全 文 ：第 2卷 第 l期
1 9 56年 3月
生 物 物 理 学 报
A T CA B1 0Y P HSC IA S IN ICA
V o l
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2可。
M
a r. 1 9 8 6
粉防已碱与钙调蛋白相互作用的
荧光光谱研究
徐友涵 陈雄 伟
(南开大学 分子生物所 )
宋玖雪
(南开大学生 物系 )
摘 要
粉防已碱 T e t是一种新的钙调蛋白 ( ca M)拮抗剂 , `已抑制c a M活化的 e a , + 一M g , `一 A T P , . 。 。
利用丹磺酞钙凋蛋白 ( D一 C o M )可方便地鉴测 T et 与aC M 的相互作用 , 直接证明了在 aC M与 T e t
之间生成复合物 c o M一 T e t
我们制备的 D一 C o M , 每个蛋白分子含 1 . 3 个丹磺酞基团 , 活化红细 胞膜 c : ” ’一M g , `一
A T P 二 。的生物活性与天然C : M基本相同 .
当C 。 ” `与 D一 C o M结 合时 , 丹磺酸基团环境疏水性增加 , 浪荧光团产生较高的量子产主 (增
加 1 . 6倍 ) , 最大发射兰移 G 饰 1 2 n m 移兰至 49 5n m ) . 存在 aC Z` 时 , eT t使D一 C a M 的荧光强度
进一步增加 , 谱线继续兰移 . 表明 c : , `及 T e t诱导蛋白构象变化 , 改变了丹磺酞基团的微环境 .
荧光滴定实验证明ca M与T e t结合的解离常数为 1 . 8拼M , 两者的结合是绝对依赖 ca , , 的 .
药物 T e t与 C a M的结合可增强结合在 ca M 上的芡光探剂 N P N的荧光 , 提示 aC M 不同疏水结
占泣之间存在变构价I互 作用 。
钙调蛋白 (C a M )是一 种厂`泛分 介J’ 、 多功能的依赖 c 。 : + 的调 节蛋白 , 它 能活 化 许多依
赖 aC Z十 的酶 , 如 环核昔 酸二醋酶 、 肌球 蛋白轻链 激酶 、 腺昔酸环 化酶 和 aC , ` 一 M g+2 一
A T P
. , 。 。 ’臼的性质与功能 已有许 多综述 l ” , LZ , , `3] 。 某些疏水性药物如吩邃嗓 、 蔡磺酞胺可
依赖 c : “ + 结合在c a M 上 , 抑制 c a M 靶酶的活化 〔` ’ 。 最近 , 砌们曾报导粉防己碱及其类似物
山豆很碱能拮抗 aC M , 抑制 aC M刺激的 C a “ + 一 M g , 十一 A T P , , 。 。 本文用荧光光谱研究粉防已
碱与 aC M 的相互作用 , 丹磺酞钙调蛋白 ( D一 aC M ) 可方便地用于这种研究 。 结果证明 C。 M
与粉防已碱结合形成复合物 , 结合过程是依赖 aC Z十的。
材料与方法
试剂均采用分析纯 , 粉防己碱由金华制药厂赋予 , N P N 从乙醇中重结品二次 。
本文采用的缩写 : 丹磺 酸钙 调蛋 白 ( D一 c : M ) , 扮防已碱 ( eT )t , N一苯基一 卜蔡胺 ( N P N) . 三氛拉峰
( T F P )
, 环核普酸磷酿二脂酶 ( P D E )
生 物 物 理 学 报 ,。 8 6军
钙调蛋白从牛脑中纯化 , 按 K a k i u e h i 方法 ’ 6 , 。 丹磺酸 C a M ( D一 C。 M )制备方法如下 :
8小` l 浓度 2 . 2 m g /m l 丹磺酞氯 ( is g m a公司产品 )丙酮溶液慢慢加到 4 . s m l浓度 1 . o m g / m l的
C a M缓冲溶液中 ( l o m M M o p s , g o m M K C I , Zm M C a Z + , p H 7 . 0 ) , 室温下保持 z 6 h r后 , 离心去除
未反应 的标记物 , 样品在 4 ℃下透析 z 4 il r (对 z o m M T r i 。一 H c王 P H了. 0 , o , IM K c l , 夕m 人I
E G T )A
, 再进一步对重蒸水透析 24 hr 。 蛋白浓度测定按 L 。 w r y法 `7 , 。 ca M 渗入的丹磺酚基
团的克分子浓度依照测定 3 4 0 n m的吸收度来测定 【` ’ 。
荧光光谱研究使用岛津 R F54 荧光分光光度计。 对 D一血 M , 激发光 3 4 o n m , 激发狭缝
s o m , 发射狭缝 1 0n m , 荧光滴定在必需时进行稀释因子校正 。 可见紫外吸收光谱测定用岛
津 u v 一 3 0 型分光光度计 。
人红血球膜 aC “ + 一M g Z十一 A T P : , 。的制备以及酶活性测定方法均按前述 `5J 。
实 验 结 果
天然c a M与丹磺酞 aC M 的吸收光谱见图 1。 牛脑 ca M含 8个苯丙氨酸 , 2个酪氦酸残基 ,
