全 文 ：应用与环境生物学报 2008，14 ( 5 ): 688~691
Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X
2008-10-25
DOI: 10.3724/SP.J.1145.2008.00688
与薜荔性别相关的SRAP分子标记*
吴文珊** 朱晓东 陈友铃
(⽣ᓎᏜ㣗໻ᄺ⫳ੑ⾥ᄺᄺ䰶 ⽣Ꮂ 350108)
Identifi cation of a Sex-associated SRAP Marker in Ficus pumila L.*
WU Wenshan**, ZHU Xiaodong & CHEN Youling
(College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350108, China)
Abstract Ficus pumila L. is dioecious and its sex is difficult to be distinguished from the morphological characteristics of
branches and leaves without fruit. After planted seedling trees need 3~5 years to produce fruit, and the trees in different sexes
have different economic values. In this paper, the sequence-related amplifi ed polymorphism (SRAP) was used to identify plant
sex for in the fi rst time, with the purpose to identify the sexes of its individuals at seedling stage, so as to enhance the effi ciency
of cultivation and shorten the breeding process. The total genomic DNA was extracted from a-year-old leaves of reproductive
branches of female and male F. pumila using an optimized CTAB protocol. SRAP technique was applied in sex determination
of F. pumila. An effi cient PCR reaction system was developed for detecting the SRAP and it showed very reliable, effective and
repetitive. 153 two-primer combinations and 1 500 three-primer combinations were tested. A female-associated fragment was
generated with me1-em2-em14 primer. The marker fragment, named FPme1-em2-em14 230 existed in all female plants, but not in
male plants so far analyzed. The results showed that SRAP marker could be widely used in molecular genetic map construction
and germplasm evaluation of F. pumila. Fig 4, Tab 2, Ref 19
Keywords Ficus pumila L.; SRAP; sex identifi cation; dioecism
CLC Q75
摘 要 薜荔植株的雌、雄性别在结果前难以通过枝叶等形态特征进行辨别. 薜荔实生树定植后需3~5 a才能开花结
果，而不同性别的薜荔植株有着不同的经济价值. 本文将序列相关扩增多态性(SRAP)标记首次应用于植物性别鉴别
研究，以期能够在薜荔苗期鉴别出个体的性别，从而提高栽培效益，缩短育种进程. 实验以薜荔雌、雄植株生殖枝上
当年生叶为材料，用优化的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取其全基因组DNA. 利用SRAP标记技术对薜荔雌、雄
株进行性别鉴别研究，建立了完整的PCR反应体系，扩增效果好，结果稳定可靠，可重复性强.在153个SRAP两引物和
1 500个三引物中，只有引物me1-em2-em14扩增得到1条雌性多态性片段. 此片段存在于试验所用材料的所有雌株中而雄
株没有，将其命名为FPme1-em2-em14230.研究结果表明，SRAP标记可在薜荔分子生物学研究领域中广泛应用. 图4 表2 参19
݇䬂䆡薜荔；SRAP；性别鉴别；雌雄异株
CLC Q75
ᬊ〓᮹ᳳ: 2008-04-11 ᥹ফ᮹ᳳ: 2008-07-07
∗⽣ᓎⳕ㞾✊⾥ᄺ෎䞥䌘ࡽ乍Ⳃ(No. B0610029)੠⽣ᓎⳕ⾥ᡔख़䞡⚍䌘ࡽ
乍Ⳃ(No. 2007S0015) Supported by the Natural Science Foundation of Fujian,
China (No. B0610029), and the Scientifi c Research Program of the Science and
Technology Department of Fujian, China (No. 2007S0015)
∗∗䗮䆃԰㗙 Corresponding author (E-mail: wuwenshan@126.com)
薜荔(Ficus pumila L.)为桑科榕属常绿攀援藤本植物，
广泛分布于长江以南各省区. 薜荔瘦果阳干制成果冻的历史
悠久，澄黄剔透的薜荔冻是一种高贵的天然食品 . 近年，
随着人类对健康的不断关注，低脂食品日益得到广大消费
者的青睐，薜荔作为低脂食品研制和开发的重要资源而倍
受关注 [1]；同时，薜荔抗干旱，耐贫瘠，能在石缝和崖壁
上良好生长，喜攀援缠绕且贴伏，在园林艺术方面可作常
绿山石植物，效果甚佳 . 但薜荔雌雄异株，其性别在结果
前难以通过树体和枝叶形态特征加以辨别，而实生树定植
后需3~5 a才能开花结果 . 不同性别的薜荔有着不同的经济
价值，作为果树栽培时以种子为收获对象，需要大量的薜
荔雌株，而做为绿化林木时薜荔雄株则具有更高的经济价
值.若能够在幼年期或幼苗期鉴别出个体的性别则可显著提
高栽培效益，缩短育种进程，因此薜荔性别鉴别研究具有
重要的理论意义和实用价值.
