全 文 ：云南农业大学学报 Journal of Yunnan Agricultural University，2011，26 (5) :593 － 597 http:/ /xb. ynau. edu. cn
ISSN 1004 － 390X;CODEN YNDXAX E-mail:xb@ ynau. edu. cn
收稿日期:2010 － 08 － 04 修回日期:2011 － 05 － 23 网络出版时间:2011 － 09 － 14 17:51
* 基金项目:“十一五”国家科技支撑计划项目 (2008BADA1B01，2008BADA1B08)。
作者简介:张微思 (1982 －)，男，重庆渝北人，助理研究员，主要从事食用菌遗传学研究。E-mail:zws82@126. com
＊＊通讯作者 Corresponding author:朱萍 (1962 －) ，女，云南昆明人，研究员，主要从事食用菌质量安全研究。
E-mail:zhuping8@ 126. com
网络出版地址:http: / /www. cnki. net /kcms /detail /53. 1044. S. 20110914. 1751. 201105. 593_ 002. html
DOI:10. 3969 / j. issn. 1004 － 390X (n). 2011. 05. 002
云南松口蘑的 ISSR遗传多样性研究*
张微思1，王 浚1，李宗菊2，马绍宾2，朱 萍1＊＊
(1． 中华全国供销合作总社 昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223;2． 云南大学 生命科学学院，云南 昆明 650091)
摘要:本文利用 16 条 ISSR引物，对来自云南香格里拉、大理、楚雄和昆明的 4 个松口蘑居群共 42 个个体
的遗传多样性进行研究。结果表明，ISSR-PCR 共扩增出 76 条条带;总多态性位点百分率 PPB = 61. 04%，
多态位点百分率依次为 56. 76%，67. 75%，70. 27%和 50. 00%;总的基因多样度指数 (Ht)为0. 321 5，居
群内的 Nei遗传多样度指数 (Hs)为0. 244 7，Shannon多样性指数 (I)为 0. 4717，居群间的遗传分化系数
Gst为0. 247 1，基因流 Nm 为1. 523 4，这说明云南松口蘑具有较高的遗传多样性，且主要存在于居群之间，
居群内的变异较小;遗传距离表明 4 个居群中香格里拉和昆明的亲缘关系最远，大理和楚雄的亲缘关系
最近。
关键词:松口蘑;遗传多样性;分子标记;ISSR
中图分类号:S 646. 15 文献标识码:A 文章编号:1004 － 390X (2011)05 － 0593 － 05
The Genetic Diversity of Tricholoma matsutake by ISSR in Yunnan Province
ZHANG Wei-si1，WANG Jun1，LI Zong-ju2，MA Shao-bin2，ZHU Ping1
(1． Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply and Marketing Cooporative，Kunming 650223，China;
2． The Life Sciences Institute，Yunnan University，Kunming 650091，China)
Abstract:Genetic diversity of 42 individuals belonging to four populations of Tricholoma matsutake from
Shangri-la，Dali，Chuxiong and Kunming in Yunnan Province was detected by using 16 ISSR primers． The
results showed that 76 DNA bands were amplified by 16 primers above mentioned and the total percentage of
polymorphic bands (PPB)was 61. 04%． The PPBs of Shangri-la，Dali，Chuxiong and Kunming were
56. 76%，67. 75%，70. 27% and 50. 00%，respectively． The total genetic diversity (Ht)was 0. 321 5，the
genetic diversity within population (Hs)was 0. 244 7，Shannons diversity index (I)was 0. 471 7，the coef-
ficient of gene variation was 0. 247 1 and the gene flow among populations was 1. 523 4. It was implied that