它的紫外吸收谱在 2 5 0一 Zs o n m 区域出现 5 个峰 , 在 2 5 3 、 2 5 5 、 2 6 5 、 2 6 9处 的吸收峰相应于
苯丙氨酸吸收带的精细结构 , : : 6刀 m 处的最大吸收 ( E舞岔` 一 。 . : 。 )相应于 酪、 酸的振动
结构。 丹磺酸 C o M 吸收谱在 3 3 4 n m 处出现的吸 收峰相应于蛋白付价键结合着的丹磺酞基
团 。 依照 D一 C a M在 3 4 o n m 消光系数为 3 4 0 0 e m 一 ’ · M 一 ` 计算 【8 , , 在我们实验 条件 下制备的
D一 c a M平均每个蛋白分子含 1 . 3个丹磺酞基
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C a M ( n M )
图 1 天然与丹磺酞 C a M的吸收光谱
F 19
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1 A b s o r P t i o n s P e e t r a o f n a t i V e
图 2 天然 C 。 M与D一C a M活化人红细胞膜
C
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C a M (一 ) : e o n e e l t r a t i o n 2 . 0
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D ~ C a M ( 一一 )
第 1 期 料防已碱与钙调蛋 白相 互作用的荧光光谱研究 3
iF g
.
2表示天然 Ca M 与D 一 C a M生物活性 的比较 (依照它们活化 C a Z日一 A T P . ,能力 ) , 丹
磺酞基团挂在 aC M 上 , 并不改变它的活化能力 , D一 aC M 与天然 的 aC M 一样可 完全 活化
C a , + 一 M g Z ` 一 A T P… 半活化浓度只有 很小的变化 ( 天然与 D一 aC M 的半活化 浓度 分别为
7n M和 gn M ) , 从这些方面看 , 丹磺酸钙调蛋 白是研究 aC M与其拮抗药物相互作用的适宜的
材料 。
aC
, 十粉防已碱对 D一 ca M荧光光谱的影响 : 当对照存在 。 . l m M E G T A 时 , D一 aC M 的
荧光谱峰值在 5 12n m 。 而体系存在 0 . l m M ca Z ` 时 , 峰位兰移至 4 9 5 n m , 4 9 5 n m 处的荧光强
度增加 1 . 6倍 ( iF g . 3谱线 A 、 C ) 。 当 1 0, ` M T e t滴加入 C a Z` 一 D一 aC M体系中 , 荧光强度与荧光
峰位都进一步发生变化 : 荧光峰位兰移至 4 8 4 n zn , 荧光强度增加 5 0% ( iF 邵 , 谱 )D 。如 eT t滴
加入无 C a “ + 的 D一 aC M 对照体系中 , 荧光谱不发生可检测到的变化 ( iF g3 , )B , 说明在含
E G T A溶液中 , T e t与 D一 aC M之间没有相互作用 , 药物与 aC M 的结合是绝对依赖 aC 旦十的 。
荧光滴定可方便地用于检测 D一 aC M与配体的相互作用 。 不 同量的 eT t依次滴加至d2, ` M
D一 ca M 缓冲溶液中 ( 0 . l m M aC 之十 存在 自 , 荧光强度增加50 % , 谱线继续兰移 1 1 o m , 荧
光半最大增长 M(一艺 ) 的值为 4 o M ( iF g . 4) 。 当用 T e t 滴定较低浓度的 D一 aC M 时 , 药物 与
C a M 的表观亲和性增加 , 例如滴定 。 . 2 5, 全 M D一 aC M , M万 值大约为 2/ 之 M 。 顾序在 2 、 1 、`
1 0 (
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图 3 C 。 , 辛 、 T e t对 D一 e a M荧光光谱的影响
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图 4 T et 对 D一 aC M 荧光增强效应
F i g
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4 T h e f l u o r e s e e n e e i n e r e a , e
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e t o n D一 C a M f l u o r e s c e n e e .
