全 文 ：马尾松纯林中球孢白僵菌种群的遗传异质性*
陈名君摇 黄摇 勃摇 刘玉军摇 李增智**
(安徽农业大学微生物防治安徽省重点实验室, 合肥 230036)
摘摇 要摇 应用 ISSR分子标记对安徽省麻姑山马尾松人工纯林的 111 株球孢白僵菌进行遗传
异质性分析,7 个引物共得到 58 个位点,其中多态位点比率为 93郾 10% .不同调查时间亚种群
的 Nei基因多样性(He)为 0郾 2552,Shannon信息指数(I)为 0郾 3825,亚种群间的基因分化系数
(Gst)为 0郾 2269,基因流(Nm)为 0郾 8518,其中 5 月和 7 月间的遗传距离最小,为 0郾 0408;不同
寄主亚种群的 He 为 0郾 2623、I为 0郾 3884,亚种群间的 Gst为 0郾 1964、Nm 为 1郾 0223,其中鞘翅目
和鳞翅目间亚种群的遗传距离最小,为 0郾 0163.表明麻姑山球孢白僵菌存在较高的遗传异质
性,亚种群间的遗传变异较小,亚种群内表现出相对较大的遗传变异,未见 ISSR 图谱相同或
高度相似的菌株.
关键词摇 虫生真菌摇 分子标记摇 基因流摇 遗传分化摇 遗传多样性
文章编号摇 1001-9332(2010)10-2627-08摇 中图分类号摇 Q938郾 1摇 文献标识码摇 A
Genetic heterogeneity of Beauveria bassiana population in pure Masson爷 s pine plantation.
CHEN Ming鄄jun, HUANG Bo, LIU Yu鄄jun, LI Zeng鄄zhi (Anhui Province Key Laboratory of Micro鄄
bial Control, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2010,21
(10): 2627-2634.
Abstract: By the method of ISSR, the genetic heterogeneity of 111 Beauveria bassiana isolates in a
pure Masson爷s pine plantation in Magu Mountains of Anhui Province was analyzed. A total of 58
loci were obtained with 7 ISSR primers, 54 of which (93郾 10% ) were polymorphic. For the isolates
sampled at different time, their Nei爷s gene diversity (He) was 0郾 2552, Shannon爷s diversity index
( I) was 0郾 3825, coefficient of gene differentiation (Gst ) was 0郾 2269, and gene flow Nm was
0郾 8518. The genetic distance between the isolates sampled in May and July was the shortest
(0郾 0408). For the isolates grouped based on host orders, their He was 0郾 2623, I was 0郾 3884, Gst
was 0郾 1964, and Nm was 1郾 0223. The genetic distance between the isolates from Coleopteran and
Hymenoteran was the shortest (0郾 0163). All the results suggested that the genetic heterogeneity of
B. bassiana population in the test plantation was rich, and the genetic variation between B. bassi鄄
ana sub鄄populations was relatively low but that within the sub鄄populations was high, and none of the
isolates were identical or highly similar with each other.
Key words: entomopathogenic fungi; molecular marker; gene flow; genetic differentiation; genetic
diversity.
*国家自然科学基金项目(30972368)、安徽省优秀青年科技基金项
目(08040106902)、安徽省级自然科学研究重点项目(TD200708)和
安徽农业大学校青年科学基金项目资助.
**通讯作者. E鄄mail: zzli@ ahau. edu. cn
2010鄄03鄄19 收稿,2010鄄07鄄26 接受.
摇 摇 森林是陆地生态的主体. 本着有害生物综合治
理的原则,以生物防治为主的森林有害生物持续控
制措施,是保持森林健康、实现林业可持续发展的重
要任务. 40 年来,我国大力推广使用虫生真菌球孢
白僵菌(Beauveria bassiana)(以下简称白僵菌)防治
重要森林害虫马尾松毛虫(Dendrolimus punctatus),
取得了举世瞩目的成就.
虫生真菌是森林生态系统的重要组分.林相复
杂的天然阔叶林中虫生真菌群落多样性极其丰
富[1-3],结构也非常复杂[4] .在皖西大别山区的天然
阔叶林中,由 50 多种虫生真菌组成的群落的优势种
为粉棒束孢 ( Isaria farinosa ), 其相对多度约
26郾 96% ;其次是细脚棒束孢( Isaria Tenuipes)和下垂
虫草(Cordyceps nutans),而白僵菌只有 10郾 03% [3] .
在皖南宣城市麻姑山林相单纯的马尾松纯林中,虫
生真菌群落只包括 14 个物种,白僵菌的相对多度
(36郾 10% )仅次于环链棒束孢( Isaria cateniannula鄄
ta)而居第二[5];而在直线距离仅千米的宣城敬亭山
的马尾松纯林中,白僵菌在 4 种虫生真菌的 611 个
菌株中相对多度更是多达 54郾 20% .因此,白僵菌是
应 用 生 态 学 报摇 2010 年 10 月摇 第 21 卷摇 第 10 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Oct. 2010,21(10): 2627-2634
马尾松纯林中的重要优势虫生真菌,对于松林虫害
的自然控制起着重要作用.
白僵菌的自然种群中存在较大的异质性和较高
的遗传多样性[6-7],森林中的白僵菌多为异质种群.
由于不同菌株对寄主昆虫的毒力[8]和侵染力[9]都
存在较大差异,不同的种群结构可能对森林虫害的
持续控制起着不同作用[10] . 然而,过去的研究存在
着样本少、来源分散、种群过大、研究手段不够精确
等缺陷,且多数研究以来自全球不同国家的菌株作
为一个种群[11-12],因此局部小面积生态系统中球孢
白僵菌异质性的研究更具有现实意义.
