全 文 ：福建建瓯茅栗遗传多样性分析
　　　　　　　　　　沈永宝　施季森　　　 林同龙
(南京林业大学 ,南京 ,210037)　　　　(福建省南平市林业站)
　　摘　要　利用 RAPD DNA标记技术 ,研究了福建建瓯茅栗野生群体的遗传多样性。结果表明:茅栗多态位点
百分率为 53.7%, 有效等位基因数目 、基因多样度和 Shannon 多样性信息指数分别为 1.611 2、0.348 1 和 0.528 7。
与其它植物相比 ,福建建瓯茅栗显示出较高的遗传多样性。
关键词　遗传多样性;茅栗;RAPD标记
分类号　S792.17
The Genetic Diversity of Castanea sequinii in Jian ou Area by RAPDMaker/Shen Yongbao , Shi Jisen(Nanjing Forestry U-
niversity , Nanjing 210037 , P.R.China);Lin Tonglong(Nanping City Forestry Station , Fujian Province)// Journal of Northeast
Forestry University.-2004 , 32(4).-44～ 46
The genetic diversity of Castanea sequinii grown in Jian ou , Fujian Province was studied with the help of RAPD DNA marker.
The results show that the percent polymorphic loci is 53.7%, the number of effective alleles is 1.6112 , and Nei s gene diversity is
0.348 1 and Shannon information index is 0.528 7.Compared with other tree species , Castanea sequinii , in Jian ou , has a high
level of genetic diversity.
Key words　Castanea sequinii;Genetic diversity;RAPD marker
　　茅栗(Castanea sequinii)是我国栗属特有种之一 , 广泛分布
于我国南方各省 ,是野生动物的重要食源。 在板栗(C.mol-
lissima)和锥栗(C.henryi)广为人类栽培的今天 , 茅栗仍然处
于野生状态 。但在福建建瓯 , 随着锥栗品种栽培面积的不断
扩大 ,林地不断被开垦和改造 , 茅栗的生存面临着严重威胁。
物种的遗传多样性是物种长期进化的产物 , 是物种生存
和发展的前提。一个物种的遗传多样性越高或遗传变异越丰
富 ,对环境变化的适应能力越强 , 越容易扩展其分布范围和开
拓新的环境 ,也可为进一步人工育种提供丰富的基因型。我
国栗属植物(锥栗 、板栗和茅栗)作为人类重要的木本粮食 ,人
类在利用的同时 ,并未对其遗传多样性给予足够的重视 ,更无
法谈及保护措施。20 世纪 70 年代以来 ,对植物遗传多样性研
究主要采用同工酶标记电泳技术 , 但 20 a 之后 , 许多研究者
开始使用 RAPD DNA 分子标记技术研究林木群体遗传变异 ,
证明 RAPD是揭示群体遗传变异的有力工具。 Yeh 等[ 1] 对欧
洲山杨 8个天然群体的研究结果表明 , 群体变异较大 , 平均
Shannon 指数为 0.65;苏晓华[ 2]研究了 7 个大青杨天然群体 ,
平均 Shannon 指数为 0.31;易能君等[ 3]研究了湿地松抗病种
子园的遗传多样性 , Shannon指数为 0.43。
本文运用 RAPD标记技术 , 用有效等位基因数目 、基因多
样度等参数度量福建建瓯茅栗群体遗传多样性 , 旨在为茅栗
遗传多样性的保护提供理论依据。
1　材料和方法
