全 文 ：皖南与皖西南蚕区球孢白僵菌种群
遗传结构的 ISSR分析*
李佳丽摇 蔡摇 悦摇 栾丰刚摇 王摇 滨摇 李增智**
(安徽农业大学微生物防治省重点实验室, 合肥 230036)
摘摇 要摇 由球孢白僵菌引起的家蚕白僵病是影响蚕业生产的重要因素之一.本研究在皖南泾
县和皖西南潜山县蚕区的病蚕、蚕室环境、蚕室周边桑园、松林及农田调查取样,共分离出 124
株球孢白僵菌;通过 ISSR分子标记对它们及用于防治松毛虫的菌株进行种群遗传结构分析,
追踪家蚕白僵病的来源及传播途径.结果表明: 两个地区的球孢白僵菌种群均为异质性明显
的种群.潜山的蚕病亚种群是多源的,而泾县的蚕病亚种群是单源的;泾县蚕病亚种群和潜山
的蚕病优势亚种群具有典型的地方性,只在蚕室内循环侵染家蚕,引起低频常在性的地方性
白僵病;而潜山的非优势亚种群可以在蚕室外的少数转主寄主中传播.在两地松林的松毛虫
种群中流行的类群、真菌杀虫剂生产菌株以及在潜山蚕室附近引起螳螂种群流行病的类群均
与蚕病类群无关,表明其对蚕业是安全的.
关键词摇 家蚕摇 白僵病摇 球孢白僵菌摇 种群遗传结构摇 ISSR
文章编号摇 1001-9332(2010)12-3239-09摇 中图分类号摇 S476摇 文献标识码摇 A
Population genetic structure of Beauveria bassiana from south and southwest Anhui sericul鄄
tural regions: ISSR analysis. LI Jia鄄li, CAI Yue, LUAN Feng鄄gang, WANG Bin, LI Zeng鄄zhi
(Anhui Province Key Laboratory of Microbial Control, Anhui Agricultural University, Hefei 230036,
China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21(12): 3239-3247.
Abstract: White muscardine caused by Beauveria bassiana is an important factor affecting sericul鄄
ture. In the present study, a total of 124 B. bassiana isolates were obtained from the silkworm ca鄄
davers, rearing rooms and appliances, surrounding mulberry orchards, pine plantations, and crop鄄
lands in Jingxian County of south Anhui and Qishan County of southwest Anhui. Together with the
mass production strains, the isolates were analyzed for population genetic structure by ISSR markers
to trace the origin and the spreading track of the muscardine. The results showed that the two B.
bassiana populations in Jingxian County and Qishan County were heterogenic, being monophyletic
in Jingxian and polyphyletic in Qishan. Both the Jingxian population and the Qianshan predominant
subpopulation were characterized typically by enzootic nature, i. e. , low incidence and frequent oc鄄
currence, but the Qianshan non鄄predominant subpopulation could spread among some alternate
hosts outside the rearing rooms. The groups prevailing in pine caterpillar populations in the pine
plantations of Qianshan and Jingxian, the production strains, and the epizootic strain prevailing in
surrounding mantids were all not associated to the silkworm muscardine, displaying safety to sericul鄄
ture.
Key words: silkworm; white muscardine; Beauveria bassiana; population genetic structure; ISSR.
*国家自然科学基金项目(30972368)和教育部高等学校博士点专
项科研基金项目(200503644001)资助.
**通讯作者. E鄄mail: zzli@ ahau. edu. cn
2010鄄04鄄26 收稿,2010鄄09鄄14 接受.
摇 摇 家蚕(Bombyx mori)是世界上最重要的资源昆
虫之一.蚕桑业是我国及许多发展中国家的重要产
业.包括白僵病在内的各种蚕病对蚕业危害极大.自
Bassi[1]确定球孢白僵菌 (Beauveria bassiana)(以下
简称“白僵菌冶)是家蚕白僵病的病原以来,这种常
见蚕病一直被认为是蚕桑业发展的限制因素. 白僵
菌是最常见的虫生真菌之一,具有极其丰富的遗传
多样性[2-4],不同菌株具有不同的寄主专化性[5-6];
在我国广泛应用于防治多种农林害虫,其中在南方
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 12 月摇 第 21 卷摇 第 12 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Dec. 2010,21(12): 3239-3247
防治马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus) (以下简称
“松毛虫冶)和在东北防治玉米螟(Ostrinia furnaca鄄
lis)是世界上最大和最成功的生物防治项目之一,经
济效益和社会效益十分显著.