简单序列重复区间扩增多态性(ISSR,由 Zietk鄄
iewicz等[13]创建)分子标记,由于其引物序列较长,
退火温度高,具有更高的重复性,且操作简单,已被
广泛用于检测真菌的种内遗传变异. 本研究应用该
技术,分析了分离自小范围内马尾松人工纯林中的
白僵菌,了解不同种群间遗传多样性、遗传分化以及
优势性和基因流,旨在更好地了解该菌对森林中虫
生真菌稳定性的影响以及对生态系统结构、功能和
效益的作用.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试菌种
2007 年 3 月至 2008 年 1 月在安徽省宣州市麻
姑山林场的一片约 1800 hm2、25 年生马尾松纯林随
机采集感染真菌虫尸,经分离、纯化,共有 111 株被
鉴定为白僵菌,现保存于安徽农业大学微生物防治
省重点实验室.菌株信息如表 1 所示.
表 1摇 麻姑山球孢白僵菌不同月份数量组成及主要寄主
Tab. 1摇 Main hosts and abundances of Beauveria bassiana in different months in Magu Mountain
采集时间
Sampling time
(year鄄month)
菌株号
Strain code
寄主
Host
2007鄄03 0703鄄01, 0703鄄05, 0703鄄14, 0703鄄25 象甲(鞘翅目)Curculionidae (Coleoptera)、天牛(鞘翅目)Cerambyci鄄
dae (Coleoptera)、花萤(鞘翅目)Cantharidae(Coleoptera)、蚂蚁(膜翅
目)Formicidae(Hymenoptera)
2007鄄05 0705鄄01, 0705鄄03, 0705鄄06, 0705鄄11, 0705鄄14,
0705鄄15, 0705鄄31, 0705鄄35, 0705鄄39, 0705鄄43,
0705鄄44, 0705鄄47, 0705鄄48, 0705鄄53, 0705鄄60,
0705鄄62, 0705鄄71, 0705鄄74
飘甲(鞘翅目)Coccinellidae(Coleoptera)、马尾松毛虫(鳞翅目)Den鄄
drolimus punctatus(Lepidoptera)、蚂蚁(膜翅目)Formicidae(Hymenop鄄
tera)、潜蝇(双翅目)Agromyzidae(Diptera)、叶蝉(同翅目)Cicadelli鄄
dae(Homoptera)、姬蜂(膜翅目)Ichneunmonidae(Hymenoptera)、角蝉
(同翅目)Membracidae(Homoptera)、小蠹虫(鞘翅目) Ipidae(Coleop鄄
tera)、盾蝽(半翅目) Scutelleridae(Hemiptera)、双翅目成虫 Adult of
Diptera、鞘翅目成虫 Adult of Coleoptera
2007鄄06 0706鄄05, 0706鄄13, 0706鄄19, 0706鄄28, 0706鄄29,
0706鄄30, 0706鄄32, 0706鄄39, 0706鄄41, 0706鄄43,
0706鄄46, 0706鄄54, 0706鄄65, 0706鄄67, 0706鄄74,
0706鄄85, 0706鄄90, 0706鄄103
马尾松毛虫(鳞翅目) Dendrolimus punctatus( Lepidoptera)、蚂蚁(膜
翅目)Formicidae(Hymenoptera)、鳞翅目蛹 Pupa of Lepidoptera、姬蜂
(膜翅目) Ichneumonidae ( Hymenoptera)、马尾松角胫象 (鞘翅目)
Shirahoshizo patruelis(Coleoptera)、缘蝽(半翅目)Coreus sp郾 (Hemip鄄
tera)、瓢甲(鞘翅目)Coccinellidae(Coleoptera)、叶甲(鞘翅目)Chry鄄
somelidae(Coleoptera)、象甲(鞘翅目) Curculionidae( Coleoptera)、双
翅目成虫 Adult of Diptera、叩头甲(鞘翅目)Elateridae(Coleoptera)
2007鄄07 0707鄄08, 0707鄄09, 0707鄄11, 0707鄄21, 0707鄄22,
0707鄄23, 0707鄄28, 0707鄄29, 0707鄄37, 0707鄄40,
0707鄄42, 0707鄄46, 0707鄄50, 0707鄄63, 0707鄄64,
0707鄄69, 0707鄄70, 0707鄄73, 0707鄄79, 0707鄄83,
0707鄄84, 0707鄄85, 0707鄄88, 0707鄄91, 0707鄄93,
0707鄄98, 0707鄄99
瓢甲(鞘翅目) Coccinellidae(Coleoptera)、蚂蚁(膜翅目) Formicidae
(Hymenoptera)、马尾松角胫象(鞘翅目) Shirahoshizo patruelis(Cole鄄
optera)、叶甲(鞘翅目) Chrysomelidae( Coleoptera)、龟蝽(半翅目)
Plataspidae(Hemiptera)、鳃金龟(鞘翅目)Melolonthidae(Coleoptera)、
小蠹虫(鞘翅目) Ipidae(Coleoptera)、松茸毒蛾(鳞翅目)Hypomeces
squamosus(Lepidoptera)、双翅目蛹 Pupa of Diptera、象甲(鞘翅目)
Curculionidae(Coleoptera)、缘蝽(半翅目)Coreus sp郾 (Hemiptera)、马
尾松毛虫(鳞翅目)Dendrolimus punctatus(Lepidoptera)
2007鄄08 0708鄄09, 0708鄄15, 0708鄄23, 0708鄄25, 0708鄄27,
