度不同。 当生物样品与甲素作用而不受光照 , 同样也有
荧光强度的下降 , 它们分别下降了45 % 、 34 % 、 20 % , 说明甲素与生物蛋 白之间发生了相互
第 1 期 几种不同条件下竹红菌甲素的光谱特性 37
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作用 , 而光照加剧了它们的作用 , 其中对红细胞膜的光损伤最为严重 , 说明生物膜是甲素光
敏作用的可能靶物质 。
今考文做
〔 1 〕 张曼华、 安静仪 , 倪志杰 , 蒋丽金 : 《科学通报》 2 。 ( 1 8 ) 19 84 , 1 1 17
〔 2 〕 安静仪 、 张曼华 、 刘景瑶 、 蒋丽金 : 《科科通报》 3 0 ( 1 8 ) 1 9 8 5 , 1 3 9 7
〔 3 〕 安静仪 、 张受华 、 吴国永 、 刘景瑶 、 马桂珍 、 蒋丽金 : 《 中国科学》 (B 辑 ) 1 1 , 1 9 8 5 , 9 75
〔 4 〕 刘景瑶 : 《 科学通报》 3 0 ( 14 ) x o s s , 10 7了
〔 5 〕 刘景瑶 、 张受华 、 安静仪 : 《 感光科学与光化学 》 l , 1 9 8 6 , 3 6
〔 6 〕 程龙生 、 王家珍 : 《实验生物学报 》 1 8 ( 丈) , 10 5 5 , 89
〔 7 〕 K e s s e l , D . , R o s s i , E . : P h o t o e h e m . P h o t o b i o l . , 3 5 , x 9 8 2 , 3了
〔 s 〕 M o a n , J , , S a n d b e r g , 5 . , C五 r i s t e n s e n , T . , a n d E l a n d e r , 5 . : H e m a t o P 0 r P h y r i n d e r i , a t i , e : C h e -
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p h o t o 一 c 五e m i c a l a n d p h o t o 吕 e n s i t i z i n g P r o P e r t i e s , i n p o r p h y x i n P h o t o s e n s i t i : a t i o n
( E d i t
e d 卜y D . K e . s e l a n d T . J . D o u g h e r t y ) , p l e u m p r e s s , N e w Y o r k 19 8 3 , 16 5一 17 9
〔 。 〕 M o a n , J . : P h o t o e h e m . P h o t o b i o l . , 3 9 , 19 8 4 , 4 4 5
〔10〕 K e s 一。 l , D . , K o五n , K . L . : C a n e e r R e s . , 4 0 , 19 8 0 , 3 0 3
〔1 1〕 R i e o h e l l i , F . , G r o s s , e i n e r , L . I . : P h o t o e h e m . P五 o t o b i o l . , 4 0 , I , 8 4 , 5 ,。
〔一2〕 M a r g a l i t , R . , S h a k l a i , N 二 a n d c o 五e n , s · : B i o e h e m . J . , 2 0 9 , 1 9 8 3 , 54 7
本文 19 8 6年明 7日收到
3 8 生 物 物 理 学 报 x9 8 7年
T H E S PE C T R L C AH R A AC T E R I T I Z AO N O FH Y O C PR E L L IN A
AN D T H E IN T E R T I AO N B E TW E E N H Y PO C R E L L IN A
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n s t i t u t e o f B i o P h夕 s i c s , A e a d e 小宕a S f n i e a , B e `j f n 夕 , C h f路a )
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n o t s u b je c t e d t o c h a n g e P r o v i d e d t h e P H v a l v e 15 k e p t c o n s t a n t
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I t s q u a n t u m y i e l d s v a r y i n d i f f e r e n t
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