全 文 ：JOURNAL OF BEE（Monthly）蜜蜂杂志 (月刊)2014年第 11 期
收稿日期：2014- 09- 16
资助项目：国家现代蜜蜂产业技术体系（CARS- 45- kxj 1 4）。
作者简介：王淼，男，1973.6，副教授，在读博士，从事蜜蜂产品及微生物研究，E- mai l：ynbee@163.com。
通讯作者：和绍禹，E- mai l：kmhsy@163.com。
●实验研究报告
基于 16s rDNA序列分析冬樱花花期蜜囊细菌多样性
王 淼 1,2，赵文正 2，徐 鸿 2，尹革芬 3，和绍禹 2
（1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学东方蜜蜂研究所，云南 昆明 650201；
3.云南农业大学动物科学学院，云南 昆明 650201）
摘 要：对昆明冬樱花花期东、西方蜜蜂蜜囊细菌进行分
离、纯培养；并对分离菌株的 16s rDNA基因片段进行扩增和
测序，序列比对后进行系统发育分析。结果表明：东方蜜蜂蜜
囊细菌包括 3个纲中的 10个种，西方蜜蜂蜜囊细菌包括 3个
纲中的 13个种，花蜜细菌包括 4个纲中的 6个种，所采集样
品除 Baci llus subt i li 相似以外，其余菌种差异较大。
关键词：蜜囊；冬樱花；16S rDNA；系统发育分析
中图分类号： 文献标识码：A
文章编号：1003-9139（2014） 11-0009-04
Diversity of bacteria in the honey stomach in
blooming period of Cerasus serasoides by 16S
rDNA Sequence Analysis
WangMiao 1, 2, ZhaoWen-zheng 2 , Xu Hong 2, Yin
Ge-fen 3, He Shao-yu 2
（1. Plant Protect College, Yunnan Agricultural
University, Kunming 650201, China；2.EasternBee
ResearchInstitute, Yunnan Agricultural University,
Kunming 650201, China；3. College of Animal Science
and Technology, Yunnan Agricultural University,
Kunming 650201, China）
Abstract: In the period of blooming of Cerasus serasoides,
Bacteria were isolated and cultivated to obtain pure isolates in the
honey stomach of Apis cerana and Apis mellifera. The isolates were
compared and constructed phylogenetic analysis, based on 16s
rDNA sequences amplification and sequencing. The results
suggested that the honey stomach of Apis cerana contained 10
bacterial species from 3 class, in comparison, the honey stomach of
Apis mellifera contained 13 species from 3 class and nectar
contained 6 species from 4 class. Except common bacteria Bacillus
subtili，bacterial diversity in honey stomach is obvious difference
between Apis cerana and Apismellifera.
Key words: honey stomach, Cerasus serasoide,16s rDNA,
phylogenetic analysis
工蜂的消化系统内的蜜囊，是食道的膨大部分，
位于蜜蜂消化道前端，具有弹性薄膜，是食物的临时
贮藏场所，工蜂装满一蜜囊，平均可带回 40 mg花
蜜，最高可带回花蜜 70~80 mg ［1］。由于蜜蜂采集花
蜜与消化液混合存于蜜囊，相对环境开放，其细菌多
样性受花蜜和蜜囊土著细菌的影响。在采集过程中，