茅栗样品采集地自然条件:建瓯县地处福建省北部 ,位于
北纬26°18′, 东经 117°02′, 属中亚热带气候。年平均气温 17.5
～ 19.3℃, 7 月份平均气温 27.5 ～ 28.5℃, 极端最高气温
39.0 ～ 41.4℃, 1月份的平均气温为6.2～ 9.1℃, 极端最低气
第一作者简介:沈永宝 ,男 , 1963年 1月生 ,南京林业大学森林资
源与环境学院 ,副教授。
收稿日期:2004年 3月 1日。
责任编辑:李金荣。
温为-5.8～ -9.6℃,全年无霜期 254～ 302 d ,年日照时数达
1 668 ～ 1 972 h。平均相对湿度 79%～ 82%,年降雨量 1 570～
2 000 mm ,雨季集中在 4 ～ 6 月份。该地区地质条件复杂 , 海
拔 500 ～ 12 000 m , 丘陵山地占全区总土地面积的 80%以上 ,
以黄 、红壤为主 ,土壤有机质含量为 0.5%～ 5.0%, pH 值 5 ～
6。植被茂密 , 森林覆盖率达 58.5%。锥栗 、茅栗广为分布 。
实验样品的采集:茅栗叶片样品于 1999 年 11 月上旬采
自福建南平建瓯县境内 , 共采集样品 30 份。叶子用硅胶干燥
保存。
DNA提取:茅栗叶片 DNA 提取参照 Shen Yongbao , et al
DNA提取方法[ 4] 。
PCR扩增条件和反应体系:PCR扩增在 PE9600 基因扩增
仪上进行。反应条件为 94℃预变性 2 min 后进入 38 个循环。
每循环 94℃变性 30 s , 40℃退火 30 s , 72℃延伸 1.5 min。所有
循环完成后延伸 7 min , 最后于 4℃保存。总反应体积 20μL,
其中 5 ng 左右模板 DNA , 10 μmol 引物 , dNTP 各为 100
μmol/ L , 2μL1 0 ×反应缓冲液[ 1 00μmol/ LTris -HCL(pH
8.3), 500μmol/ LKCL , 2.0 mmol/ LMgCL2 , 0.01%明胶 , 5.0 g/L
BSA] , 1.0 U TagDNA 聚合酶。扩增产物在含溴化一锭的 1%
琼脂糖凝胶中电泳分离 ,最后在紫外灯下用 Polaroid 摄像系统
记录扩增产物。
RAPD 数据统计与分析:多态位点百分率———多态位点
百分率(P)是所检测到的位点中多态位点所占的比率。遗传
多样性分析———多态性谱带用“ 1”代表有带 , “ 0” 代表无带。
根据各基因位点的等位基因频率 , 计算有效等位基因数目
Ne、基因多样度 H 和 Shannon 表型多样性指数 I 。使用分析
软件为 POPGENE32。
2　结果与分析
从 520 个随机引物中选择 10 个多态性较丰富的引物(见
表 1), 用于茅栗 DNA PCR扩增 , 图 1 分别是引物 B08 和 A07
扩增的结果。共获得多态性位点 80 个 , 多态位点百分率 P
为 53.7%, 但各多态位点的等位基因频率差异较大。通过进
第 32卷 第 4 期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.32 No.4
2004年 7 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Jul.2004
DOI :10.13759/j.cnki.dlxb.2004.04.016
一步计算更有遗传意义的 2 个重要参数 , 即有效等位基因数
目 N e和基因多样度 H[ 5] ,结果(见表 2)表明各位点的遗传多
样性差异较大。有效等位基因数最大值为 2.000 0 , 最小值为
1.013 1 , 平均值为 1.611 2;基因多样度(H)最大值为 5.000 0 ,
最小值为0.012 9 ,平均值为0.348 1。为便于与同类研究比较 ,
本研究还计算了 Shannon 多样性信息指数(I)(见表 2), 在分
离位点中 , I 最大值为 0.693 1 ,最小值为 0.121 7 , 平均值为0.