由于白僵菌是家蚕易感寄主之一,所以关于在
蚕区能否使用白僵菌防治农林害虫的问题长期以来
争论很大[7-8] .在生产实践中不少蚕区附近尽管大
量施用白僵菌杀虫剂,却并未引起家蚕白僵病的大
流行.例如,浙江安吉县东风林场[9]和安徽合肥蜀
山林场[10]70 年代在蚕区范围内使用白僵菌防治松
毛虫后未发现对周围地区家蚕生产造成任何不良影
响.陈昌洁等[7]在 20 世纪 70 年代对白僵菌使用区
家蚕白僵病发生情况进行过调查,发现发病率为
0 ~ 3郾 67% ,平均 0郾 56% ,属正常发病范围. 他们还
进行了生产菌株和蚕病株的酯酶同工酶分析、接种
试验、孢子宿存以及桑叶污染等试验,得出在蚕区可
以使用白僵菌防治害虫的结论.然而,在养蚕业中多
不加区别地主张[8, 11]不用白僵菌杀虫剂,一些行政
部门甚至一概禁止在蚕区使用白僵菌杀虫剂. 近年
来随着我国蚕桑业的发展和“东蚕西移冶战略的实
施,生物防治与蚕病的矛盾愈显突出.
近 20 年来,分子生态学技术飞速发展,人们开
始从分子水平上对球孢白僵菌的遗传多样性进行研
究.随着分子标记技术日臻成熟和先进,越来越多的
DNA分子标记,如酯酶同工酶、RFLP、RAPD、28S
rDNA I型内含子、SSR 等已应用于虫生真菌的遗传
多样性的研究,使得我们可以愈来愈精确地追踪病
源及其宿存和扩散[12],或更可靠地评价人为放菌防
治害虫的效果[13] . 锚定简单序列重复( inter鄄simple
sequence repeat,ISSR)是在微卫星(SSR)基础上创
建的一种简单序列重复区间扩增多态性的新型的分
子标记.与 RAPD和 RFLP 相比,ISSR 序列较长(长
度在 20 bps 左右),退火温度高,具有更高的重复
性,揭示的多态性较高,可获得几倍于 RAPD的信息
量,精确度几乎可与 RFLP 相媲美,检测非常方便,
因而是一种非常理想的分子标记,现已在动物、植
物、微生物的品种或菌株鉴定、遗传作图、基因定位、
遗传多样性、进化及分子生态学研究中[14]应用.
本研究拟使用 ISSR 技术了解发生在皖南泾县
和皖西南潜山县蚕区白僵菌的遗传结构,追踪家蚕
白僵病流行的病源及其传播途径,确定病源与附近
环境中人为施放(71 和 77 号菌株)和自然流行的白
僵菌的关系,从而为协调地进行蚕病防治和害虫生
物防治提供依据.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试菌株
在供试的 126 个菌株中,71 号为皖霍邱的生产
菌株 RCEF0013(分离自松毛虫),77 号为生产无纺
布菌条供防治松墨天牛的 RCEF0383(分离自日本
的松墨天牛),均来自安徽农业大学微生物防治省
重点实验室菌种库,其余 124 株来自皖西南大别山
区潜山县槎水镇和皖南山区泾县章渡镇,其中潜山
75 株,泾县 49 株. 各菌株编号、分离基质等信息见
表 1.其中的桑园、松林和农田均在蚕室周围 50 ~
100 m.采集的僵虫及土壤经多果定-结晶紫燕麦选
择性培养基[15]分离,SDAY 培养基纯化,经显微形
态鉴定为白僵菌后保存于安徽农业大学微生物防治
省重点实验室.
1郾 2摇 研究方法
1郾 2郾 1 菌丝体制备摇 在 0郾 1%吐温水中将上述供试
菌株制成孢子悬浮液,取 0郾 2 ml接种于加铺玻璃纸
的 SDAY培养基平板上,倒置于恒温光照培养箱中
(25依1)益下培养 3 ~ 5 d.将长满全皿而未大量产孢
的菌体在无菌条件下取出,置于 5 ml 的无菌离心管
中,经冷冻干燥后于-20 益保存备用.
1郾 2郾 2 DNA提取与 ISSR引物筛选摇 参照朱衡等[16]
的方法提取菌体总 DNA,以 0郾 8%琼脂糖凝胶电泳
检测基因组 DNA,用核酸测定仪(Labsystems)测得
浓度后,将样品浓度稀释到 20 ng·滋l-1,保存于
-20 益备用.对合成的 62 个 ISSR 引物(上海生工)
以 26、71 和 83 号等 3 个菌株的 DNA 为模板,在 15
ul反应体系中进行引物扩增效果及可重复性检测,
确定引物最佳浓度、延伸时间、复性温度等. 最终选
出 10 个扩增条带清晰、重复性好及多态性高的ISSR
引物(表 1)用于 126 个菌株的 PCR扩增.
1郾 2郾 3 ISSR鄄PCR反应条件及程序 摇 ISSR鄄PCR 扩增
反应在 PCR扩增仪(Bio鄄Rad)上进行.反应体系(15
滋l)如下:1郾 5 滋l 10伊PCR buffer(200 mmol·L-1 Tris鄄
HCI,pH 8郾 4,2郾 5 mmol·L-1 MgCl2,500 mmol·L-1
KCl), 0郾 25 mmol·L-1 dNTPs, 0郾 6 滋mol·L-1引物,
0郾 5 U Taq DNA polymerase 和 20 ng 模板 DNA. PCR
扩增程序:94 益预变性 2 min, 然后 94 益变性 45 s,
48 益 ~54 益复性 45 s,72 益延伸 1郾 5 min;共 35 个
循环,最后 72 益延伸 10 min. PCR 产物在 2%琼脂
糖凝胶(含 EB 终浓度为 0郾 5 滋g·ml-1)中电泳,电
压为 3 V·cm-1 .用 Tanon GIS鄄2008 凝胶成像系统检
测拍照.