混合于蜜囊中的细菌也会受到花蜜、蜜囊土著细菌种
类和数量的影响 ［2］，因此，研究蜜囊中细菌的多样
性，可以为进一步研究和控制蜂蜜酿造过程中细菌来
源提供前期的数据支持。
冬樱花(Cerasus serasoides（D.Don） sok.)又名冬海
棠，为蔷薇科(Rosaceae)樱桃属(Prunus)植物。花期 11
月至翌年 1月，云南为主要分布区［3］。冬樱花具有蜜
腺，能够分泌花蜜。花蜜以糖类为主，并含有多种物质
成分［4］。结合冬樱花期，对蜜蜂蜜囊细菌多样性进行
研究，在了解冬樱花花蜜可培养细菌种类的同时，可进
一步分析蜜囊细菌受冬樱花花蜜的影响程度。
1 材料和方法
1.1 材料和采集条件
材料：东、西方蜜蜂工蜂；冬樱花花蜜。
采集地及条件：云南农业大学校园内；冬樱花盛
花期，东、西方蜜蜂试验蜂场；无菌条件下采集出勤
蜂和采集蜂，对蜜蜂进行表面消毒 30 s后，立即在
无菌水中处理 1 min，蜜囊在无菌箱内进行无菌切除，
10只蜜囊为一个样本，各采集 3个蜂群。蜜囊采样
液为 10 mL无菌生理盐水，含有 0.9% w/v氯化钠、
0.1% w/v吐温 80和 0.1% w/v蛋白胨。油菜花花蜜采
用无菌毛细管收集指无菌离心管。所有样品采集后立
即分离或对剩余样品立即冷冻，储存于 - 20℃，在 2
个月内分离完成。
1.2 细菌培养和分析
采用胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基和乳酸菌琼脂
培养基（MRS）；培养方法：好氧培养 37℃ 2~3 d和
厌氧培养 37℃ 3~4 d，采用厌氧罐 anaerocult（Merck,
Darmstadt,德国） 进行厌氧培养；从含有 30~300个菌
落的平板随机选择了 5~20个培养特征不同的菌落，
进行纯培养，获得纯种；
1.3 DNA提取和 PCR
离心收集 0.1~0.3 g细菌菌体，使用 Tianamp 细
菌 DNA提取试剂盒以及相应试剂 Taq 酶、溶菌酶、
蛋白酶 K(购自北京天根生物技术公司)提取纯 DNA；
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蜜蜂杂志 (月刊) JOURNAL OF BEE（Monthly） NO.11 2014 Nov.
表 1 东、西方蜜蜂蜜囊和花蜜的细菌类型
Table1. Bacterial phylotypes from the honey s tomach of A. cerana and A. mellifera and nectar
样 品
Samples
分离株
Isola tes a
相似菌株
Mos tclosely rela ted type s tra inb
登录号
access ion numbers c
相似序列长度及相似度
Sequence lengths and similarityd
东方蜜蜂蜜囊
Honey s tomach of Apis
cerana
ACHSOK320 Xant homonas t ranslucens st rainJ92 JX976312 854/880(97%)
ACHSOK341 Ent erobact er asburiae st rain KNUC5007 JQ682630 1137/1141 (99%)
ACHSOK345 Ent erobact er hormaechei st rain WW2 JN993998 1280/1281 (99%)
ACHSOK372 Baci llus subt i li s st rain GLMP6 KF364495 1305/1305(100%)
ACHSBK361 Ent erobact er cloacae st rain C- G- PDA4 HM755652 1263/1264(99%)
ACHSBK362 Leclercia adecarboxylat a st rain EG88 KC122711 1278/1279(99%)
ACHSBK332 Baci llus subt i li s st rain SBT- 014 KF601955 1299/1299(100%)
ACHSBK333 Lut eibact er ant hropi st rain NSBm.1 (YC1 ) JF708869 1265/1293(98%)
ACHSBK335 Ent erococcus faecali s st rain 1 85(MBC(B)) KF254551 1300/1301 (99%)