0708鄄30, 0708鄄32, 0708鄄35, 0708鄄37, 0708鄄46,
0708鄄47, 0708鄄51, 0708鄄56, 0708鄄58, 0708鄄61,
0708鄄65, 0708鄄66, 0708鄄68, 0708鄄71, 0708鄄72,
0708鄄75, 0708鄄76
小蠹虫 (鞘 翅 目 ) Ipidae ( Coleoptera )、 鳞 翅 目 幼 虫 Larva of
Lepidoptera、缘蝽(半翅目)Coreus sp郾 (Hemiptera)、鳞翅目蛹 Pupa of
Lepidoptera、象甲(鞘翅目)Curculionidae(Coleoptera)、龟蝽(半翅目)
Plataspidae(Hemiptera)、天蛾(鳞翅目) Sphingidae( Lepidoptera)、蚂
蚁(膜翅目)Formicidae(Hymenoptera)
2007鄄09 0709鄄01, 0709鄄11, 0709鄄17, 0709鄄40, 0709鄄45,
0709鄄50, 0709鄄75, 0709鄄79, 0709鄄82
马尾松毛虫(鳞翅目)Dendrolimus punctatus(Lepidoptera)、鳞翅目蛹
Pupa of Lepidoptera、鳃金龟(鞘翅目) Melolonthidae( Coleoptera)、枯
叶蛾(鳞翅目)Lasiocampidae(Lepidoptera)、蚂蚁(膜翅目)Formicidae
(Hymenoptera)、象甲(鞘翅目)Curculionidae (Coleoptera)
2007鄄11 0711鄄02, 0711鄄03, 0711鄄05, 0711鄄07, 0711鄄19,
0711鄄20, 0711鄄31
马尾松角胫象(鞘翅目) Shirahoshizo patruelis(Coleoptera)、姬蜂(膜
翅目) Ichneumonidae ( Hymenoptera)、象甲 (鞘翅目) Curculionidae
(Coleoptera)、蚂蚁(膜翅目)Formicidae(Hymenoptera)、小蠹虫(鞘翅
目)Ipidae (Coleoptera)
2008鄄01 0801鄄01, 0801鄄03, 0801鄄05, 0801鄄06, 0801鄄07,
0801鄄09
螽斯(直翅目)Tettigoniidae(Orthoptera)、马尾松毛虫(鳞翅目)Den鄄
drolimus punctatus(Lepidoptera)、松茸毒蛾(鳞翅目)Hypomeces squa鄄
mosus(Lepidoptera)、树蟋(直翅目)Oecanthidae(Orthoptera)、马尾松
角胫象(鞘翅目)Shirahoshizo patruelis(Coleoptera)
8262 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
1郾 2摇 菌丝制备
将供试菌株接种到加铺玻璃纸的 SDAY培养基
上.置于光照培养箱中(25依1) 益培养 6 d 左右. 待
大量产生菌丝后,从玻璃纸上剥离菌体,冻干菌丝备
用.
1郾 3摇 DNA提取与 ISSR引物筛选
参照朱衡等[14]方法提取菌体总 DNA,用 0郾 8%
的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量.参考李旻等[7]和
余艳等[15],选出合适的引物序列(表 2).
1郾 4摇 ISSR扩增
ISSR鄄PCR 扩增反应在 Flexigene PCR 仪上进
行.反应体系(15 滋l)如下:1郾 5 滋l 10 伊PCR Buffer
(缓冲液),0郾 25 滋l dNTPs,0郾 6 滋l 引物,0郾 5 U Taq
DNA polymerase和 20 ng模板 DNA. PCR扩增程序:
94 益 预变性 2 min,接着进行 35 个循环:94 益 变性
45 s,48 益 ~54 益 复性 45 s,72 益 延伸 1郾 5 min.循
环结束后 72 益延伸 10 min. PCR产物在 2郾 5%琼脂
糖凝胶上电泳分离,EB 染色后于 GIS鄄2008 凝胶成
像系统检测拍照.用 AlphaEase FC软件分析.
1郾 5摇 数据分析
将电泳图谱利用 BandScan 5郾 0 软件进行电泳
条带迁移率分析,把同一迁移率的条带视为公共带,
其余为特异带,表示有多态性. 分别记为“1冶 (代表
显性基因)和“0冶(代表隐性基因),把迁移率数据转
化成 0、1 矩阵.按不同月份和不同寄主进行分类分
析白僵菌种群的相关参数.
1郾 5郾 1 多态位点百分率摇 多态位点百分率(PPL)为
所有检测到的位点中多态位点所占的比率. 计算公
式为:
PPL= 多态位点数检测到的位点总数伊100%
利用此公式分别计算不同月份和不同寄主的多
态位点百分率,并进行比较分析.
1郾 5郾 2 Shannon 信息多样性指数( I) 摇 Shannon 信息
多样性指数源于信息理论,指数越高,群落所含的信
息量越大,此外还反映物种的均匀度.其算式为:
I = - 移P i log2P i
式中:P i 为某一扩增带出现的频率.
1郾 5郾 3 平均杂合度(H) 摇 平均杂合度指各亚种群在
某微卫星位点平均杂合子的比例. 假设一个标记位
点上 n个等位基因的频率分别为 P1、P2…Pn,则
j =移
m
i = 1
pi2
He = 1 - 移
m
i = 1
pi2
J = IL移
m
i = 1
ji
H = 1 - J = 1 - IL移
m
i = 1
ji
式中:j为位点纯合度; He 为位点杂合度; J 为平均
位点纯合度;H 为平均位点杂合度; L 为位点数;m
为某位点的等位基因数;P i 为某位点第 i 个等位基
因的频率.