0423 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
表 1摇 124 株供试白僵菌菌株的来源
Tab. 1摇 Origins of 124 Beauveria bassiana isolates studied
产 地
Location
分离基质
Substrate
菌株编号
Strain number
潜 山 家蚕 Bombyx mori 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15
Qianshan 螳螂 Mantids
棕污斑螳 Statilia maculata
中华大刀螳 Tenodera sinensi
16, 17, 18, 19, 21, 25
20, 22, 23, 24
桑园土壤 Mulberry soil 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,39, 40, 41, 42, 43
农田土壤 Cropland soil 44, 45
松林土壤 Pine forest soil 46, 47, 48, 49, 50, 51
蚕室用具、地面、墙面 Appliances, floors, and walls in rearing room 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70
其他昆虫 Other insects 52, 53(鳞翅目幼虫 Lepidopteran larva), 54(卷叶蛾幼虫
Totricid larva), 55(蚂蚁成虫 Ant adult), 56(象甲成虫
Curculionid adult), 57(鞘翅目成虫 Coleopteran adult)
马尾松毛虫 Dendrolimus punctatus 72, 73, 74, 75, 76
泾 县
Jingxian
家蚕 Bombyx mori 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
99, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,
102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110
桑园土壤 Mulberry orchard soil 120, 121, 122
松林土壤 Pine plantation soil 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119
其他昆虫 Other insects (鳞翅目毒蛾科幼虫, All were larvae of Ly鄄
mantridae, Lepidoptera)
123, 124, 125, 126
马尾松毛虫 Dendrolimus punctatus 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85
1郾 3摇 数据处理
将电泳图谱利用 BandScan V 5郾 0 软件进行电
泳条带迁移率分析,把同一迁移率的条带视为公共
带,其余为特异带,表示有多态性.分别记为“1冶(代
表显性基因)和“0冶(代表隐性基因),把迁移率数据
转化成0、1矩阵.利用NTSYS鄄pc(Version 2郾 10e)软件
进行 UPGMA聚类分析,并分别按照采集地点、寄主
信息分为不同的群体,利用 POPGENE 32软件计算各
群体的 Nei基因多样性指数(He)、Shannon 信息多样
性指数(H)、多态位点百分率(PPL)、群体内基因多
样度(Hs)、总基因多样度(Ht)和基因分化系数(Gst).
2摇 结果与分析
2郾 1摇 ISSR扩增产物的多态性
对 62 个 ISSR扩增产物进行筛选,选择了扩增
结果稳定,多态性好的 10 个引物进行分析,引物编
号、序列及扩增结果见表 2.
62 个引物对 126 个菌株共扩增出 108 条带,其
中 98 条为多态性条带,多态性为 90郾 7% ,每个引物
扩增的 DNA带数在 6 ~ 15 条,平均 11 条. 引物 P6
扩增位点数和多态位点数最多,分别为 15 条和 14
条,最少的引物为P10,扩增出6条.其中,多态性百
表 2摇 供试引物及扩增特征
Tab. 2摇 Inter鄄simple sequence repeat (ISSR) primers and their properties
引物号
Primer
code
序列(5爷鄄3爷)
Sequence
(5爷鄄3爷)
解链温度
Melting
temperature
(Tm) (益)
复性温度
Annealing
temperature
(益)
扩增位点数
Number of
amplified bands
多态位点数
Number of
polymorphic bands
多态位点百分率
Percentage of
polymorphic loci
(% )
Nei基因
多样性指数
Nei爷s gene diversity
index (He)
P4 (AC) 8T 52郾 2 52 11 9 81郾 8 0郾 1802
P5 (AAG) 6 48郾 2 48 12 12 100郾 0 0郾 3027
P6 (AG) 8S 54郾 6 54 15 14 93郾 3 0郾 2218
P8 (GAG) 4GC 55郾 9 54 10 9 90郾 0 0郾 3082
P9 (GACA) 4 51郾 6 54 9 9 100郾 0 0郾 2674
P10 (AC) 8YC 56郾 2 52 6 5 83郾 3 0郾 2647
P11 (AG) 8C 54郾 6 54 8 8 100郾 0 0郾 3148
P12 TG(CA) 6C 50郾 8 50 11 8 72郾 7 0郾 2129
P53 (GTC) 6 61郾 9 54 13 12 92郾 3 0郾 2801
P59 (AG) 8YC 56郾 2 50 13 12 92郾 3 0郾 3223
Y=(C, T); S=(C, G).