SRAP标记(Sequence-related amplifi ed polymorphism)是Li
和Quiros[2]新发展的一种分子标记技术，针对基因外显子中
GC含量丰富而启动子、内含子里AT含量丰富的特点来设
计引物进行PCR扩增，因不同个体的内含子、启动子与间
隔长度不等而产生多态性，该标记具有简便、稳定、产率
高、便于克隆目标片段的特点，已被应用于图谱构建 [2~4]、
比较基因组学[4, 5]、基因定位[2]和遗传多样性[6~8]分析中. 近年
来，RAPD标记技术、AFLP标记技术已广泛用于雌雄异株
植物的性别特异性标记的研究 [9~17]，但SRAP标记应用于植
物性别鉴别研究尚属首次报道. 本文从分子水平上对薜荔雌
雄株进行早期性别鉴定的研究，旨在为生产上合理的雌雄
6895 期 吴文珊等：与薜荔性别相关的SRAP分子标记
株田间配置以及育种工作中的早期选择提供科学依据.
1 材料与方法
1.1 材 料
分别取福建省福州、厦门、宁德、三明、武夷山5个
地区40株 (雌、雄各20株，每个地区4株 )已知性别的薜荔
雌、雄植株当年生生殖枝上的叶片提取DNA. 取l5株雄性薜
荔或15株雌性薜荔(每个地区各3株)的单个DNA样品等量混
合分别组成雄性或雌性DNA池(DNA pools)，以提供具有相
同遗传背景的雌、雄性DNA样品 . 剩余植株的DNA样品用
于验证雌雄标记的准确性.
1.2 主要仪器和化学试剂
PTC-100 PCR仪 (Bio-rad)公司；5804R低温离心机
(Eppendorf)；DU640型核酸蛋白分析仪(BECKMAN公司)；
JS-380B型全自动数码凝胶成像分析仪(上海培清科技有限
公司)；DYY-6C型电泳仪，DYCZ-24F型电泳槽(北京六一仪
器厂)；TaqDNA聚合酶、dNTPs购自上海生物技术工程公
司.DL2000 Marker购自Takara公司.
1.3 DNA的提取
参照张今今等 [18]的方法并作改进. 具体步骤为：取2~3
g新鲜幼嫩叶片于研钵中，加适量液氮研磨成粉末，迅速装
入预冷的50 mL离心管，加入15 mL预热至65 ℃的CTAB提
取缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；20 mmol/L EDTA，
pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；3% CTAB；2% PVP；2% β-巯基乙
醇)，轻轻混匀后65 ℃水浴30 min；冷却至室温后加入等
体积的氯仿–异戊醇(体积比24:1)，温和颠倒离心管20~30
次，10 000 r/min离心10 min；取上清液转入新的离心管，氯
仿–异戊醇重复抽提2~3次，直至中间界面无白色物质；转
移上清液，加2倍体积冰冷的无水乙醇，充分混匀后冰冻30
min；挑出絮状DNA沉淀，转入1.5 mL离心管，用70%乙醇
漂洗2次；在超净工作台吹干后加300 μL TE (10 mmol/L Tris-
HCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA，pH 8.0)充分溶解DNA. 向溶
解的DNA中加入3 μL无DNA酶活性的RnaseA (10 mg/mL)于
37 ℃水浴30~60 min，充分降解RNA；再加等体积的氯仿–
异戊醇温和颠倒混匀，12 000 r/min离心10 min；取上清加
2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3 mol/L NaAc9 (pH
5.2)，混匀后－20 ℃放置30 min以沉淀DNA，10 000 r/min离
心10 min，弃上清；用70%乙醇漂洗DNA沉淀2~3次，置于
超净工作台风干，溶于300 μL TE后于－20 ℃冰箱中保存.
