全 文 ：第25卷 第4期 中国食用菌 EDIBLEFUNGIOFCHINA
*基金项目:国家自然科学基金资助项目(No30260071)
**作者简介:吴松权(1972-),男,吉林龙井人,延边大学农学院讲师,在读博士,吴基日为通讯作者。
摘要:利用筛选的分离培养基从 4个长白山松口蘑
菌褶中各自分离了菌丝体,应用 RAPD标记对其真伪进
行了鉴定。结果表明:分离的菌丝体是其来源松口蘑子实
体的纯培养物;所选培养基可用于松口蘑菌丝体的分离;
长白山松口蘑子实体之间遗传差异较大。
关键词:RAPD标记;松口蘑;菌丝体;长白山
中图分类号:S646.1 文献标识码:A
文章编号:1003-(8310)2006(04)-0041-03
松口蘑 (Tricholomamatsutake)是典型的营养
共生型外生菌根菌,由于难以合成代替活树根系的
营养和生境,驯化栽培十分艰难。菌种的分离和培
养也是难题之一 [1]。经过几年的研究,我们摸索出
分离松口蘑菌丝体的培养基,但分离的菌丝体是否
为松口蘑纯培养物还需要进一步鉴定。
RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)是
采用PCR技术发展起来的一种DNA分子标记技术。
因其操作简洁、试验成本低、灵敏度、通用性强,
且在不了解物种基因组相关分子生物学信息下就可
进行等优点而广泛应用 [2]。RAPD标记对松口蘑菌
丝体的分离和鉴定是一种快速有效的方法 [3],本文
利用 RAPD分子标记技术对长白山松口蘑子实体及
其分离菌丝体的真伪进行了鉴定。
1材料和方法
1.1供试材料
松口蘑子实体Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,采自吉林省汪清
县;松口蘑子实体Ⅳ采自吉林省龙井市。
1.2分离培养基
山楂干 30g、黑木耳原种 750g(包含黑木耳菌
丝、松木屑、麦麸、尿素等成分)、马铃薯 600g、
琼脂60g、糖60g、水3000mL,pH5.5。
1.3RAPD分析
1.3.1基因组总 DNA提取 采用 CTAB法 [3],并稍
做改进。取 150mg子实体或刮取斜面分离菌丝体 2
支的菌量,用液氮研磨并装入 1.5mL离心管后,加
入 提 取 缓 冲 液 (2% CTAB; 20mMEDTA;
100mMTris-Hcl(ph8.0);1.4MNacl;1%pvp)650ul
和-巯基乙醇 10ul,置 65℃水浴保温 45min。加入
等体积的氯仿/异戊醇 (24:1),剧烈震荡,在室温
下冷却。然后 12000rpm离心 10min,取出的水相
用氯仿/异戊醇 (24:1)再抽提 1次。接着在抽提
后的水相中加入 2/3体积冰冷的异丙醇,静置于-
20℃30min。然后在 12000rpm离心 5min,倾去上
清液,加入 70%的酒精洗涤沉淀,在滤纸上沥干。
当沉淀无乙醇味时加入 1×TE缓冲液 100ul、RNase
2ul并且 37℃保温 1h以裂解 RNA,最后 12000rpm
离心 2min。取 DNA溶液 5uL,在 0.7%的琼脂糖上
电泳,检测 DNA浓度及纯度。检测后的 DNA在
4℃待用或-20℃长期保存。
1.3.2PCR反应体系
总体积为 20ul,包括模板 DNA10ng,引物
0.3umol/L,dNTP200umol/L,Mgcl22mmol/L,Taq
DNA聚合酶1unit,1×Bufer,剩余用双重蒸馏水补
充。
1.3.3PCR扩增程序
预变性 94℃ 5min,94℃变性 60sec.,36℃退火
60sec,72℃延伸 90sec供循环 45次;最后 72℃延
伸7min。
1.3.3PCR产物检测
PCR产物在终浓度为 0.5ug/mL溴化乙锭的
1.4%的琼脂糖凝胶上电泳,电泳缓冲液为 0.5×TBE
(pH=8.0),在 3v/cm恒压下电泳约 3.5h左右,用
Dolphin凝胶成像仪照相。
1.3.4数据分析
根据片断有无,用 1表示有带,0表示无带,
将数据转化为MEGA3.1软件格式,用 UPGMA法构
建RAPD聚类树状图。
2结果与分析
2.1组织分离结果
从 4个松口蘑供试材料中各自分离出 4株松口
蘑分离物,经松茸专家傅伟杰教授 (原延边大学农
RAPD标记在松口蘑菌丝体鉴定中的应用 *
吴松权,全雪丽,傅伟杰,权伍荣**
(吉林延边大学农学院,龙井 133400)
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DOI:10.13629/j.cnki.53-1054.2006.04.014
中国食用菌 EDIBLEFUNGIOFCHINA Vol.25,No.4
学院菌物研究所)初步鉴定为松茸菌丝体,结果见
表1。
2.2RAPD扩增结果
本研究选用表 1中的共 8个样品,以第 1号
和第 4号 DNA为模板,从 UBC301-320、OPA-
OPE的 120个 10碱基随机引物中筛选出 13个扩增
条带多、清晰且重复性好的引物,其代码、序列和
扩增带数如表 2。13个引物对 8个样品进行扩增,
表1 4株 松 口 蘑 子 实 体 及 其 分 离 的 菌 丝 体