142312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李佳丽等: 皖南与皖西南蚕区球孢白僵菌种群遗传结构的 ISSR分析摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 1摇 引物 P53 对 126 株白僵菌扩增的电泳图
Fig. 1摇 ISSR profiles of 126 Beauveria bassiana isolates amplified with primer P53.
M:分子量标准 2 kb DNA.
分率最高的引物 P5、P9 和 P11 均达 100% . Nei基因
多样性指数(He)最高的为 P59. 图 1 为引物 P53 的
扩增图谱.
2郾 2摇 聚类分析
根据个体间的遗传距离进行 UPGMA 聚类分析
发现(图 2),126 株白僵菌之间遗传分化较大,遗传
距离范围在 0 ~ 0郾 767.它们在 0郾 334 的遗传距离上
明显聚成四大类群. 而最大的类群在 0郾 251 的遗传
距离上又可明显分为全由潜山菌株组成的第玉类和
全由泾县菌株组成的第域类. 第二大类群在遗传距
离 0郾 300 处也可分为第芋类和第郁类. 第郁类全部
是泾县分离株,而第吁和第遇类全部是潜山分离株.
由此可见,菌株的遗传相似性同地理来源关系极其
密切.
摇 摇 然而,第芋类却由潜山菌株和泾县菌株混杂组
成,所包含的 15 个菌株除 77 号为来自日本的松墨
天牛分离株外,其余皆为松毛虫分离株,同寄主来源
的关系较为密切.其中潜山的松毛虫分离株聚在一
起形成一个类群,而泾县的松毛虫分离株除 78 号落
入潜山类群外,其余皆聚为一个类群.尽管这里也明
显表现出同地理来源的相关性,但这一类群几乎完
全是由松毛虫这一寄主所决定的.长期以来,用于生
产白僵菌杀虫剂供大面积防治松毛虫用的 71 号松
毛虫分离株(产地皖西霍邱)也落入潜山类群.用于
生产白僵菌无纺布菌条并用于大面积防治松墨天牛
的 77 号日本菌株与潜山类群遗传距离稍近,但自成
一个类群.比这更为典型的是,第遇类的 10 个菌株
全部为螳螂分离株.因此,本研究中的 126 个菌株首
先展示了同地理来源的相关性,其次也明显地表现
出同寄主的相关性.
潜山的第玉类在遗传距离 0郾 209 处聚成两个亚
类:由僵蚕以及蚕室地面、墙面和蚕具分离株组成的
I鄄1 亚类和由桑园、松林、农田土壤、蚕室蚕具以及其
他昆虫分离株所组成的 I鄄2 亚类. I鄄2 亚类不含僵蚕
分离株,土壤中的白僵菌可能来自其他昆虫的僵虫.
该亚类已污染了蚕室、蚕具,但未能侵染家蚕. 值得
注意的是,作为潜山家蚕白僵病的主病源的 I鄄1 亚
类中的僵蚕分离株之间存在较高的遗传异质性;在
遗传距离 0郾 159 处明显分为两个类群.另外,在遗传
距离甚远的第 V类也含有 2 个僵蚕分离株,构成了
潜山家蚕白僵病的次病源. 因此潜山家蚕白僵病的
病源是多源(polyphyletic)的.由于第 V 类中还涉及
到 4 种其他昆虫(2 种鳞翅目幼虫、1 种卷叶蛾幼虫
和 1 种蚂蚁成虫),因此须注意它们可能成为蚕病
株的转主寄主,应防止它们进入或将它们带入蚕室.
然而,本研究在桑园中未能观察到野蚕 (Bombyx
mandarina )、 桑蟥 ( Rondotia menciana )、 金毛虫
(Porthesia similis xanthocampa)和桑尺蠖(Phthonan鄄
dria atrilineata)等桑树害虫,而这些易随桑叶进入蚕
室的昆虫是否会感染白僵病以及其病原与家蚕白僵
病是否有关尚有待今后研究,但无论如何,必须防止
桑叶污染对白僵病的影响.
相比之下,作为泾县的家蚕白僵病病源的第 II
类群的遗传异质性低得多,各小类群之间的遗传距
离最大也只有 0郾 032,表明它们之间的遗传分化极
小,是单源的(monophyletic) .
第吁类由桑园、松林和农田土壤、各种昆虫以及
蚕室墙面和地面的分离株组成,由于没涉及到僵蚕,
2423 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
图 2摇 126 株球孢白僵菌遗传距离 UPGMA聚类分析图
Fig. 2 摇 Clustering dendrogram of 126 Beauveria bassiana iso鄄
lates by UPGMA clustering analysis.
因此所涉及到的其他昆虫(2 种鳞翅目幼虫、1 种卷
叶蛾幼虫和 1 种蚂蚁成虫)成为转主寄主的可能性
不大.