ACHSBK381 Saccharibact er f lor i cola st rain S- 877 NR024819 1162/1217(95%)
ACHSBK382 Pect obact er ium cypripedi i st rain EH59 GU339286 1242/1270(98%)
花蜜 Nectar
NPKM355 Pant oea vagans st rain - Y14 JX077090 1284/1288(99%)
NPKM356 Pant oea ananat i s st rain Hb- 9 KC139412 1244/1246(99%)
NPKM360 Agrobact erium larrymoorei st rain 13638E EU741094 1221 /1221 (100%)
NPKM376 Microbact er ium hominis st rain 1P10AE EU977655 1240/1243(99%)
NPKM377 Baci llus subt i li s st rain SBT- 014 KF601955 1285/1285(100%)
NPKM378 Pseudomonas psychrot olerans st rain - Y42 JX094949 1217/1219(99%)
西方蜜蜂蜜囊
Honey s tomach
AMHSOK347 St aphylococcus epidermidis st rain 72(br3) KF254619 1310/1311 (99%)
AMHSOK349 Baci llus aryabhat t ai KJS17 HG424432 1306/1306(100%)
AMHSOK351 Ent erobact er asburiae st rain KNUC5007 JQ682630 1254/1260(99%)
AMHSOK392 Pect obact er ium cypripedi i st rain ICB409 HM013841 1237/1267(98%)
AMHSOK398 Baci llus amyloliquefaciens st rain M14 KC855269 1276/1277(99%)
AMHSOK400 Enhydrobact er aerosaccus st rain Sco- C03 FN386747 1247/1247(100%)
AMHSOK406 Saccharibact er f lor i cola st rain S- 877 NR024819 1180/1235(96%)
AMHSBK317 Agrobact er ium larrymoorei st rain EG27 KC122702 1065/1067(99%)
AMHSBK364 Pant oea vagans st rain - Y14 JX077090 1249/1257(99%)
AMHSBK366 Alpha prot eobact er ium BCC25710 AB513363 1224/1229(99%)
AMHSBK367 Pect obact er ium cypripedi i st rain ICB409 HM013841 1232/1261 (98%)
AMHSBK386 Sphingobium yanoikuyae st rain T1BP11 JF459936 1227/1227(100%)
AMHSBK387 Rhizobium giardini i st rain MC- ARA- L6 HQ263115 1229/1239(99%)
AMHSBK388 Baci llus subt i li s st rain SBT- 014 KF601955 1297/1299(99%)
备注：a通过16srDNA序列鉴定的菌株；b相似菌株：通过NCBI比对后确定的相似菌株 c相似菌株登录号；d最接近的相似菌株序列长度和百分率（括号中）
PCR引物：16S rDNA基因序列扩增引物由上海生工
生物有限公司合成，引物序列如下： 正向引物 27F
(5- AGAGTTTGATCCTGGC TC- 3)，反向引物 1387R
(5- GGGCGGTGTGTACAAGGC- 3)。
PCR (MJ, Research, T100TM Thermal Cycler;
Bio- Rad Co., Hercules, CA, USA)反应条件: 94℃预变
性 5 min；94℃变性 30 s，58℃退火 60 s，72℃延伸
90 s，共 30 个循环；72℃延伸 7 min；4℃保存。反