1郾 5郾 4 实际观察等位基因数和有效等位基因数(Ne)
摇 实际观察等位基因数为种群在该位点所实际测到
的等位基因数目,有效等位基因数(Ne)是位点纯合
度的倒数,反映了基因间的相互影响,也可作为遗传
变异的一个测度.
Ne = 1 / j = 1 /移
m
i = 1
pi2 = 1(1 - He)
1郾 5郾 5 遗传分化系数( coefficient of gene differentia鄄
tion, Gst)和基因流(Nm)
Gst =(HT-Hs) / HT
Nm =1 / 4 (1 / Gst- 1)
表 2摇 ISSR引物序号和序列
Tab. 2摇 List of ISSR primers and their sequences
引物编号
Primer code
序列(5爷鄄3爷)
Sequence
(5爷鄄3爷)
复性温度
Annealing
temperature (益)
扩增位点数
Number of
amplified bands
多态位点数
Number of
polymorphic bands
多态位点百分率(PPL)
Percentage of
polymorphic
loci (% )
Nei基因多样性
指数(He)
Nei爷s gene
diversity index
P04 (TG)8GT 54 5 4 80郾 00 0郾 2893
P05 (GTC)6 54 11 9 81郾 82 0郾 2435
P06 (GTG)6 54 8 7 87郾 50 0郾 4206
P08 (AAG)6 48 6 6 100 0郾 2559
P09 (AG)8S 54 12 11 91郾 67 0郾 3539
P11 (AG)8YT 52 9 8 88郾 89 0郾 2638
P15 (AC)8YC 52 7 6 85郾 71 0郾 3301
平均 Average 8郾 2857 7郾 2857 87郾 94 0郾 3081
Y=(C, T); S=(C,G)郾
926210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈名君等: 马尾松纯林中球孢白僵菌种群的遗传异质性摇 摇 摇 摇 摇 摇
式中:HT 为种群总杂合度;Hs 为亚种群杂合度,即
各亚种群平均杂合度. Gst越高,Hs / HT 值就越小,表
明亚种群遗传分化对种群总遗传分化贡献越小.
2摇 结果与分析
2郾 1摇 ISSR扩增引物的筛选
对所合成的 ISSR引物进行筛选,选择了扩增结
果较稳定、多态性较好的 7 个引物进行分析. ISSR鄄
PCR所确定的 7 个引物总位点数 58 条,总的多态位
点数 54 条,总的多态位点比率为 93郾 10% ,每个引
物扩增的 DNA带的数量在 5 ~ 12 条,平均多态位点
7郾 3 条.图 1 为引物 P11 对部分(35 株)白僵菌菌株
扩增的电泳条带.
2郾 2摇 白僵菌遗传多态位点分析
2郾 2郾 1 不同调查时间多态位点分析 摇 从表 3 可知,
不同月份种群的多态位点比率在 70郾 27% ~
98郾 21% ,其各月的多态位点比率按大小排列: 2007
年 6 月>2007 年 9 月>2007 年 5 月>2007 年 7 月>
2007 年 8 月>2007 年 11 月>2008 年 1 月>2007 年 3
月.
2郾 2郾 2 不同寄主白僵菌的多态位点分析摇 从表 4 可
以看出,不同寄主昆虫的白僵菌亚种群多态位点
比率都较大.其中分离自鞘翅目昆虫的亚种群最高
表 3摇 不同月份采集和分离的菌株的多态位点统计
Tab. 3 摇 Polymorphic sites of isolates collected in different
months
采集时间
Sampling
time
(year鄄month)
菌株数
Number of
strains
扩增带数
Number of
amplified
bands
多态性条带
Number of
polymorphic
bands
多态位点
比率
Percentage of
polymorphic
loci (% )
2007鄄03 4 37 26 70郾 27
2007鄄05 18 47 45 95郾 74
2007鄄06 18 56 55 98郾 21
2007鄄07 27 50 46 92郾 00
2007鄄08 22 48 44 91郾 67
2007鄄09 9 51 46 98郾 11
2007鄄11 7 38 28 90郾 19
2008鄄01 6 38 34 89郾 47
总体 Total 111 58 54 93郾 10
(93郾 10% ),可能是由于该目昆虫中白僵菌寄主的
种类和数量丰富所致. 寄生直翅目和同翅目昆虫的
白僵菌都只有 2 株,其扩增条带较少.按不同寄主昆
虫分成不同的亚种群,菌株数较多的多态位点比率
也较 大, 其 中, 鞘 翅 目 ( 93郾 10% ) > 鳞 翅 目
(88郾 46% )>半翅目(88郾 00% ) >双翅目(81郾 58% ) >
膜翅目(79郾 17% )>直翅目、同翅目.
2郾 3摇 白僵菌种群的遗传异质性
2郾 3郾 1 不同月份白僵菌的遗传异质性摇 为分析白僵
菌种群内的遗传异质性,采用 Popgen32 软件中的
Shannon指数和 Nei 指数分别估算种群的遗传分化
和遗传变异. 从显示不同月份遗传变异数据的表 5
可以看出,2007 年 6 月等位基因数(Na)最高,这一
结果与 2007 年 6 月的多态位点比率的结论一致.而
有效等位基因数(Ne)、Shannon 指数( I)和 Nei 基因
多样性指数(He)最高的月份出现在 2007 年 9 月,
这说明 2007 年 9 月白僵菌的遗传异质性比其他各
月份高.这与种群的多态位点比率 10 月最高的结果
略有差异.