摇 摇 由于在潜山和泾县两地的桑园、森林和农田土
壤中均未分离到潜山家蚕白僵病主病源所在的第 I鄄
1 亚类和泾县的病源第域类的菌株,所以两地的家
蚕白僵病都是只能在蚕室内以低频常在特点引起家
蚕白僵病的地方性疾病.根据调查,这两处家蚕的僵
病发病率在正常年份只有 0郾 2% ~ 0郾 3% .然而在潜
山须注意防止第吁类取代第 I鄄1 亚类上升为主病
源,否则,这一可在其他昆虫种群中流行并可在土壤
中宿存的类群有可能在家蚕中引起流行规模较大的
白僵病.
2郾 3摇 两个白僵菌种群的遗传距离
利用 POPGENE 32 软件对潜山地区和泾县地区
白僵菌种群内 Nei 遗传一致度( I)和标准遗传距离
(D)进行分析(表 3,表 4)使得家蚕白僵病的病源更
为清晰. 潜山种群各分离基质亚种群间的 D 在
0郾 028 ~ 0郾 599 之间,平均 0郾 251;I 在 0郾 550 ~ 0郾 973
之间,平均 0郾 795;其中松林土壤亚种群和桑园土壤
亚种群间的 D最近而 I 最高;螳螂亚种群和松毛虫
亚种群间 D最远而 I 最低. 泾县种群各亚种群间的
D在 0郾 011 ~ 0郾 398 之间,平均 0郾 213;I 在 0郾 672 ~
0郾 990 之间,平均 0郾 816;其中松林土壤亚种群与桑
园土壤亚种群间以及其他昆虫亚种群与松林土壤亚
种群间 D最近而 I 最高,家蚕白僵病亚种群(以下
简称“蚕病亚种群冶)与松毛虫白僵病亚种群(以下
简称“松毛虫亚种群冶)之间 D 最远而 I 最低. 考察
两地家蚕分离株亚种群与其他亚种群之间的 D,皆
是与松毛虫的距离最远.生物测定表明,使用松毛虫
分离株使家蚕死亡 25%的 LC25、LD25和 LT50分别为
使用家蚕分离株使家蚕死亡 75% 的 LC75、LD75和
LT75的 1327、1321 和 1郾 5 倍(另文发表). 这进一步
说明,组成第芋类的潜山、泾县和霍邱(生产菌株)
的松毛虫分离株与蚕病无关,在蚕区使用白僵菌杀
虫剂防治松毛虫对家蚕是安全的,不会对家蚕造成
威胁.另外,在潜山造成螳螂白僵病大流行的第遇
类,同蚕病亚种群的 D 距离也很远,因此这种泛流
行病与家蚕白僵病无关.
2郾 4摇 两个白僵菌种群的基因流和遗传分化
对分离自不同分离基质的 126 个菌株进行
POPGENE分析,结果进一步显示,潜山白僵菌种群
的多态位点百分率(PPL)为 88郾 8% ,Nei 基因多样
性指数 (He )为 0郾 2522, Shannon 信息多样性指数
(H)为0郾 390;而泾县种群的PPL为67郾 74% ,He为
342312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李佳丽等: 皖南与皖西南蚕区球孢白僵菌种群遗传结构的 ISSR分析摇 摇 摇 摇 摇 摇
表 3摇 潜山地区不同分离基质上的球孢白僵菌亚种群间的遗传一致度和遗传距离
Tab. 3摇 Genetic identity (I) and genetic distance (D) of different subpopulations of Beauveria bassiana isolated in Qianshan
群体 Group 1 2 3 4 5 6 7 8
1 - 0郾 684 0郾 892 0郾 889 0郾 894 0郾 932 0郾 922 0郾 647
2 0郾 380 - 0郾 689 0郾 721 0郾 662 0郾 692 0郾 759 0郾 550
3 0郾 114 0郾 373 - 0郾 885 0郾 973 0郾 914 0郾 889 0郾 648
4 0郾 118 0郾 327 0郾 122 - 0郾 895 0郾 862 0郾 918 0郾 571
5 0郾 112 0郾 412 0郾 028 0郾 111 - 0郾 890 0郾 903 0郾 625
6 0郾 070 0郾 368 0郾 090 0郾 149 0郾 117 - 0郾 909 0郾 660
7 0郾 081 0郾 276 0郾 118 0郾 085 0郾 102 0郾 096 - 0郾 623
8 0郾 436 0郾 599 0郾 435 0郾 560 0郾 470 0郾 415 0郾 473 -
1) 家蚕 Bombyx mori; 2) 螳螂 Mantids; 3) 桑园土壤 Mulberry orchard soil; 4) 农田土壤 Cropland soil; 5) 松林土壤 Pine plantation soil; 6) 蚕室
用具、地面、墙面 Appliances, floors, walls in rearing room; 7) 其他昆虫 Other insects; 8) 松毛虫 Dendrolimus punctatus. 对角线上方数字为 Nei遗
传一致度,对角线下方的数字为 Nei标准遗传距离 Above diagonal was Nei genetic identity I and below diagonal was Nei standard genetic distance D.
下同 The same below.