a higher genetic diversity of T. matsutake mainly existed among populations，and a lower degree of genetic
variation occurred within populations． The genetic relationship was the farthest between Shangri-la and Kun-
ming，and it was the closest between Dali and Chuxiong in the genetic distance．
Key words:Tricholoma matsutake;genetic diversity;molecular marker;ISSR
松口蘑 ［Tricholoma matsutake (S． Ito ＆ S．
Imai)Singer］尚不能进行人工栽培，面对日益增
长的市场需求，人们大量采集野生松口蘑资源，
使野生资源量急剧下降，因此采取科学的技术和
管理措施、维护和改善松口蘑的生态环境、促进
产量的恢复与提高，对松口蘑可持续发展具有重
要意义［1 － 5］。云南的松口蘑不仅分布范围广、种
群变化大、寄主植物种类繁多，而且其近缘种类
也较多，仅依据子实体的外形特征难于区分，分
子生物学技术则为松口蘑种类的确认和多样性研
究提供了有力的技术支撑［6 － 8］。
由于简单序列重复区间 (inter-simple sequence
repeat，ISSR)的引物设计比简单序列重复 (sim-
ple sequence repeat，SSR)简单，且多态性高，重
复性好，能够提供更多的信息，所以已在多种动
植物的种质鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多
样性研究等方面得到广泛应用［9 － 10］。本文利用
ISSR标记对采自云南省松口蘑主产地的 42 个样
品进行了遗传多样性研究，为松口蘑及其近缘种
的分类和优良品种选育提供科学的借鉴和依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试材料为 42 个松口蘑子实体。选定昆明禄
丰县，楚雄南华县、武定县 (发窝、狮子山)、禄
劝县 (茂山) ，大理魏山县、南涧县，香格里拉县
(大中甸、小中甸、碧塔海、归宝)等 10 个点采
样，样品烘干后储存备用。根据统计学要求，把样
品分为香格里拉、大理、楚雄、昆明 (因楚雄武定
距昆明较近，所以将武定样品归入昆明居群)4 个
居群，各居群采样数和取样环境见表 1。
表 1 居群及其地理情况
Tab. 1 Population and geographical features of investigated plots
居群
population
采样数
sample number
海拔 /m
altitude
坡度 / (°)
slope gradient
香格里拉 Shangri-la (S) 12 3 560 ～ 3 600 30 ～ 46
楚雄 Chuxiong (C) 12 2 340 ～ 2 620 30 ～ 48
大理 Dali (D) 9 2 330 ～ 2 570 15 ～ 30
昆明 Kunming (K) 9 2 280 ～ 2 450 30 ～ 40
1. 2 试剂及仪器
试剂:ISSR 引物，dNTP，MgCl2，10 × Buff-
er，Marker 购自上海 Sangon;TaqDNA 聚合酶购
自上海 Promaga。
仪器:电泳槽 (北京六一仪器厂) ，电泳仪
(Bio Rad) ，PCR仪 (GE9700) ，紫外分光光度计
(Beckman UV 640 型) ，凝胶成像仪 (Gensnap)。
1. 3 DNA提取与检测
采用改良的 CTAB法［11］提取总 DNA。用紫外
分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 下的光密度值
(OD值) ，然后根据 AUSUBEL 等［12］的方法确定
总 DNA的浓度和质量，将样品浓度稀释至 50 ng /
μL用于 PCR反应。
1. 4 ISSR-PCR扩增
1. 4. 1 引物的筛选
引物设计是 ISSR技术中的关键环节。本实验从
40条 ISSR引物中筛选出 16 条多态性高、重复性好
的引物进行 ISSR-PCR扩增，其引物序列见表 2。
表 2 用于松口蘑 ISSR分析的引物序列
Tab. 2 ISSR primer sequences for T. matsutake
引物
primer
序列
sequence
ISSR － 1 5 － (GCT) (AGT) (GCT) (CA)6 － 3
ISSR － 2 5 － (AGC) (ACT) (AGC) (GT)7 － 3
ISSR － 3 5 － (AGT) (GCT) (AGT) (GA)7 － 3
ISSR － 4 5 － G (CA)4C － 3
ISSR － 5 5 － (CT)8 (AG)G －3