T h e P e r e e n t a g e o f t h
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: 。 · 5尸M ,一 “一 o · 2 5召M . (近纵坐标曲线 )
生 物 物 理 学 报 1 5 0。年
。 · 5、 。· 2 5 , ! M D一 c a M 溶液 中进 行 T · t 、 光滴定 , 警值 对 D一 c · M 浓度 作图 , 参 照
G o h n s o n的方法 l ” ,可计算出 T e t与 C a M结合 的解离常数 K d约 1 . 8 , ` M 。
粉防已碱和疏水性荧光探剂与 aC M的相互作用 : 当 aC 之+ 结合到 aC M的 C o Z+ 结合位时 ,
aC M发生构象变化 , 暴露出的疏水位点可结合某些荧光探剂 ( 如 A N S 、 T N S 、 N P N ) , 使后
者的荧光量子产率有很大 的增加 , 谱线也发生兰移 ! ’ 。 ’ , 利用荧光 探剂 N P N , 表明当存在
C a ’ 十一 C a M时 , 其荧光强度增加 s 倍以上 ,荧光谱峰位从 4 3 0 n m 兰移至 4 1 5 n m ( F i g . 5 ,谱线 A 、
B )
, 如滴加 T e t , 荧光量子产率进一步增加 ( iF g . 5 ,谱线)C 。 如果体系 中存在 E G T A , 则
无论 c a M或 T e t都不引起 N P N 荧光谱线发生变化 , 也证实荧光探 flJ 和药物 与C a M的结合都是
依赖 C a 之十 的过程 。
若用 T e t依次滴定 O。 25 2 ` M C a M一 1 2` M N p N , 0 . l m M C a Z 干 (缓冲液 )体系 , 4 10 n m 处荧光
入I强度的增加对滴入的 T e , 浓度作滴定曲线 , 可求出 一寸值为 2二“ M ( F `g · “ ), 与 T e , 滴定 D一
c a M所得结果一致。 同时 , 滴入高浓度 eT t , 荧光强度达到饱和值 , 而 未 见 下降 , 说明即
使 高浓度 T e t也不能竞争取代出C a M所结合的 N P x 。
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图 5 T e t影明 C a 入I一 N p N沐不的 竹光 , i放
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e n e e e n h a n e e m e n t a n d b l u e s h i f t i n 只m a x .