表 4摇 泾县地区不同分离基质上的球孢白僵菌群体间的遗
传一致度和遗传距离
Tab. 4 摇 Genetic identity ( I) and genetic distance (D) of
different subpopulations of Beauveria bassiana isolated in
Jingxian
群体 Group 1 2 3 4 5
1 - 0郾 773 0郾 772 0郾 770 0郾 672
2 0郾 258 - 0郾 990 0郾 987 0郾 736
3 0郾 259 0郾 011 - 0郾 989 0郾 743
4 0郾 262 0郾 013 0郾 011 - 0郾 731
5 0郾 398 0郾 306 0郾 298 0郾 313 -
0郾 1899,H为 0郾 2922,均小于潜山种群. 潜山种群的
遗传异质性明显高于泾县种群. 两个种群的基因流
和基因分化系数解释了其原因.表 5 表明,两个种群
内各亚种群间基因流动及其所引起的基因分化差异
较大,其中潜山种群各亚种群间的基因流(Nm)在
0郾 073 ~ 1郾 766 之间,平均 0郾 410,总体上尚未达到基
因分化的阈值 1;但基因分化系数(Gst)在 0郾 124 ~
0郾 798 之间,平均 0郾 468,这意味着 46郾 8%的分子变
异来自各亚种群之间,而 53郾 2%的分子变异来自亚
种群内. 0郾 468 的 Gst超过了 Wright 的重度分化的起
点 0郾 25,显然这是由于其中某些亚种群之间 Gst过大
而致,例如其中松毛虫亚种群和螳螂亚种群之间的
Gst高达 0郾 798,松毛虫亚种群和蚕病亚种群之间的
Gst高达 0郾 654;这种高度分化的倾向是由于它们之
间基因交流十分微弱而致. 正是这种高度分化的倾
向,使得使用白僵菌防治松毛虫的生产活动既不会
对天敌昆虫螳螂、也不会对桑蚕饲养产生不利的影
响.桑园土壤亚种群和松林土壤亚种群间的 Nm 最
大而 Gst最小,表明这两个亚种群之间遗传交流最活
跃,使得它们之间表现出趋同的倾向.其次要数蚕病
亚种群同蚕室墙壁、地面和蚕具亚种群间 Nm 最大
而 Gst最小,这是它们之间的遗传距离小而遗传一致
度高的原因.基因流大显然是因僵蚕对蚕室的污染
造成的,因此在蚕病防治中蚕室的消毒极其重要.
D、I和 Gst这几个值都反映,同家蚕间的关系相比,
各种土壤同其他昆虫白僵病亚种群(以下简称“其
他昆虫亚种群冶)的关系更为密切,这说明其他昆虫
分离株对土壤造成了污染,以致基因流较大.至于其
他昆虫亚种群与蚕病亚种群之间的关系,D、I、Gst和
Nm 这几个值都反映,潜山亚种群比泾县亚种群要密
切得多.因此,在潜山更应密切注意其他昆虫(不包
表 5摇 潜山地区按分离基质划分的球孢白僵菌各亚种群间的基因流和基因分化系数
Tab. 5摇 Gene flow (Nm) and genetic differentiation coefficient (Gst) of Beauveria bassiana isolated from different substrates
for Qianshan
群体 Group 1 2 3 4 5 6 7 8
1 - 0郾 182 0郾 430 0郾 415 0郾 453 0郾 775 0郾 734 0郾 127
2 0郾 579 - 0郾 119 0郾 189 0郾 104 0郾 220 0郾 328 0郾 064
3 0郾 368 0郾 677 - 0郾 392 1郾 766 0郾 678 0郾 505 0郾 163
4 0郾 376 0郾 570 0郾 390 - 0郾 421 0郾 482 0郾 706 0郾 073
5 0郾 356 0郾 707 0郾 124 0郾 373 - 0郾 556 0郾 622 0郾 096
6 0郾 245 0郾 533 0郾 270 0郾 342 0郾 311 - 0郾 646 0郾 172
7 0郾 254 0郾 433 0郾 331 0郾 263 0郾 287 0郾 278 - 0郾 082
8 0郾 664 0郾 798 0郾 606 0郾 774 0郾 724 0郾 595 0郾 754 -
对角线上方数字为基因流 Nm, 对角线下方的数字为基因分化系数 Gst; Above diagonal was gene flow (Nm), and below diagonal was genetic differ鄄
entiation coefficient (Gst) .
4423 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
表 6摇 泾县地区按分离基质划分的球孢白僵菌各亚种群间
的基因流和基因分化系数
Tab. 6摇 Gene flow (Nm) and genetic differentiation coeffi鄄
cient (Gst ) of Beauveria bassiana isolated from different
substrates for Jingxian
群体 Group 1 2 3 4 5
1 - 0郾 205 0郾 166 0郾 135 0郾 044
2 0郾 555 - 2郾 500 1郾 382 0郾 067
3 0郾 601 0郾 091 - 2郾 654 0郾 093
4 0郾 650 0郾 153 0郾 086 - 0郾 064
5 0郾 850 0郾 789 0郾 729 0郾 796 -
括螳螂)的白僵病,防止这些昆虫成为家蚕白僵病
的转主寄主.