ISSR － 6 5 － (CT)8 (AG)C － 3
ISSR － 7 5 － CCC (GT)6 － 3
ISSR － 8 5 － G (GC)G (GT)6 － 3
ISSR － 9 5 － C (GC)C (GA)6 － 3
ISSR － 10 5 － GC (AT) (GA)6G － 3
ISSR － 11 5 － CCA (GAG)4 － 3
ISSR － 12 5 － GCG (AC)6A － 3
ISSR － 13 5 － (TAT)5 － 3
ISSR － 14 5 － (GGC)5 － 3
ISSR － 15 5 － (AGC)5 － 3
ISSR － 16 5 － (ACTG)4 － 3
1. 4. 2 ISSR-PCR扩增
反 应 体 系: 总 体 积 为 20 μL， Mg2 +
2. 5 mmol /L，1 × buffer，dNTP 0. 3 mmol /L，引物
0. 25 mmol /L，模板 1 ～ 80 ng /μL，Taq DNA 聚合
酶 1 U。扩增程序:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性
30 s，52 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸 1 min，40 个循
环;72 ℃延伸 7 min。
扩增产物的检测:取 PCR产物 4 μL，与上样
缓冲液混匀，在 1. 8%琼脂糖凝胶中，以 DL2000
做 Marker，用 1 × TAE 缓冲液，DYY － 33B 型电
泳槽，电压 45 V /cm，电泳 3 h，于紫外检测仪下
观察并照相。
1. 5 数据统计及分析
按同源性条带的有无分别以 1 和 0 的格式记
录并输入计算机，构成 ISSR 表型数据矩阵输入
POPGENE 1. 32 软件进行分析。统计下列参数:
495 云南农业大学学报 第 26 卷
扩增位点数 (total bands，Nb)、多态位点数 (ef-
fective bands，Npb)多态位点百分率 (percentage
of polymorphic bands，PPB)、Shannon 多样性信
息指数 (Shannon s information index，I)、Nei s
遗传多样性指数 (Neis genetic diversity，H)、总
的基因多样度 (total genetic diversity，Ht)、居群
内遗传多样性 (genetic diversity within population，
Hs)、基因分化系数 (coefficient of gene differenti-
ation，Gst)、基因流 (Gene flow，Nm)、Nei s 遗
传距离 (Neis genetic distance，D)和遗传一致度
(Neis genetic identity，I) ，并据此用类平均法
(unweighted pair group with mathematic average，
UPGMA)进行聚类，分析各群体之间的遗传
关系［13 － 14］。
2 结果与分析
2. 1 多态位点分析
16 个 ISSR 引物电泳共检测到 74 个位点，
其中 60 条具有多态性，总多态性位点百分率
(PPB)为 76. 92% (表 3)。平均每个引物扩增
出的 4. 6 条带中有 3. 75 条具有多态性，说明云
南松口蘑 4 个居群表现出了较高的遗传多样性
(图 1)。
表 3 16 条 ISSR引物扩增的条带
Tab. 3 Amplified loci by ISSR primer 16
序号
No.
扩增位点数
total bands
(Nb)
多态位点数
effective bands
(Npb)
多态性位点百分率
/%percentage
of polymorphic
bands (PPB)
1 6 5 83. 33
2 4 3 75. 00
3 5 4 80. 00
4 3 2 66. 67
5 4 3 75. 00
6 6 4 66. 67
7 4 3 75. 00
8 5 3 60. 00
9 4 3 75. 00
10 3 2 66. 67
11 7 5 83. 33
12 4 3 75. 00
13 4 3 75. 00
14 5 4 80. 00
15 6 5 83. 33
16 4 3 75. 00
总计 total 74 60 76. 92
由 PPB值 (表 4)可知，在松口蘑的 4 个居
群中，楚雄居群的遗传多样性最为丰富，其次是
大理居群，昆明居群的遗传多样性相对较小。
2. 2 居群的遗传多样性水平分析
由表 4 可知，4 个居群中，楚雄居群的各指
标最高，Neis 遗传多样性指数 (H)为0. 287 7，
Shannon指数 (I)为0. 418 4，而昆明居群各指标
较低，Nei s 遗传多样性指数 (H)为0. 207 8，
Shannon指数 (H0)为 0. 302 4。这是因为楚雄的
海拔高度适中，松林和针阔叶林混交地分布广泛，
595第 5 期 张微思，等:云南松口蘑的 ISSR遗传多样性研究