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图 6 T e t 弈 :` 一 c 。 M一 N P NI 仁系fJ] 处
尤 {勺滴定曲线 ,激 `伦波 {几3 5 0n m
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0 f C a M一 N P N s y s t e m w i t h T e t . e x e i t a t i o n
w a v e l e n g t h 3 5 0 n m
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4
第 1期 料防已碱 与钙调蛋 白相互作用的荧光光谱研究
讨 论
D一 c a M有很独特的荧光性质 , 其荧光量子产率对 aC Z + 、 aC M拮抗剂或 aC M结合蛋白敏
感 。 我们制备的 D一 aC M , 大约每个蛋 白含 1 . 3个丹磺酞 基团 , 显著高于 iK cn a id 制备的
D一 ca M (约 o 。 4一 0 . 5丹磺酣 aC M 分子 ) 「川 , 这可能是由于我们制备 时采用较 长的反应时间 , 引起较多的丹磺酞基渗入aC M分子 中。 aC M丹磺酸化的衍生物仍基本上具备 aC M 的生
物活性 , 可完全活化依赖 aC M的红细胞膜 aC Z十一 M g “ + 一 A T P … 。 因此它很适于用荧光谱研
究C a M与配体的相互作用 。
c a Z
十结合到 D一 C a M 后 , 由于肤链构象的变化 , 丹磺酞基团微环境的疏水性增加 , 产
生较高的量子产率及荧光谱峰值的兰移 。 当 eT t加到含 aC Z 十的 D一 aC M体系中 , 此效应得到
进一步增强 , 这反映了T e t与 aC M 结合生成复合物后 , 蛋白肤链构象发生变化 。 aC M 靶酶
P D E及 C a M结合蛋 白如神经钙蛋白 ca l c in e u r in 在与 D一 aC M 结合后增加丹磺酞基团的荧光
强度及荧光峰位兰移 厂’ 。 , , 表明这些配体 与 aC M 的结合将 引起肤链构象发生变化 。 使用外
源荧光探剂 N P N 的研究也得到同样的结果 。
在 C a Z十存在下 , 滴加 T e t 显著增强 aC M结合的 N P N 探刘的荧光 , 暗 示eT t和 N P N 分别
结合在 C a M不同的疏水位点上 。 同时也表明 T e t与 C o M结合后 , 通过变构 ,增强 C o M与 N P N 的
结合 ( C a M结合 N P N的数 目或亲和性增加 ) , 从而增加 N P N 的荧光 , 这是钙调蛋自的不 同
疏水位点之间存在强烈变构相互作用的一个直接证据 。
心血管药物异博定 、 rP o a id f e n 与 C a M 结合时 , 曾观察到类似的现象 !” ’ 。 相反 , 一种
常用的 C a M 拮抗剂— 三氟拉嗓 ( T F P )l 于N P N 竞争结合在 aC M 同一位点上 , 从而减弱了N P N 的荧光 “ z 〕 , 说明不 .同类型的 aC M拮抗剂可结合在 aC M的不同疏水位点上 。
某些 e a Z ` 拮抗剂 、 C a M拮抗剂结合到 C a M后 , 增强了 C a M与 f e l o d i p i n e 的结合 l ’ “ , , 也
说明C a M的几个不同疏水结合位点之间存在变构相互作用 。 C a M疏水位点结合配体 ( C : “ 十拮
抗剂 、 aC M 拮抗剂 、 aC M结合蛋白等 )后 , 将引起蛋白肤链构象的变化 , 使 aC M 对它可活
化的众多的靶酶具有识别的功能 t ’ 3’ 。
参 考 文 暇
〔 l 〕 C h e u n g , W . Y . S e i e n c e Z 〔 7 , 1 9 ( 1 9 80 )
〔 ? 〕 M : r 二 。 , D . B i o l o g i e i n u n s e r 。 r Z e i t 3 , 了1 (一。 s 一)
〔 3 〕 徐友涵 , 生 物化学 与生物物理进展 2 , 17 ( 1 9 3 5 )
〔 4 〕 徐友涵 , 国外医 学 (分子生物学分册 ) 3 , 1 1 6 ( 1 9 8 5 )
〔 5 〕 徐友涵 , 倪基德 , 科学通报 1 7 , 1 3 48 ( 1 9 5 5 )
〔6 〕 K . l i u e h i , S , e t a l . F E B S L o t t e r 1 2 6 , 2 0 3 ( 1 9 8 1 )
〔 7 〕 L o 、 r y , 0 . H . , e t 一 l . J . B i o l . c ` e 二 . 19 5 , 2 6 5 ( { 9 5 1 )
〔 s 〕 c 五e n , R . F . A n : l . B i o e ` e m . 2 5 ,引 2 ( 1 99 5 )
〔 g 〕 J o h n o o n , J . D . e t a l . B i o e h e m . J . Z l l . 4 7 3 ( 1 9 8 3 )
〔1 0〕 L 一 p o r t e . D . C . e t : l . B i o e h e m i s t r y 19 . 3 8 14 ( 1 0 8 0 )
〔 1 1〕 K i五e a i d , R . L . e t a一 J . B i o l . c h e m . 2 57 , 1 0 6 5 5 ( 1 9 5 2 )
〔 1 2〕 E p s t e i n , p M . e t a l . B i o e h e 二 . B i o P h y “ . R e , . C o m m u n . l o s , 1 1 4 2 ( 1 9 8 2 )
〔 1 3〕 J o h n s o n . J . D . e t a l . B i o e h e m . B i o p h y s . R e , . C o 二 。 、 t n . 1 1 2 . 7 87 ( 1 0 8 3 )
木文 1 9 8 5年 3月 ? 日收到