泾县的情况刚好相反. 各亚种群内的 Nm 在
0郾 044 ~ 2郾 654 之间,平均 0郾 731,总体上没有超过基
因分化的阈值 1;Gst在 0郾 086 ~ 0郾 850 之间,平均
0郾 530,虽然也属重度分化之列,但远低于潜山种群;
而且,分子变异主要来自各亚种群之间(53% ),只
有 47%来自亚种群内. Nm 最小而 Gst最大的为蚕病
亚种群和松毛虫亚种群之间;Nm 最大而 Gst最小的
为松林土壤亚种群和其他昆虫亚种群间. 这一分子
机制就是潜山种群异质性高于泾县种群的原因.
2郾 5摇 两个白僵菌种群中家蚕分离株亚种群内的遗
传距离
前面的聚类分析和 POPGENE 分析都表明潜山
种群中由第 I鄄1 类和第吁类僵蚕分离株组成的亚种
群的遗传异质性比泾县亚种群高得多. 分析两个亚
种群各自的 I和 D可进一步详细了解其差异程度.
潜山的15个分离株的D平均为0郾 163(0郾 009
表 7摇 潜山和泾县家蚕白僵病病原白僵菌亚种群的遗传相似度和遗传距离
Tab. 7摇 Genetic similarity and genetic distance of silkworm-pathogenic subpopulations of Beauveria bassiana at Qianshan
and Jingxian
地区
Area
遗传相似度 Genetic similarity
X依SD CV Max Min
遗传距离 Genetic distance
X依SD CV Max Min
潜山 Qianshan 0郾 859依0郾 029B 0郾 034 0郾 991 0郾 685 0郾 163依0郾 117A 0郾 718 0郾 413 0郾 009
泾县 Jingxian 0郾 978依0郾 009A 0郾 009 1郾 000 0郾 943 0郾 022依0郾 010B 0郾 455 0郾 058 0郾 000
X依SD: 平均数依标准差 Mean 依 standard deviation; CV: 变异系数 Variation coefficient; Max: 最大值 Maximum; Min: 最小值 Minimum.
~ 0郾 413),极显著(不成对 t 检验,P<0郾 01)大于泾
县的 25 个分离株(平均 0郾 022,0 ~ 0郾 058);I 平均为
0郾 859(0郾 685 ~ 0郾 991),极显著低于泾县亚种群(平
均 0郾 978,0郾 943 ~ 1). 泾县亚种群中有 4 个分离株
之间 D 最小值为 0,I 最大值为 1,表明它们系同一
菌株.分析变异系数 CV(标准差 /平均数)可进一步
揭示两个亚种群中各个体的变动和偏离程度,即各
菌株的遗传异质程度.表 7 表明,潜山亚种群遗传相
似度的 CV 0郾 034 远高于泾县亚种群的 0郾 009,遗传
距离的 CV 0郾 718 远高于泾县亚种群的 0郾 455:潜山
亚种群遗传相似性的变动程度是泾县亚种群的 3郾 8
倍,遗传距离的变动程度是泾县亚种群的 1郾 6 倍.这
些分析进一步证明,泾县的家蚕白僵病源自一个近
乎同质的单系的亚种群,而潜山的家蚕白僵病源自
一个异质性较高的多系的亚种群.
2郾 6摇 两个白僵菌种群中家蚕分离株亚种群内的基
因流和遗传分化
基于遗传距离的 UPGMA 聚类分析,在遗传距
离 0郾 159 和 0郾 023 处分别将潜山地区和泾县地区家
蚕白僵菌亚种群分成 3 个小群体,分别对两个亚种
群进行利用 POPGENE 32 分析,计算基因分化系数
和基因流.
摇 摇 从表 8 可知,潜山亚种群各小群体间 Nm =
0郾 177,表明基因交流不畅;而基因分化系数 Gst达到
0郾 586,这意味着有 58郾 6%的分子变异出于小群体
间,而仅有 41郾 4%的分子变异出于亚种群内;0郾 586
的 Gst远远超过重度分化的起点.而泾县地区的情况
则相反,Gst只有 0郾 199,略超中度分化的起点 0郾 15,
表明只有 19郾 9%的分子变异存在于小群体间,而小
群体内的分子变异则高达 80郾 1% ,表明本来就不大
的分子变异主要存在于小群体内;小群体间的 Nm
达到 1郾 007,大于基因分化的阈值 1.