1.4 实验引物
依照Li和Quiros[2]、林忠旭等人[3]发表的引物，选用了9
个正向引物(me1~me9)和17个反向引物(em1~eml7)，见表1.
1.5 PCR反应体系
将得到的DNA样品稀释到50 ng/μL作为模板进行SRAP
扩增，参照Li和Quiros[2]、林忠旭等人 [3]的方法建立反应体
系.反应体系20 μL：包括dNTP Mixture (2.5 mmol/L) 1 μL，10
×PCR buffer 2 μL，MgCl2 (25 mmol/L) 1.6 μL，Taq酶(5 U/μL)
0.2 μL，正向、反向引物(5 μmol/L)各1.2 μL (如果是三引
物，则每个引物各1.2 μL)，模板DNA (约50 ng/μL) 1 μL，加
灭菌重蒸水至20 μL.
1.6 PCR扩增程序选择
扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 1 min，33
℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，
52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10
min，于4 ℃保存. 扩增反应在PTC-100 PCR仪上进行.
1.7 SRAP产物的检测
PCR产物每管中加入2 μL 6× Loading buffer混匀，取5
μL上样于6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中，在1×TBE的电极
缓冲液中电泳检测. 电泳电压为200 V，时间1.5~2 h左右. 电
泳后银染，银染参照吴冠芸等人[19]的方法.
2 结果与分析
2.1 薜荔叶片DNA抽提结果
实验初始，试图对薜荔采用一般植物叶片的提取方
法，效果不理想，抽提出的DNA呈褐色胶状不易溶解且得
率低，薜荔叶中含有大量多糖和酚类物质未能去除干净.经
೒1 㭰㤨෎಴㒘DNA⨐㛖㊪ޱ㛊⬉⋇೒
Fig. 1 Genomic DNA extracted from female and male F. pumila tested by
agarose gel electrophoresis
M: DNAߚᄤ䋼䞣ᷛ䆄(λ-DNA); ♀: 䲠ᗻϾԧDNA; ♂: 䲘ᗻϾԧDNA; 1~5
㸼⼎ϡৠϾԧ
M: Molecular marker (λ-DNA); ♀: DNA from female individuals; ♂: DNA
from male individuals; 1~5 show different individuals
表1 实验中应用的SRAP引物序列
Table 1 Primer sequences used for SRAP analysis
ℷ৥ᓩ⠽
Forward primer
ড৥ᓩ⠽
Reverse primer
ড৥ᓩ⠽
Reverse primer
me1: TGAGTCCAAACCGGATA
me2: TGAGTCCAAACCGGAGC
me3: TGAGTCCAAACCGGAAT
me4: TGAGTCCAAACCGGACC
me5: TGAGTCCAAACCGGAAG
me6: TGAGTCCAAACCGGTAG
me7: TGAGTCCAAACCGGTTG
me8: TGAGTCCAAACCGGTGT
me9: TGAGTCCAAACCGGTCA
eml: GACTGCGTACGAATTAAT
em2: GACTGCGTACGAATTTGC
em3: GACTGCGTACGAATTGAC
em4: GACTGCGTACGAATTTGA
em5: GACTGCGTACGAATTAAC
em6: GACTGCGTACGAATTGCA
em7: GACTGCGTACGAATTATG
em8: GACTGCGTACGAATTAGC
em9: GACTGCGTACGAATTACG
em10: GACTGCGTACGAATTTAG
em11: GACTGCGTACGAATTTCG
em12: GACTGCGTACGAATTGTC
em13: GACTGCGTACGAATTGGT
em14: GACTGCGTACGAATTCAG
em15: GACTGCGTACGAATTCTG
em16: GACTGCGTACGAATTCGG
em17: GACTGCGTACGAATTCCA
690 14 卷应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ Biol
方法改进，利用改良CTAB法提取，得到白色半透明状的
DNA沉淀，易溶解，溶液清亮，无粘稠感. 应用分光光度法
对所提取的DNA进行纯度和产量分析，所得到的样品基因
组DNA的D260 nm/D280 nm比值平均为1.85左右，表明蛋白质和
RNA杂质去除干净，得到的DNA 纯度较高. 从产率上看，
平均每克鲜重叶片可获得103.4 μg左右的DNA，可见用此法
提取的DNA产率较高. 图1为薜荔不同雌、雄株总DNA提取
量电泳图谱，图中可以看出不同雌、雄株提取的总DNA质
量基本一致，而且没有杂带及弥散现象，完全达到了用于
分析的要求.