木项科研 得到 天津市科学技术委员会研究基金的支持 ,
生 物 物 理 学 报 l , 8 6年
T H E I N T E R A C T I O N O F T E T R A N D R I N E 、V I T H C A L 入1 0 D U L I N
A F L U O R E S C E N C E S T U D Y
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T e t r a n d r i n e 15 a n e w e a l m o d u l i n ( C a M ) a n t a g o n i
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P r o v i d e a e o n v e n i e n t a n d s i m P l e m e a n s o f m o n i t o r i n g t }l e i n t e r a e t i o n o f t e t 、 、 i t h
C a 入1 . T h e d i r e e t e v i d e n e e t h a t s h o 、 、 5 t h e C a Z 十 一 d e p e n d e n t f o r m a t i o n o f e o m P l e x
C a M 一 T e t w a s o b t a i n e d 。
O u r D 一 C a M p r e p a r a t i o n c o n t a i n e d a p P r o x . 1 . 3 m o l o f d a n s y l P e r m o l o f C a 、 I
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i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m n a t i v o C a M 111 t l z e i r a b i l i t y t o a e t i v a t e
t h e h u m a n e r y t h r o e y t e C a Z 十 一 M g Z ’ 一 A T p a s o .
U P o n b i n d i n g o f C a Z + t o C a M t h
e h 》, d r o P h o b i e i t y o f t h e e n v i r o n m e n t o f t li e
d a n s y l g r o u p W a s i n c r e a s e d P r o d u c i n g a h i g ll e r q u a n t u m y i e l d o f t h e f l u o r o P h o r e
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i n t h e 只m a x 。 o f e m i s o i o n s P e e t r u m ( f r o m s l Z n m t o
W h e n t
e t w a s a d d e d t o D 一 C a M i n t }z e P r e s e n e e o f C a Z + t h e f l u o r e s e e n e e
i n t
e n s i t y w a s f u r t h e r i n C r e a s e d a n d b l u e s h i f t i n s p o c t r o m 、 v a s m o r e e v i d e n t .
T h e s e f a e t , r e v e a l e d t h a t t h e C a Z
+ a n d t e t 一 i n d 、一e e d e o n f o r m a t i o n a l t r a n ; i t i o n
e a u s e d a e l l a n g e i n t h e m i e r o s u r r o u n d i n g o f t圣, 。 d a rl s ,, 1 g r o l l P .
T h e f l u o r e s e e n e e t i t r a t i o n s h o 、 v e d t h a t C a 、 I h 。 [ ; n 〔1 t e t 、 、 i t l l a K d Y a l t l e o f
1
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8 1 `M . T h i s b i n d i n g 15 a b s o l u t e l y C a Z干 一 d e p e n d e n t .
T h e a o s o c i a t i o n o f t e t w i t l, C a 入1 e a n P o t e n t i a t e f l u o r o 3 c e n c e p r o b e ( N 一 p h e n ,一 I
一 1 一 N a P h t h》· l a m i n e ) b i n d i n g t o C a入I· T h e s e s t u d i e s : t; g g e s t t h a t a l l o s t e r i c i n t e r -
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o n o c c u r a m o n g d i f f e r e n t h y d r o p h o b i C b i : z d i n g s i t e s o n C a 、 1 . A b b r e v i a t i o n s :
C a M f
o r e a l m o d u l i n
,
T e t f o r t e t r a l l d r i n e
.
4