摇 摇 按不同月份划分亚种群,亚种群内的基因多样
性远大于亚种群间的基因多样性(表 6),表明遗传
变异主要存在于亚种群内.亚种群间的基因分化系
表 4摇 来自不同寄主的菌株的多态位点统计
Tab. 4摇 Polymorphic sites of isolates collected from differ鄄
ent insect hosts
寄主
Host
菌株数
Number of
strains
扩增带数
Number of
amplified
bands
多态性
位点带
Number of
polymorphic
bands
多态位点
比率
Percentage
of polymorphic
loci (% )
鞘翅目 Coleoptera 43 58 54 93郾 10
鳞翅目 Lepidoptera 24 52 46 88郾 46
半翅目 Hemiptera 21 50 44 88郾 00
膜翅目 Hymenoptera 13 48 38 79郾 17
双翅目 Diptera 5 38 31 81郾 58
直翅目 Orthoptera 2 33 - -
同翅目 Homoptera 2 33 - -
总体 Total 110 58 54 93郾 10
-: 无数值 No value.
图 1摇 引物 P11 对部分白僵菌扩增的电泳图
Fig. 1摇 ISSR bands of Beauveria bassiana amplified with primer P11.
0362 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
表 5摇 麻姑山不同月份白僵菌的遗传变异
Tab. 5 摇 Genetic variation of Beauveria bassiana isolates
from different sampling months in Magu Mountain
采集时间
Sampling time
(year鄄month)
Na Ne He I
2007鄄03 1郾 4483 1郾 3241 0郾 1853 0郾 2701
2007鄄05 1郾 8103 1郾 4117 0郾 2486 0郾 3815
2007鄄06 1郾 9828 1郾 5252 0郾 3097 0郾 4710
2007鄄07 1郾 8621 1郾 4230 0郾 2577 0郾 3973
2007鄄08 1郾 8103 1郾 4619 0郾 2716 0郾 4089
2007鄄09 1郾 8448 1郾 5615 0郾 3210 0郾 4738
2007鄄11 1郾 5000 1郾 3112 0郾 1830 0郾 2733
2008鄄01 1郾 6379 1郾 4668 0郾 2644 0郾 3843
总体 Total 2郾 0000 1郾 5399 0郾 2552 0郾 3825
Na:等位基因数 Allele number;; Ne: 有效等位基因数 Effective allele
number; He: Nei基因多样性指数 Nei爷s gene diversity; I: Shannon多
样性指数 Shannon爷s diversity index. 下同 The same below.
表 6摇 不同月份白僵菌的遗传分化
Tab. 6 摇 Genetic differentiation among Beauveria bassiana
isolates from different sampling months
总基因
多样性
Ht
亚种群内
基因多样性
Hs
基因分化
系数
Gst
基因流
Nm
均值 Mean 0郾 3300 0郾 2552 0郾 2269 0郾 8518
标准差 SD 0郾 0205 0郾 0125
Ht: Total gene diversity;Hs: Gene diversity within subpopulation;Gst:
The coefficient of gene differentiation;Nm: The number of migrants per
generation. 下同 The same below.
数(Gst)达 0郾 2269,说明在整个种群有 77郾 31%的遗
传变异存在于亚种群内,而仅有 22郾 69%的遗传变
异存在于亚种群间,按照 Wright[16]的标准, 亚种群
内发生了高度的遗传分化(0郾 25>Gst>0郾 15);这种分
化是由于亚种群内基因流较弱(Nm = 0郾 8518<1),遗
传交换较少造成的(表 5). 表明白僵菌种群的遗传
异质性随月份而发生的变化主要是由某一月份内存
在的遗传异质性形成,由月份转换而垂直发生的遗
传飘变则很少.
2郾 3郾 2 不同月份白僵菌的遗传一致度和聚类分析 表
7 表明,不同月份亚种群间的遗传一致度在 0郾 8222
~0郾 9600,相对较小.按月份划分的 8 个亚种群遗传
距离在 0郾 0408 ~ 0郾 1958,2007 年 5、7、8 月 3 个亚种
群间的遗传距离较小,遗传关系很近.遗传距离最小
的是 2007 年 5 月和 2007 年 7 月,为 0郾 0408;遗传距
离最大的月份出现在 2007 年 3 月和 2008 年 1 月,
为 0郾 1958.
摇 摇 根据不同月份亚种群的遗传距离用 UPGMA法
基于 Nei指数进行无加权计算,获得白僵菌各月份
的系统进化树(图 2).从图中可以看出,按月份分成
的 8 个亚种群被划分为 3 组,其中 2007 年 3 月和 11
月亚种群聚在一起,2007 年 5、6、7、8 月聚为一类,
2007 年 9 月和 2008 年 1 月聚成一类.从该树状图可
以看出,各个亚种群的遗传关系与不同月份的温度
相关性明显,即温差不大的月份所采集的菌株遗传
距离不大,聚为一类.
2郾 4摇 白僵菌种群的寄主异质性
2郾 4郾 1 不同寄主白僵菌的遗传变异摇 将菌株按不同
寄主来源分成 7 个亚种群,分析白僵菌种群的遗传
变异.应用 Popgen32 软件中 Shannon 指数和 Nei 指
数分别估算种群的遗传分化和遗传变异. Nei 基因
多样性指数 (He )为 0郾 2623, Shannon 指数 ( I)为
0郾 3884.从各个亚种群来看,寄主为鳞翅目昆虫的白
僵菌的 He 值(0郾 3423)最高,I 值为 0郾 5147,而寄主
为同翅目和双翅目的白僵菌 He 值(0郾 1897)最低,I
值为 0郾 2629. 从表 8 可以看出,不同寄主的基因多
样性指数和 Shannon指数差异较大,以鳞翅目最大,
采集菌株数越少的亚种群的基因多样性指数和
Shannon指数也越小. 这一结论与种群的多态位点
比率结论基本一致.