528 7。有效等位基因数 、基因多样度和 Shannon 多样性信息
指数估计均方较小 ,说明估计精度较高 , 同时也说明福建建瓯
茅栗野生资源遗传多样性较高。
表 1　用于茅栗PCR扩增的随机引物
引物 引物序列 多态位点数 引物 引物序列 多态位点数
A07 GAAACGGGTG 9 C02 GTGAGGCGTC 7
B08 GTCCACACGG 10 G02 GGCACTGAGG 8
X01 CTGGGCACGA 8 B07 GGTGACGCAG 8
A10 GTGATCGCAG 8 L07 AGGCGGGAAC 8
W06 AGGCCCGATG 7 W07 CTGGACGTCA 7
引物 B08
引物 A07
图 1　茅栗DNA PCR扩增产物
表 2　茅栗不同多态性位点的遗传多样性
多态位点 Ne H I 多态位点 Ne H I
L1 1.742 7 0.426 2 0.617 4 L2 1.904 1 0.474 8 0.667 8
L3 1.982 5 0.495 6 0.688 7 L4 1.656 7 0.396 4 0.585 6
L5 1.977 8 0.494 4 0.687 5 L6 1.515 3 0.340 1 0.523 4
L7 1.999 9 0.500 0 0.693 1 L8 1.370 1 0.270 1 0.441 3
L9 1.134 8 0.118 8 0.236 3 L10 1.741 7 0.425 8 0.617 0
L11 2.000 0 0.500 0 0.693 1 L12 1.662 0 0.398 3 0.587 7
L13 1.283 5 0.220 9 0.379 5 L14 1.572 0 0.363 9 0.550 1
L15 1.462 9 0.316 4 0.496 3 L16 1.969 6 0.492 3 0.685 4
L17 1.952 5 0.487 8 0.680 9 L18 1.378 2 0.274 4 0.446 5
L19 1.057 1 0.054 0 0.126 9 L20 1.263 1 0.208 3 0.363 1
L21 1.843 9 0.457 7 0.650 2 L22 1.987 2 0.496 8 0.689 9
L23 1.953 3 0.488 0 0.681 1 L24 1.612 3 0.379 8 0.567 6
L25 1.054 0 0.051 3 0.121 7 L26 1.975 5 0.493 8 0.686 9
45第 4期　　　　　　　　　　　　　　　沈永宝等:福建建瓯茅栗遗传多样性分析　　　　　　　　　　　
续表 2
多态位点 Ne H I 多态位点 Ne H I
L27 1.849 0 0.459 2 0.651 7 L28 1.354 5 0.261 7 0.431 0
L29 1.253 0 0.201 9 0.354 7 L30 1.955 9 0.488 7 0.681 8
L31 1.934 8 0.483 2 0.676 2 L32 1.622 6 0.383 7 0.571 9
L33 1.812 6 0.448 3 0.640 5 L34 1.719 1 0.418 3 0.609 1
L35 1.999 1 0.499 8 0.692 9 L36 1.598 5 0.374 4 0.561 7
L37 1.843 9 0.457 7 0.650 2 L38 1.523 0 0.343 4 0.527 1
L39 1.973 9 0.493 4 0.686 5 L40 1.370 6 0.270 4 0.441 6
L41 1.127 7 0.113 3 0.227 7 L42 1.707 1 0.414 2 0.604 7
L43 1.775 8 0.436 9 0.628 6 L44 1.994 7 0.498 7 0.691 8
L45 1.718 2 0.418 0 0.608 7 L46 1.966 1 0.491 4 0.684 5
L47 1.572 0 0.363 9 0.550 1 L48 1.775 8 0.436 9 0.628 6
L49 1.612 3 0.379 8 0.567 6 L54 1.855 3 0.461 0 0.653 6
L55 1.013 1 0.012 9 0.039 3 L56 1.992 8 0.498 2 0.691 3
L57 1.082 7 0.076 3 0.167 2 L58 1.988 5 0.497 1 0.690 3
L59 1.988 5 0.497 1 0.690 3 L60 1.887 6 0.470 2 0.663 1
L61 1.536 6 0.349 2 0.533 7 L62 1.993 2 0.498 3 0.691 4
L63 1.547 0 0.353 6 0.538 6 L64 1.097 4 0.088 7 0.188 2
L65 1.145 4 0.126 9 0.248 7 L66 1.948 6 0.486 8 0.679 9
L67 1.555 0 0.356 9 0.542 3 L68 1.910 6 0.476 6 0.669 6