良好的植被状况为松口蘑的生长提供了条件，产
生了较高的遗传多样性;大理和楚雄的生态环境
相类似，也有较高的遗传多样性;且两地相距
100 余 km，无地理阻隔，两个居群间可能存在基
因流动，互相有基因渗入，所以居群之间变异减
小，居群内遗传变异量增加，Shannon 指数高于
其他居群。而由于香格里拉居群海拔较高，植被
以高山栎和高山松为主，相似度较高，所以其遗
传多样性较低;昆明地区在 20 世纪 80 年代是松
口蘑主产区，但由于多年来人为干扰严重，松口
蘑产量急剧下降，人为干扰可能是导致居群遗传
多样性较低的主要原因。
表 4 4 个居群的遗传多样性水平
Tab. 4 Genetic diversity within 4 populations
居群
population
扩增位点数
Nb
多态位点数
Npb
多态位点比率 /%
PPB
Nei 遗传多样性指数
Neis genetic
diversity (H)
Shannon指数
Shannons information
index (I)
S 53 30 56. 76 0. 204 8 0. 307 4
C 58 41 70. 27 0. 287 7 0. 418 4
K 58 39 50. 00 0. 207 8 0. 302 4
D 62 31 67. 57 0. 278 7 0. 406 5
2. 3 遗传结构及遗传分化
松口蘑的居群总基因多样度指数 (Ht)为
0. 321 5，居群内基因多样度指数 (Hs)为
0. 244 7，遗传分化系数 (Gst)为0. 247 1，居群间
的基因流 (Nm)为1. 523 4 (表 5) ，说明松口蘑
遗传变异主要存在于居群间，而居群内的遗传变
异较低。这是因为松口蘑采样区域内的生态环境
及植被类型和树种相似度较高，距离较近，其自
然选择的外在动力很接近，而种群间由于其环境
不同，加之寄主植物不一样，提高了种间遗传变
异的频率。
表 5 居群的基因多样性 Neis分析
Tab. 5 Neis genetic diversity among populations
总采样数
total sample
number
居群总
基因
多样度
Ht
居群内
基因
多样度 Hs
居群间遗传
分化系数
Gst
基因流
Nm
42 0. 321 5 0. 244 7 0. 247 1 1. 523 4
2. 4 遗传距离
遗传距离是显性频率的函数，用于分析群体
间的遗传相似性，反映不同居群间的遗传距离和
遗传一致度。由表 6 可知，遗传距离最小的为楚
雄居群和大理居群，最大的是香格里拉居群和昆
明居群。
表 6 Neis 遗传一致度 (I)和遗传距离 (D)
Tab. 6 Neis genetic identity (I) (above diagonal)
and genetic distance (D) (below diagonal)
居群
population
S C K D
S ＊＊＊＊ 0. 885 2 0. 844 4 0. 870 6
C 0. 121 9 ＊＊＊＊ 0. 895 7 0. 888 5
K 0. 169 1 0. 110 2 ＊＊＊＊ 0. 854 2
D 0. 138 6 0. 107 0 0. 157 6 ＊＊＊＊
根据居群间的遗传距离计算方法 (UPGMA)
进行聚类分析，结果见图 2。亲缘关系的远近可
能与地理位置的远近相关，楚雄和大理相邻，海
拔高度接近，且都是青藏高原向东南沿伸至云贵
高原的第一站，其生态环境类似，没有生境的中
断，基因交流频繁，亲缘关系最近。而香格里拉
和昆明相隔较远，两地海拔高度相差大，生态环
境迥异，与之协同进化的寄生树种完全不同，遗
传变异大，基因交流强度弱，亲缘关系远。另外，
昆明地区人为活动频繁，生态环境破坏较严重，
可能是昆明松口蘑遗传多样性降低的主要原因，
695 云南农业大学学报 第 26 卷
导致其遗传距离与其余居群差异最大。
3 讨论
基因流是影响群体内部和群体间遗传变异程
度的重要因素，基因流越大，群体间的相似性越
大［13 － 15］。松口蘑居群的基因流 Nm 为1. 523 4，表
明居群间基因交流正常。同时，遗传分化系数 Gst
为0. 247 1，说明松口蘑遗传变异主要存在于居群
间，居群内出现较低的遗传分化。在云南，造成
居群间遗传分化的主要原因是松口蘑的生存环境
较为复杂，一般都在海拔2 000 ～ 3 500 m 的高原，
而其本身对温度、光照、湿度的要求又比较特殊，
多数类群寄生植物仅限于松和栎等松科和壳斗科
植物，植被的人为破坏也可能是加速其种间的遗
传分化的原因之一。
松口蘑遗传多样性的研究，既可以为松口
蘑的科学分类提供方法，又能为保护松口蘑提
供科学的依据。就云南松口蘑现状来看，应当
采取以保护松口蘑生态环境为主，配合科学的采
收方法，实施一系列维持松口蘑生产以及提高松
口蘑产量的可行措施，坚决禁止采集和收购未成
熟的幼茸。就人工栽培或半人工栽培而言，先
研究其遗传多样性，选择优良品种加强科研力
度，力求有所突破，这样才能实现物种多样性
和经济利益的双赢。
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