2郾 4郾 2 不同寄主白僵菌的遗传分化 摇 据表9可知,
表 7摇 不同月份白僵菌的遗传一致度和遗传距离
Tab. 7摇 Genetic identity and genetic distance of Beauveria bassiana isolated in different months
2007鄄03 2007鄄05 2007鄄06 2007鄄07 2007鄄08 2007鄄09 2007鄄11 2008鄄01
2007鄄03 0郾 8962 0郾 8405 0郾 8750 0郾 8658 0郾 8577 0郾 9027 0郾 8222
2007鄄05 0郾 1096 0郾 9215 0郾 9600 0郾 9263 0郾 9035 0郾 8907 0郾 8456
2007鄄06 0郾 1738 0郾 0817 0郾 9183 0郾 9174 0郾 9184 0郾 8546 0郾 9073
2007鄄07 0郾 1336 0郾 0408 0郾 0852 0郾 9366 0郾 8980 0郾 8665 0郾 8348
2007鄄08 0郾 1441 0郾 0765 0郾 0862 0郾 0655 0郾 8897 0郾 8440 0郾 8354
2007鄄09 0郾 1535 0郾 1014 0郾 0851 0郾 1076 0郾 1168 0郾 8840 0郾 9252
2007鄄11 0郾 1024 0郾 1158 0郾 1572 0郾 1433 0郾 1695 0郾 1233 0郾 8875
2008鄄01 0郾 1958 0郾 1677 0郾 0973 0郾 1806 0郾 1798 0郾 0777 0郾 1194
对角线上方数字为遗传一致度,对角线下方数字为遗传距离 Nei爷s genetic identity was above diagonal and genetic distance was below diagonal. 下同
The same below.
136210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈名君等: 马尾松纯林中球孢白僵菌种群的遗传异质性摇 摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 白僵菌不同采集月份种群树状聚类图(UPGMA)
Fig. 2 摇 Dendrogram clustering analysis of Beauveria bassiana
strains isolated in different months by UPGMA
表 8摇 麻姑山不同寄主的白僵菌的遗传变异
Tab. 8 摇 Genetic variation of Beauveria bassiana isolates
from different insect hosts at Magu Mountain
寄主 host Na Ne He I
鞘翅目 Coleoptera 1郾 9655 1郾 5331 0郾 3166 0郾 4786
鳞翅目 Lepidoptera 1郾 9828 1郾 5754 0郾 3423 0郾 5147
半翅目 Hemiptera 1郾 8276 1郾 4754 0郾 2822 0郾 4256
膜翅目 Hymenoptera 1郾 8793 1郾 4786 0郾 2865 0郾 4360
双翅目 Diptera 1郾 5862 1郾 3929 0郾 2290 0郾 3380
同翅目 Homoptera 1郾 3793 1郾 3793 0郾 1897 0郾 2629
直翅目 Orthoptera 1郾 3793 1郾 3793 0郾 1897 0郾 2629
总体 Total 2郾 0000 1郾 5399 0郾 2623 0郾 3884
表 9摇 不同寄主白僵菌的遗传分化分析
Tab. 9摇 Analysis of genetic differentiation among Beauveria
bassiana isolates from different hosts
总基因多
样性
Ht
亚种群内
基因多样性
Hs
基因分化
系数
Gst
基因流
Nm
均值 Mean 0郾 3264 0郾 2623 0郾 1964 1郾 0223
标准差 SD 0郾 0191 0郾 0133
按不同寄主昆虫划分成 7 个亚种群,亚种群内的基
因异质性远大于亚种群间的基因异质性. 亚种群间
的基因分化系数(Gst)达0郾 1965,说明有80郾 35%的
遗传变异存在于亚种群内,而仅有 19郾 65%的遗传
变异存在于亚种群间;不同寄主亚种群间有一定的
遗传分化,亚种群间的基因流为 1郾 0223,仅略大于
1,说明遗传交换比较有限,因遗传飘变而引起的遗
传分化稍有减少;高的寄主分类单元(目)的差别对
白僵菌种群的遗传分化影响极小,寄主专化性主要
体现在目以下的分类单元上.
2郾 4郾 3 不同寄主白僵菌的遗传一致度和聚类分析摇
按不同寄主划分的 7 个亚种群,其遗传一致度变化
较大,遗传一致度最大的是鞘翅目亚种群和鳞翅目
亚种群(0郾 9839),其对应遗传距离最小(0郾 0163);
遗传一致度最小的是直翅目亚种群和同翅目亚种群
(0郾 7128),其对应的遗传距离最大 (0郾 3386) (表
10).其中鞘翅目、鳞翅目、半翅目、膜翅目和双翅目
亚种群白僵菌的遗传距离很小,遗传关系接近.
根据不同寄主昆虫的遗传距离用 UPGMA 法基
于 Nei指数进行无加权计算,获得白僵菌不同寄主
的系统进化树(图 3),可将 7 个亚种群划分为 3 组,
其中鞘翅目、鳞翅目、半翅目、膜翅目和双翅目 5 个
亚种群聚在一起,而同翅目和直翅目亚种群各自聚
为一类.