应体系总体积为 50μL，其中包括 DNA模板 4μL、
正、反向引物各 0.2μL、2×TransTaqTM II HiFi PCR
SuperMix II（购自北京天根生物技术公司） 25.0μL、
ddH2O 20.6μL。
1.4 测序和系统发育分析
使用引物 27F和 1387R对 PCR产物进行双向测
序（上海生工生物科技有限公司），正、反向序列经
过人工校正、修剪后生成一致序列。将结果与 NCBI
的 GenBank 数据库进行 Blast 比对 ( http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/ )，获得相似菌株登录号、相似长度和相
似度。使用 Bioedit软件的 Clustal- W算法进行 Align-
ment 计算，计算各条序列间的距离矩阵，利用
MEGA5.0 软件采用 Neighbour- Joining 法 （邻接法）
构建系统发育树， Bootstrap 值设置为 1000，用
Kimura双参数距离进行运算。
2 结果与分析
2.1蜜蜂蜜囊和花蜜细菌类型及比较
选择 85株培养特征和表现型不同的菌株进行纯
化培养，通过 16S rDNA基因序列鉴定，共有 11 种
不同的表现型菌株，选取 31株具有代表的菌株，通
过比对与 GenBank 中相似菌株相似度 >95% （见表
1）。通过表 1可以看出，东方蜜蜂蜜囊细菌包括 3个
纲中的 10个种，西方蜜蜂蜜囊细菌包括 3个纲中的
13个种，花蜜细菌包括 4个纲中的 6个种，所采集
样品除 B. subtili相似以外，其余菌种差异较大。
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JOURNAL OF BEE（Monthly）蜜蜂杂志 (月刊)2014年第 11 期
系统发育树分析表明，在 4个簇中，γ- 变形菌
纲包括 3个目下属 11个不同种，α- 变形菌纲包括
3个目下属 5个不同种，放线菌亚纲包括花蜜细菌的
1个种，杆菌纲包括 2个目下属 5个不同种。
3 讨论
蜜囊位于蜜蜂消化道的前端，在蜜蜂采集食物过
程中，其细菌多样性的形成直接影响消化道如肠道细菌
的多样性。昆虫体内共生菌对昆虫在营养、解毒、调控
生殖及与寄主适应性等方面起着十分重要的作用 ［5］。
因此，对蜜囊细菌的研究有利于进一步研究整个消
化道的细菌多样性，从微生物角度，为蜜蜂消化及
机体的抗病性提供基础研究数据。
本研究结果表明，在东、西方蜜蜂蜜囊和花蜜细
菌中，枯草芽孢杆菌 B. subtilis是共有细菌。枯草芽孢
杆菌是一类需氧型、内生抗逆孢子的杆状革兰氏阳性
菌，是芽孢杆菌中应用较为广泛的菌种之一。该菌可通
过调节动物胃肠道菌群平衡，增强机体的免疫功能，提
高动物的生产性能。枯草芽孢杆菌可分泌多种酶类，并
具有抗逆性强、抑菌效果好等诸多优良特性，被认为是
较理想的工业生产菌株［6］。因此，枯草芽孢杆菌在蜜
蜂体内的益生作用，可作为进一步研究的内容。
本试验中，花蜜中 3种细菌 Pantoea vagans、A-
grobacterium larrymoorei和 Bacillus subtilis在西方蜜蜂
蜜囊中都存在，东方蜜蜂蜜囊只有 B. subtilis存在，
说明西方蜜蜂采集花蜜的强度大于东方蜜蜂，因此
含有种类较多的细菌类型。东、西方蜜蜂蜜囊细菌
除 B. subtilis相同外，还有相同的 3 种细菌：Enter-
图 1 东、西方蜜蜂蜜囊和花蜜细菌的系统发育树
Fig1 . Phylogenet ic analysi s of bact er ia in honey st omach of A. cerana, A. melli f era and Nect ar
2.2 东、西方蜜蜂蜜囊和花蜜细菌的系统发育树的构建
以 31株具有代表的菌株构建系统发育树，树枝
的拓扑结构基于 bootstrap值 1000构建，如图 1分支
点所示，4个簇都有不低于 60的自举值，刻度标尺
表示 2%的进化差异。4个簇：簇 I为γ- 变形菌纲
Gammaproteobacteria、簇 II 为 α- 变形菌纲 Al-
phaproteobacteria、簇 III 为放线菌亚纲 Actinobacteri-
dae、簇 IV为杆菌纲 Bacilli。
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蜜蜂杂志 (月刊) JOURNAL OF BEE（Monthly） NO.11 2014 Nov.