表 8摇 潜山和泾县家蚕白僵病病原白僵菌亚种群的基因流
和基因分化系数
Tab. 8摇 Gene flow and gene differentiation coefficient of the
silkworm鄄pathogenic subpopulations of Beauveria bassiana
at Qianshan and Jingxian
地区 Area Ht Hs Gst Nm
潜山 Qianshan 0郾 234依0郾 039 0郾 097依0郾 013 0郾 586 0郾 177
泾县 Jingxian 0郾 045依0郾 016 0郾 036依0郾 011 0郾 199 1郾 007
Ht:总的遗传多样性 Total genetic diversity; Hs:亚种群内遗传多样性
Within鄄subpopulation genetic diversity; Gst:基因分化系数 Gene differ鄄
entiation coefficient; Nm: 基因流 Gene flow.
542312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李佳丽等: 皖南与皖西南蚕区球孢白僵菌种群遗传结构的 ISSR分析摇 摇 摇 摇 摇 摇
3摇 讨摇 摇 论
基因流是进化的重要动力(或压力)之一.进化
的结果是加剧或削弱各群体间的基因分化. 根据
Wright[17]的标准,Nm = 1 是基因分化的阈值,低于 1
即表明群体间基因流不畅,遗传交换较少,从而会导
致基因分化的加强;高于 1 则基因渗透和交流加强,
发挥均质化作用,阻止不同亚种群间因遗传飘变而
引起遗传分化.他的 F统计方法[18]被用于计算固定
指数 Fst来估算因亚种群间的变异而造成的遗传变
异的总量,代表由遗传飘变而造成的遗传分化:Fst
在 0 ~ 0郾 05 之间,表明各群体间不存在分化,在
0郾 05 ~ 0郾 15 之间为中度分化,在 0郾 15 ~ 0郾 25 之间
则为高度分化,而 0郾 25 以上则为重度分化. 这些指
标被广泛用于种群遗传学研究[19] . 为方便起见,本
文采用文献[20-21]的方法,用等价的基因分化指
数 Gst代替 Fst .
潜山的白僵菌种群内各亚种群间基因流 Nm 平
均仅为 0郾 410,而泾县则达到 0郾 731,从而造成了潜
山种群的异质性高于泾县种群,具体表现在潜山各
亚种群间的遗传一致度小于泾县,遗传距离和基因
分化系数大于泾县. 这种现象在两地的家蚕白僵病
分离株亚种群表现得更为突出:潜山的蚕病亚种群
内各小类群间 Nm 平均更低,只有 0郾 177,而泾县的
Nm 则高达 1郾 007,从而造成了潜山亚种群的异质性
变动程度是泾县亚种群的 3郾 8 倍,遗传距离的变动
程度是泾县亚种群的 7郾 1 倍;潜山的 Gst(0郾 586)远
超过重度分化的起点 0郾 25,甚至接近啮齿动物典型
的 Gst(0郾 676) [22] .泾县的 Gst(0郾 199)仅略超中度分
化的起点 0郾 15.泾县的较激烈的基因渗透和交流有
效地阻止了亚种群内的遗传变异, 防止了亚种群的
分化,使得该亚种群具有较强的趋同趋势,以致形成
一个近乎同质的亚种群. 潜山家蚕白僵病病源的复
系性(polyphylogeny)和泾县病原的单系性(monoph鄄
ylogeny)由此得到解释.
白僵菌是全球分布的最常见的昆虫病原真菌,
其有性型球孢虫草 ( Cordyceps bassiana) 极其罕
见[23];尽管在自然界里异核体发生的频率有时也能
达到 17%左右[24],但除在少数人为杂交的场合[25],
迄今尚未发现在自然界能通过准性生殖而形成二倍
体[26],这表明白僵菌通常多以无性生殖为主,而准
性重组的频率毕竟不如有性重组高,因此造成杂合
子缺乏的可能性较大;而且,白僵菌的分生孢子体积
小,易随空气传播而加速基因的渗透和交流,致使种
群内的遗传变异不易维持.在这种情况下,地理阻隔
以及生态环境(包括寄主)的不同将种群分割成遗
传结构不同的亚种群及更小的群体是维持其遗传多
样性和种群异质性的有效途径. 这在潜山槎水和泾
县章渡的地理环境对比中得到充分的反映. 潜山槎
水是一个典型的中山地区,地形复杂,山高坡陡,森
林茂密,植被丰富;而泾县章渡则是青弋江畔的低山
丘陵地区,地形较为简单,农耕为主,森林植被远不
如潜山槎水丰富.这种背景造成了本研究通过 ISSR
分析所得出的结果,即:潜山槎水白僵菌种群,尤其
是家蚕白僵病病源亚种群的基因流弱、遗传分化大,
变异主要由各亚种群间的变异以及蚕病亚种群的各
小群体间的变异造成,而泾县章渡的种群和亚种群
基因流强、遗传分化小,变异主要由亚种群内的变异
以及蚕病亚种群的各小群体内的变异造成.
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作者简介摇 李佳丽,女,1984 年生,硕士.主要从事昆虫真菌
学研究. E鄄mail: lijiali07@ 126. com
责任编辑摇 肖摇 红
742312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李佳丽等: 皖南与皖西南蚕区球孢白僵菌种群遗传结构的 ISSR分析摇 摇 摇 摇 摇 摇