图 3摇 白僵菌不同寄主种群树状聚类图(UPGMA)
Fig. 3 摇 Dendrogram clustering analysis of Beauveria bassiana
isolates from different insect hosts by UPGMA.
表 10摇 按不同寄主划分的白僵菌遗传一致度和遗传距离
Tab. 10摇 Genetic identity and genetic distance of Beauveria bassiana isolates from different hosts
鞘翅目
Coleoptera
鳞翅目
Lepidoptera
半翅目
Hemiptera
膜翅目
Hymenoptera
双翅目
Diptera
同翅目
Homoptera
直翅目
Orthoptera
鞘翅目 Coleoptera 0郾 9839 0郾 9766 0郾 9763 0郾 9698 0郾 9057 0郾 8427
鳞翅目 Lepidoptera 0郾 0163 0郾 9676 0郾 9617 0郾 9507 0郾 8778 0郾 8591
半翅目 Hemiptera 0郾 0237 0郾 0329 0郾 9493 0郾 9629 0郾 8986 0郾 7856
膜翅目 Hymenoptera 0郾 0240 0郾 0390 0郾 0521 0郾 9616 0郾 8860 0郾 8267
双翅目 Diptera 0郾 0307 0郾 0505 0郾 0378 0郾 0391 0郾 9074 0郾 7983
同翅目 Homoptera 0郾 0990 0郾 1304 0郾 1069 0郾 1210 0郾 0972 0郾 7128
直翅目 Orthoptera 0郾 1711 0郾 1519 0郾 2414 0郾 1903 0郾 2252 0郾 3386
2362 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷
图 4摇 麻姑山球孢白僵菌种群树状聚类图(UPGMA)
Fig. 4摇 Dendrogam clustering of Beauveria bassiana strains from
Magu mountain by UPGMA analysis.
2郾 5摇 白僵菌种群的遗传异质性
根据白僵菌个体间的遗传距离进行 UPGMA 聚
类分析,结果(图 4)显示:所研究的 111 株白僵菌菌
株分布比较散乱,并没有聚集成明显的几个组分,而
且没有发现完全同质的个体或明显的优势菌株. 这
说明所研究的白僵菌种群遗传结构复杂,存在高度
的遗传异质性.
3摇 讨摇 摇 论
本文利用 ISSR 分子标记方法研究了人工马尾
松纯林白僵菌种群的遗传异质性.结果表明,虽然该
松林植被单调、人为干预频繁,但白僵菌种群存在着
丰富的菌株类型,呈现出较高的遗传异质性和较低
的优势性;引起松林中昆虫白僵病的是一个高度异
质性而优势性不明显的种群. 这种丰富的种群遗传
异质性有利于种群结构甚至群落结构的稳定. 但与
琅琊山的次生阔叶林[17]和大别山的天然阔叶林[7]
相比,该林区白僵菌菌株间的遗传距离普遍较小.按
不同寄主和不同采集时间分成不同的亚种群,其多
态位点比率(PPL)均为 93郾 10% ,不同寄主亚种群
的 Nei 基因多样性指数(He)值为 0郾 2623,Shannon
指数( I)值为 0郾 3884;不同采集时间亚种群的 He 值
为 0郾 2552,I值为 0郾 3825. 这说明海拔较低、林农交
界、人为干扰多的丘陵岗地上的人工马尾松纯林白
僵菌种群多样性单调[2],白僵菌的遗传异质性不仅
低于大别山的天然阔叶林(He = 0郾 3187) [9],也低于
琅琊山的天然次生阔叶林(He = 0郾 2781) (另文发
表).这可能与马尾松纯林林相简单、寄主(以松茸
毒蛾主)昆虫单一等有关.
本文按不同寄主和不同调查时间研究麻姑山林
场白僵菌的遗传分化指数,发现不同时间的该指数
(0郾 2269)>不同寄主的该指数(0郾 1965),即不同月
份亚种群间遗传分化大于不同寄主亚种群间的遗传
分化.这说明在麻姑山林场,由换季而垂直发生的遗
传飘变和基因交换很少.但不同寄主亚种群间,特别
是目以下的寄主亚种群间却存在着一定的基因交换
(Nm = 1郾 0223),从而在一定程度上影响了遗传分
化.这可能是由于自然界中白僵菌存在广泛的寄主
转移现象,加强了不同寄主白僵菌基因交换.丁德贵
等[10]在马尾松纯林生态系中发现的寄主转移现象,
有助于人工施放的白僵菌菌株在林间目标寄主缺乏
时,利用其他寄主将食物链维持下去,也促进了不同
寄主白僵菌基因的交换.
赵学球等[16]利用 28S rDNA鄄I 型内含子检测了
2004 年 6 月在马尾松纯林中释放白僵菌菌株后由
释放菌株与土著菌株组成的白僵菌种群的遗传多样
性,一周年间回收检测的 87 株球孢白僵菌中有 66
株与释放菌株的核型相同,占 75. 86% ,释放菌株可
能会与土著菌株进行遗传交换,通过基因流影响当
336210 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈名君等: 马尾松纯林中球孢白僵菌种群的遗传异质性摇 摇 摇 摇 摇 摇
地白僵菌的遗传结构. 然而本研究在相同林分中未
发现与释放菌株的 ISSR 图谱相同或高度相似的菌
株,这反映释放菌株仍未能定殖,且未对白僵菌种群
的遗传结构造成重要影响,基因型复杂的白僵菌种
群的遗传分化依然很强. 基因流是进化的重要动力
(或压力)之一.进化的结果是加剧或削弱各群体间
的基因分化. 比较赵学球等[16]和本文的研究结果,
显示了这种进化的动态性.