L69 1.945 5 0.486 0 0.679 1 L70 1.129 5 0.114 7 0.229 9
L71 1.684 6 0.406 4 0.596 4 L72 1.055 5 0.052 6 0.124 3
L73 1.070 1 0.065 5 0.148 1 L74 1.989 5 0.497 4 0.690 5
L75 1.087 5 0.080 4 0.174 2 L76 1.532 0 0.347 2 0.531 5
L77 1.186 3 0.157 0 0.292 9 L78 1.357 5 0.263 3 0.433 0
L79 1.981 0 0.495 2 0.688 3 L80 1.578 1 0.366 3 0.552 8
平均值 1.611 2 0.348 1 0.528 7
标准差 0 0.340 9 0.157 5 0.196 9
3　讨论
3.1　关于茅栗遗传多样性
与同属植物比较 ,福建建瓯野生茅栗的遗传多样性较为
丰富 ,与美国南方美洲栗相当 , 但明显高于北方美洲栗的遗传
多样性[ 6] 。与同科的栲树相比[ 7] ,其遗传多样性也明显偏高。
但与郎萍等[ 8]的研究结果存在一些差异 , 他们认为茅栗遗传
变异较低。其原因可能是本研究只针对福建建瓯茅栗群体 ,
并未涉及到其它群体 ,此外也可能是所使用的标记种类不同
所致 , 但众多的研究都已表明 , 在研究物种遗传多样性时 ,
RAPD标记比同工酶标记更能全面地揭示群体间和群体内的
遗传变异[ 9] 。
3.2　关于茅栗遗传多样性的保护
茅栗作为中国栗属 3 种特有树种之一 , 是人类和野生动
物的重要食源。虽然目前并未象板栗和锥栗那样被广泛栽
培 ,但其潜在价值 , 尤其是对野生动物的作用不可估量。茅栗
虽然处于野生状态 ,但在主要分布区已受到人为活动的严重
威胁 ,特别是在福建建瓯。大面积开垦现有林地种植优良锥
栗品种和以野生茅栗为砧木嫁接锥栗品种都会严重破坏茅栗
资源。虽然本研究结果表明茅栗的遗传多样性依旧较为丰
富 ,但随着时间的推移和人为破坏的不断加剧 , 不可避免地导
致种质的严重流失 ,同时还可能引起基因匮乏 、种性退化。因
此 ,在锥栗栽培面积较大的闽北地区 , 茅栗遗传多样性的保护
已迫在眉睫 。在大力发展锥栗产业的同时 , 不可忽略茅栗野
生资源的遗传资源保护 , 要及早制定保护策略 , 定期检测其遗
传多样性变化 , 为进一步制定和调整保护策略提供技术支持。
参　考　文　献
1　Yeh F C , Chong D K X , Yang R C.RAPD variat ion within and among
natural populations of Trembling aspen(Populus tremuloides Michx.)from
Alberla.The Journal of Heredily , 1995, 86(6):454～ 459
2　苏晓华.利用 RAPD分析大青杨天然群体的遗传结构.林业科学 ,
1997 , 33(6):504～ 511
3　易能君 ,韩真敏 ,尹佟明 ,等.湿地松抗病种子园的遗传多样性分
析.林业科学 , 2000 , 36(1):51～ 55
4　Shen Yongbao , Shi Jisen.CTAB- Si lica method for DNA ext raction and
purifi cation from Castanea mollissima and Ginkgo biloba.Forestry Studies
in China , 2003 ,5(3):10～ 16
5　Hamrick J L , Godt M J.Allozyme diversity in plant species.In Brown A
H D , Clegg M T , Kahler A L , et al eds.Plant populat ion genetics ,
breeding and germplasm resources.Sunderland:Sinauer , 1989.43～ 63
6　Huang H , Dane F.Allozyme and RAPD analysis of the genet ic diversity
and geographic variation in wild populations of the American chestnut.
America Journal of Botany , 1998, 85:1013～ 1021
7　徐立安 ,李新军.用 SSR研究栲树群体遗传结构.植物学报 , 2001 ,
43(4):409～ 412
8　郎萍 ,黄宏文.栗属中国特有种居群的遗传多样性及地域差异.植
物学报, 1999 , 41(6):651～ 657
9　张晓春,李悦 ,沈熙环.林木同工酶遗传多样性研究进展.北京林业
大学学报 , 1998 , 20(3):58～ 66
46 　　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第 32 卷