2.2 SRAP引物筛选
选用9个正向(上游)引物和17个反向(下游)引物(表1)组
合成153对引物，对薜荔雌、雄植株全基因组DNA (取等量
的个体基因组DNA组成雌雄两个DNA池)进行扩增，引物扩
增出的条带大小在50~1 500 bp之间，条带数在2~23之间，
没有引物未扩增出条带. 153对引物在雌株全基因组DNA上
共扩增出1 533条带，平均每对引物可扩增出10.02条带；在
雄株全基因组DNA上共扩增出1 513条带，平均每对引物可
扩增出9.89条带，可见薜荔雌株的多态性略高于雄株 . 图2
为SRAP引物筛选的电泳图谱. 对筛选中有差异的引物再做
具体分析，重复实验以确定扩增产物的稳定性，但没有一
个位点表现出性别差异，即没有得到可作为薜荔性别鉴别
的SRAP标记.
2.3 两引物和三引物扩增结果的比较
选取出扩增产物条带信号强、重现性好、特征性好的
引物组合，按表2的引物组合规律，组合出6组两引物 (正
向引物与反向引物各1个，下同)和三引物(与两引物相同的
一对引物再加上1个正向或反向引物，下同)，并比较两引
物和三引物扩增结果(图3). 如表2所示，三引物扩增得到的
产物 (296个条带 )明显比用一对引物扩增的 (177个条带 )要
多，一般情况下，引物扩增出条带数量由多至少依次为：
meAemC
＋meAemD>meAemCemD>meAemC或meAemD. 两引物扩增
出的63.28%条带在三引物扩增中都十分稳定(条带较强，大
小相同，重复性好)；22.60%的条带在两引物扩增中稳定，
但在三引物扩增中不稳定，或条带较弱；14.12%的条带在
两引物扩增中存在，用三引物却扩增不出条带；但是，三
引物又能扩增出8.11%新的(在两引物扩增中不存在)条带；
三引物扩增出的条带中有10.14％的条带由于大小相同或相
近，位置发生重叠.
2.4 与性别相关的SRAP标记的筛选
由于9个正向引物和17个反向引物(表2)组合成153对引
物，对雌、雄植株全基因组DNA进行扩增，未得到可作为
೒2 䚼ߚϸᓩ⠽㒘ড়ᠽ๲೒
Fig. 2 Amplifi cation result of some two-primer combinations
♀: 䲠᷾DNA∴˗♂: 䲘᷾DNA∴ ♀: DNA pools from female˗♂: DNA
pools from male
表2 两引物和三引物扩增结果分析
Table 2 PCR amplifi cations of two-primers and three-primers for the same samples
ᓩ⠽㒘ড়
Primer combinations
meA
emC
meA
emD
meB
emC
meB
emD
meA
emC
emD
meB
emC
emD
meA
meB
emC
meA
meB
emD
〇 ᅮ
Stable
ϡ 〇 ᅮ
Instable
㔎 ༅
Defected
ᮄ ๲
Increased
䞡 ঴
Overlapped
A=7, B=8, C=5, D=6 4 10 8 4 13 5 8 11 13 8 5 4 8
A=4, B=9, C=14, D=16 12 13 12 7 20 17 21 18 28 13 3 6 12
A=5, B=6, C=15, D=17 7 9 4 6 12 8 9 11 17 6 3 0 3
A=3, B=4, C=12, D=14 3 5 9 8 6 17 13 8 17 5 3 3 4
A=3, B=5, C=16, D=17 5 10 7 8 15 14 12 16 21 7 2 2 2
A=3, B=9, C=2, D=17 7 7 8 4 14 11 10 7 16 1 9 9 0
ড়䅵 Total 38 54 48 37 80 72 73 71 112 40 25 24 30
177 296
ⱒߚ⥛ Percentage (P/ˁ) 37.42 62.58 63.28 22.60 14.12 8.11 10.14
೒3 ϸᓩ⠽੠ϝᓩ⠽೼ⳌৠḋકϞⱘPCRᠽ๲㒧ᵰ