参考文献
[1]摇 Hughes WO, Thomsen L, Eilenberg J, et al. Diversity
of entomopathogenic fungi near leaf鄄cutting ant nests in a
neotropical forest, with particular reference to Metarhiz鄄
ium anisopliae var. anisopliae. Journal of Invertebrate
Pathology, 2004, 85: 46-53
[2]摇 Wang S鄄B (王四宝), Huang Y鄄P (黄勇平), Fan M鄄Z
(樊美珍), et al. Species diversity of entomogenous
fungal flora of Dabie Mountains, Anhui. Biodiversity
Science (生物多样性), 2003, 11(6):475 -479 ( in
Chinese)
[3] 摇 Wang S鄄B (王四宝). Liu J鄄N (刘竞男), Wang C鄄S
(王成树), et al. Community diversity of entomogenous
fungi in Dabie Mountains in Anhui. Chinese Journal of
Applied Ecology (应用生态学报), 2004, 15(5): 883
-887 (in Chinese)
[4]摇 Wang S鄄B (王四宝), Liu J鄄N (刘竞男), Huang B
(黄摇 勃), et al. The community structure and ecologi鄄
cal distribution of entomogenous fungi in Dabie
Mountains. Mycosystema (菌物学报), 2004, 23(2):
195-203 (in Chinese)
[5]摇 Chen M鄄J (陈名君), Liu Y鄄J (刘玉军), Zhou N (周
娜), et al. The component of entomogenous fungi com鄄
munity and the niche of dominant species in pure forest
of Masson爷 s pines. Mycosystema (菌物学报), 2009,
28(4): 521-527 (in Chinese)
[6]摇 Devi KU, Reineke A, Reddy NNR, et al. Genetic di鄄
versity, reproductive biology, and speciation in the ento鄄
mopathogenic fungus Beauveria bassiana ( Balsamo )
Vuillemin. Genome, 2006, 49: 405-504
[7]摇 Li M (李摇 旻), Wang S鄄B (王四宝), Fan M鄄Z (樊
美珍), et al. Genetic diversity of Beauveria bassiana
(Bals. ) Vuill. in forest ecosystem assessed by inter鄄
simple sequence repeat (ISSR) markers. Hereditas (遗
传), 2006, 28(8): 977-983 (in Chinese)
[8]摇 Santoro PH, Neves PM, Alexandre TM, et al. Selection
of Beauveria bassiana isolates to control Alphitobius dia鄄
perinus. Journal of Invertebrate Pathology, 2008, 97:
83-90
[9]摇 James RR, Jaronski ST. Effect of low viability on infec鄄
tivity of Beauveria bassiana conidia toward the silverleaf
whitefly. Journal of Invertebrate Pathology, 2000, 76:
227-228
[10]摇 Ding D鄄G (丁德贵), Li Z鄄Z (李增智), Fan M鄄Z (樊
美珍), et al. Host transfer of Beauveria bassiana popu鄄
lation in pine stand ecosystem and impact of its genetic
diversity on sustainable control of Masson爷 s pine cater鄄
pillars. Chinese Journal of Applied Ecology (应用生态
学报), 2004,15(12): 2315-2320 (in Chinese)
[11]摇 Cruz LP, Gaitan AL, Gongora CE. Exploiting the genet鄄
ic diversity of Beauveria bassiana for improving the bio鄄
logical control of the coffee berry borer through the use of
strain mixtures. Applied Microbiology and Biotechnolo鄄
gy, 2006, 71: 918-926
[12]摇 Fernandes 佴KK, Moraes 佗ML, Pacheco RS, et al. Ge鄄
netic diversity among Brazilian isolates of Beauveria bas鄄
siana: Comparisons with non鄄Brazilian isolates and other
Beauveria species. Journal of Applied Microbiology,
2009, 107: 760-774
[13]摇 Zietkiewicz E, Rafalsk A, Labuda D. Genome finger
printing by simple sequence repeat (SSR)鄄anchored pol鄄
ymerase chain reaction amplification. Genome, 1994,
20: 176-183
[14]摇 Zhu H (朱摇 衡), Qu F (瞿 摇 峰), Zhu L鄄H (朱立
煌). Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and
bacteria using benzyl chloride. Mycosystema (菌物学
报), 1994, 13(1): 34-40 (in Chinese)
[15]摇 Yu Y (余摇 艳), Chen H鄄S (陈海山), Ge X鄄J (葛学
军). Optimization of experiment conditions and prime
screening with ISSR markers. Journal of Tropical and
Subtropical Botany (热带亚热带植物学报), 2003, 11
(1): 15-19 (in Chinese)
[16]摇 Zhao X鄄Q (赵学球), Cai S鄄P (蔡守平), Wang S鄄B
(王四宝), et al. Evidence of Survival and sustainable
control on pests of Beauveria bassiana after artificial re鄄
lease in Massion pine plantation. Mycosystema (菌物学
报), 2007, 26(1): 84-88 (in Chinese)
[17] 摇 Chen M鄄J (陈名君), Zhang Z (张 摇 中), Fan M鄄Z
(樊美珍), et al. Genetic diversity of Beauveria bassi鄄
ana from Langya Mountains based on variation of nuclear
large subunit rDNA group I intron. Mycosystema (菌物
学报), 2006, 25(4): 559-566 (in Chinese)
作者简介摇 陈名君,女,1980 年生,博士,讲师. 主要从事虫
生真菌分子系统学及分子生态学研究,发表论文 10 余篇.
E鄄mail: chenmingjun2005@ 126. com
责任编辑摇 肖摇 红
4362 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 21 卷