Table1 FourfruitybodyofTricholomamatsutakeandisolatedmycelium
表2 13个 随 机 引 物 代 码、序 列 和 扩 增 带 数
Table2. Thecodeandsequencenumberof13randomdecamersandamplifiedbands
共扩增出 121条清晰可用的带,75条多态性的带,
多态性比率为 62%,多态性比率较高。各引物扩增
出的带数在 7~13条之间,平均每个引物扩增出 9.3
条带,这些多态性的带用于对 8个样品亲缘关系的
聚类分析。图 1为引物 UBC308对 8个样品扩增结
果,图2为引物OPB12对8个样品扩增结果,可以
看出松口蘑菌丝体 4、5、6、8与其来源子实体 1、
2、3、7之间具有100%的相似性。
2.3聚类分析
将扩增的 75条 DNA条带转换成 Mega软件数
据格式,利用 Mega3.1软件对 8个样品的亲缘关系
进行了 UPGMA聚类分析 (图 3)。结果表明,各松
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第25卷 第4期 中国食用菌 EDIBLEFUNGIOFCHINA
本刊2006年第3期刊登的山西农业大学张福元等“酵素菌发酵和二次发酵玉米秸秆料对双孢蘑菇生育影
响的研究”一文的(第 53页)页脚加:山西省科技攻关项目,编号 031013ce:通讯作者 张福元 Email:sxauzfy
@163.com,邮编:030801
Abstract:Inthispaper,fourmyceliawererespectivelyisolatedfromtheirlamelaofTricholomamatsu-
takeinChangbaiMt.withselectedculturemedia,whichwereidentifiedwithRAPD Marker.Theresults
showedthatisolatedmyceliawerepurecultureoftheiroriginalfruitbodiesofTricholomamatsutake, the
myceliaofTricholomamatsutakecouldbeisolatedfromselectedculturemediaandthereweregreatgenetic
variancesamongthefruitbodiesofTricholomamatsutakeinChangbaiMt.
Keywords:RAPDmarker;Tricholomamatsutake;Mycelium;ChangbaiMt.
ApplicationofRAPDMarkeronIdentificationofTricholoma
matsutakeMycelium
WUSong-quan,QUANXue-li,WUJi-ri
(AgriculturalColegeofYanbianUniversity,LongjingJilin133400)
口蘑菌丝体和来源子实体的遗传距离为 0、具有
100%的相似性,各松口蘑菌丝体是其来源子实体的
纯培养物;各子实体之间遗传距离较远 (遗传距离
大于0.22), 表明它们之间遗传差异较大。
3结论
经本研究分析,分离的松口蘑菌丝体是其来源
子实体的纯培养物;所选分离培养基可用于松口蘑
子实体的分离;长白山松口蘑子实体之间遗传差异
较大。
[参考文献]
[1] 傅伟杰,许广波等.松茸、姬松茸生产关键技术百问
百答 [M].中国农业出版社,2006,1:1～8,66.
[2] 庄东红,黄秀丽等.南瓜属植物RAPD-PCR反应体系
的建立与应用 [J].武汉植物学研究,2005,23(5):
422～426.
[3] 曾东方,罗信昌等.松口蘑菌丝体的分离和RAPD-
PCR分析 [J].微生物学报,2001,41(3):278～286.
图1 引物UBC308对8个样品扩增结果。
图中M为200bp分子量标记,数字为表1中的8个样品。
Fig.1. ProfilesofPCR productsobtainedfrom ge-
nomic DNA using the UBC308 primer.Lame M,
200bpDNAladder;lanes1to8corespondtoseriate
numberof8sampleslistedintable1.
图2 引物OPB12对8个样品扩增结果。
图中M为200bp分子量标记,数字为表1中的8个样品。
Fig.2. ProfilesofPCRproductsobtainedfrom ge-
nomicDNAusingtheOPB12primer.LameM,200bp
DNA ladder; lanes1to8corespondtoseriate
numberof8sampleslistedintable1.
图3 UPGMA聚类分析树状图
Fig.3.The dendrogram obtained from
theUPGMA methodamong8samples
listedintable1.
更 正
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