Fig. 3 PCR amplifi cations with two-primers and three-primers for the same
samples
M: DNAߚᄤ䋼䞣ᷛ䆄(Marker, 2000 bp DNA ladder); 1~16ᓩ⠽ձ⃵Ў(The
numbers 1~16 represent primers): me4-em14, me4-em16, me9-em14, me9-em16,
me4-em14-em16, me9-em14-em16, me4-mm9-em14, me4-me9-em16, me3-em16, me3-
em17, me5-em16, me5-em17, me3-em16-em17, me5-em16-em17, me3-me5-em16, me3-
me5-em17
6915 期 吴文珊等：与薜荔性别相关的SRAP分子标记
薜荔性别鉴别的SRAP标记，因此再选用扩增效果稳定的
两引物(一对)再加上1个正向或反向引物组合成1 500个三
引物，再对雌、雄植株全基因组DNA进行扩增，共扩增出
18 300条带，平均每对引物可扩增出12.2条带，条带大小在
50~1 500 bp之内，其中只有引物me1-em2-em14在薜荔雌株上
扩增出230 bp的特异条带 (标记为FPme1-em2-em14230)，该片
段可作为薜荔性别鉴别的SRAP标记，该标记与雄株没有关
联.用构建雌、雄DNA池以外的DNA样品进一步验证该标记
的准确性，结果见图4. 该结果说明，雌雄薜荔基因组间虽
然存在DNA序列上的差异，但它们的遗传信息的绝大部分
是一致的.
3 讨 论
实验结果表明，三引物扩增比两引物扩增得到的产物
明显提高，同时能够扩增出新的条带，因此三引物扩增的
效率更高，同时丰富了引物的组合形式，提高了引物的使
用率；但由于两对两引物之间有近十分之一的可能扩增出
大小相同或相近的条带，这些条带在三引物扩增中易发生
位置重叠，因此一定程度上又降低了条带多态性 .因此建
议：模板DNA在两引物扩增出的条带多态性较低时，使用
三引物扩增可提高多态性，同时，用少量的引物可组配得
到多个引物对，提高了引物的使用效率，降低引物合成成
本；在两引物扩增出的条带多态性较高时，使用两引物扩
增更为简便，且可避免三引物扩增所造成的条带缺失与重叠.
本研究利用153对引物和1 500个三引物组合，在雌雄
基因组的扩增中，共得到约19 498条带纹，相当于检测了
约2万个位点(有重复)，但只有三引物me1-em2-em14组合在
薜荔雌株上扩增出性别相关标记FPme1-em2-em14230，即只
有一个位点表现出性别差异，这一结果表明，雌雄异体的
薜荔与其他两性生物一样. 虽然性器官及生理行为等方面存
在差异，但遗传信息的绝大部分是一致的 . 通过进一步克
隆与测序，有望设计一个性别特异性的PCR引物(正在研究
中)，从而建立一个快速、廉价的以PCR为基础的分子标记
系统，用于薜荔性别的早期鉴定，为克隆与性别相关的基
因奠定了基础.
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图4 薜荔雌、雄性DNA池及个体DNA用引物me1－em2－em14扩增的结果
Fig. 4 Result of random amplifi cation of DNA pools and individual DNA with
primer me1
－em2
－em14
M: DNA分子质量标记(2 000 bp). 1: 雌株DNA池 ; 2~6: 不同雌株个体
DNA; 7: 雄株DNA池; 8~12: 不同雄株个体DNA. 箭头表示扩增出的雌性
特异性片段
M: Marker(2000bp DNA ladder). 1: DNA pools from female; 2~6: DNA
from female individuals; 7: DNA pools from male; 8-12: DNA from male
individuals. The arrow shows the female-specifi c DNA fragment