●蜜源与授粉
油茶开花满山香
徐传球
（湖南省耒阳市金杯路铁五局小区新八栋五楼，湘南科研蜂场，湖南 耒阳
421800）
油茶树可长 2 m多高，不怕干旱，适应性强，种
在瘠薄的土壤里也能很好地存活。油茶树花朵大，树
上枝条多，每株树有上千朵花，大树多达上万朵花。
10月上旬油茶花零星开放，尾花延至 12月底，花期
长达 2 个多月，油茶籽成熟不一，分早熟和晚熟 2
种。寒露籽属于早熟品种，即在寒露前后开始摘茶
籽；霜降籽属于晚熟品种，一般在霜降前后开始摘油
茶籽。油茶籽是很好的油料原料，榨出的油香味四
溢，闻名世界。
自改革开放以来，农民转入城市打工，油茶林无
人管理，山里杂草丛生，年复一年。一到冬天干草常
被野火燃烧，大片大片相连的油茶林被烧毁，造成茶
油年年减产，当地农民吃油都成了问题。为解决这一
难题，农民开始大量种植油菜。油菜管理简便，见效
快，能较快地解决吃油难题。
昔日的林山变成了荒山。政府扶植种林大户承包
了大量的荒山，并进行机械化开垦，种植了大片大片
的油茶树，由专人管理，山中无杂草生长，长势喜
人，油茶林又绿了，覆盖了满山遍野。10 月上旬，
油茶树相继开花，油茶花香遍山山岭岭，引来数以万
计的蜜蜂和昆虫。油茶花有蜜和粉，一滴很大的蜜汁
分泌在花朵中间，5~6只蜜蜂都采不完。记得小时候
跟着大人到山花烂漫的山茶林里，用小吸管在花朵上
抽吸蜜汁，一边吃得津津有味，一边欣赏着这甜蜜迷
人的世界。难怪油茶花有“蜜库”之称。
有一种像蜜蜂似的小昆虫，当地叫小土蜂，个儿
很小，飞行灵敏，很喜欢采油茶的粉。一到开花季节，
满山遍野都能听到土蜂的“嗡嗡”叫声，在花里忙碌地
采集着。油茶林花海好像是它们的
无边世界，成了它们的乐园。小土
蜂为油茶授粉功不可没，可惜这种
土蜂人们无法得到它的蜜，失去了
饲养价值。
油茶的蜜和粉对蜜蜂容易引
起烂子，蜜蜂不是很喜欢采集。但
在外界无其他蜜源或蜜源不够时，
蜜蜂为了维持生存也采油茶花，好
的年景能采到大量商品蜜和粉，群均可产 50 kg蜂蜜。
后来蜂农一见烂子，就把油茶视为瘟疫，不敢采油茶
花。后来越来越多的蜂农掌握了采油茶蜜规律，并尝
到了采油茶蜜的甜头。现在不但不弃油茶花，每年都
要招来大批蜂场进油茶林给油茶花授粉。不仅蜂蜜得
到了丰收，而且油茶籽也丰收了。产油多了林农得实
惠，这是蜜蜂采油茶的一大贡献。
油茶蜜浓而香甜，被当地称为最好的蜂蜜。一到
盛花期，当地人带着瓶子纷纷来到蜂场购买蜂蜜，销
售火爆。油茶蜜和粉，具有药用价值。对高血压患者
有降压作用。一次我去南里仙寺庙，路边山岭全是油
茶树，有人在摘油茶树叶子，笔者停下脚步问他们摘
了干什么，回答说油茶树叶子是治疗高血压的良药，
把它煮水喝，效果可好啦！难怪有那么多人买油茶蜜！
过去满山遍野的油茶林，一到花期，因油茶花烂
子而被蜂农放弃，油茶花和粉随着时间的推移，被白
白地浪费了。如今蜂农掌握了油茶花规律，一进油茶
场地，就把蜂王关起来，人为控制断子，使工蜂无哺
育负担，全部投入采蜜，大大提高了采蜜效率。现在
本地蜂农不但不弃油茶花，而且还引来了不少外地蜂
场争相采油茶花。生活在油茶花地区的蜂场，由于年
年采油茶，蜂场提高了抵抗烂子的能力。他们的经验
是，花前培育成强大的群势等待油茶花的盛开，油茶
花一结束，把蜂群中的油茶蜜全部摇出，换进浓汁白
糖水以维持越冬保种。转地蜂场花期一结束就退出油
茶场地，走为上策。
收稿日期：2014- 08- 20
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
obacter asburiae、Pectobacterium cypripedii 和 Saccha-
ribacter floricola，表明在同一饲养地不同种类的蜜蜂
之间会形成共同的蜜囊细菌类型。
本试验在冬樱花盛花期进行，不同蜂种采集此蜜
源的能力以及不同泌蜜量是否影响细菌类型有待进一
步研究。
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