全 文 ：收稿日期：2009-01-16
基金项目：国家农业科技成果转化资金项目（2007GB2432038
5）；国家林业局重点项目（[2007]-74号）
作者简介：刘国彬（1984-），男，河南滑县人，硕士，研究方向：
生物技术与种植创新。
通讯作者：罗正荣
锥栗叶样保存时间对 DNA提取质量的影响
刘国彬 1，2，龚榜初 2，罗正荣 1
（1. 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070；
2. 中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 311400）
摘 要：以野生锥栗幼叶为对照，采用硅胶干燥法，设置不同保存时间（10 d，2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、16、17、18个月），对保
存不同时间的锥栗叶样抽提基因组总 DNA，利用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测提取 DNA的浓度、纯度、得率及质量等
指标，评价不同保存时间对基因组 DNA的影响。结果表明：随着保存时间的延长，基因组 DNA的浓度呈逐渐降低趋势，12个月
后，降解加剧，纯度很低。叶样硅胶保存时间在 10 d至 10个月之间为最佳 DNA抽提时间，所得 DNA浓度、得率高，纯度较好，电
泳谱带清晰。
关键词：锥栗；叶样；保存时间；DNA提取
中图分类号：S792.17 文献标识码：A 文章编号：1006-060X（2009）04-0008-03
Effects of Preserved Time on Total DNA Extraction of Castanea henryi
LIU Guo-Bin1，2，GONG Bang-Chu1，2，LUO Zheng-Rong2
(1.Key Laboratory for Horticultural Plant Biology, Ministry of Eduction, Huazhong Agricultural University, Wuhan
430070,PRC; 2.Resesrch Institute of Subtropical Forestry, CAF, Fuyang 311400,PRC)
Abstract: Compared with fresh samples, dried with silica gel, the genomic DNA was extracted from Castanea henryi
leaves, which preserved for 10 days, 2 months, 4 months, 6 months, 8 months, 10 months, 11 months, 12 months, 13
months, 14 months, 15 months, 16 months, 17 months, 18 months, by improved CTAB methods. The concentration,
purity, yield and molecular size were measured by ultraviolet spectrophotometer and agarose gel electrophoresis. The
results showed that the longer the preserved time, the lower the concentration of genomic DNA. After 12 months, the
degradation was serious and the purity was extremely low. It was suggested that 10 days to 10 months after stored by
silica gel was the best period to extract the genomic DNA, the concentration and purity was high, the bands was good.
Key words: Castanea henryi, leaves sample, preserved time, DNA extraction
获得足够且高质量的 DNA模板是进行分子标
记技术的前提条件，能否成功提取植物基因组
DNA及提取质量的好坏将直接影响到聚合酶链式
反应（PCR）的扩增效果。为保证样品中 DNA的结
构完整以及正常的生理活性，一般宜选取新鲜、幼
嫩的植物组织作为 DNA抽提材料。但在实际工作
中，远距离取样或受时间限制常导致无法及时对新
鲜材料进行取样，加上许多野生材料分布范围广，
采集困难，因此植物样品的保存成为至关重要的一
步。由于样品质量的好坏直接影响到 DNA提取的
效果，因此发展出不少方法以利于样品的保存，其
中硅胶干燥法以其简单、低成本、持久性强的优点
成为研究者远距离取样的首选[1- 4]。但目前对硅胶干
燥后，植物组织中 DNA的完整性能维持多长时间
尚缺少相关研究。笔者以野生锥栗叶片组织为研究
对象，采用改良 CTAB微量提取方法，探讨硅胶干
燥法保存时间长短对基因组 DNA提取质量的影
响，以确定适宜野生锥栗基因组总 DNA抽提的最
佳保存时期。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
DNA提取材料为野生锥栗成熟叶片，于 2007
年 4月中旬采自福建省龙栖山自然保护区。主要试
剂包括 CTAB提取缓冲液：0.1 mol/L Tris- HCl（pH
8.0），1.5 mol/L NaCl，50 mmol/L EDTA（乙二胺四乙
酸），1% PVP（聚乙烯吡咯烷酮），2% CTAB（溴代十
六烷基三甲胺），2% β- 巯基乙醇；氯仿∶异戊醇
（24∶1）混合液；异丙醇；5 mol/L醋酸钠。
1.2 保存方法
湖南农业科学 2009，（4）：8~10 Hunan Agricultural Sciences
DOI:10.16498/j.cnki.hnnykx.2009.04.041
第 4期
表 1 不同保存时间对野生锥栗 DNA产物的影响
保存时间
10 d
2个月
4个月
6个月
8个月
10个月
11个月
12个月
13个月
14个月
15个月
16个月
17个月
18个月
沉淀外观
无色透明
浅 白
无色透明
无色透明
浅 白
浅 白
白 色
白 色
黄 色
浅黄色
黄褐色
褐 色
深褐色
深褐色
浓度（ng/μl）
27.95
25.44
24.65
24.08
23.72
22.35
19.24
15.3
8.30
9.09
9.95
5.501
4.031
0.315
得率（μg/g）
698.75
636
616.25
602
593
558.75
481
382.5
207.5
227.25
248.75
137.53
100.78
7.88
OD值
1.841
1.861
1.715
1.673
1.798
1.758
1.638
1.640
1.776
1.77
1.59
1.621
1.648
1.125
取新鲜样品 10 g左右，加入约 100 g变色硅
胶，硅胶与叶片的比例≥10∶1（w/w），使叶片与硅
胶充分接触，保证在 12 h内干燥。硅胶干燥样品带
回实验室，常温避光保存。同一批次硅胶，相同环境
下分别保存 10 d、2、4、6、8、10、11、12、13、14、15、
16、17和 18个月，对不同保存时间下的样品提取
DNA样品，并检测 DNA抽提质量。
1.3 DNA提取方法
采用 CTAB法[4]抽提野生锥栗基因组 DNA。步
骤如下：取 0.8 g左右叶片放入研钵中（研钵先用液
氮预冷），同时加入 1勺可溶性 PVP，研磨 2～3次
至粉末状。立即取 0.4 g左右粉末装入 2 ml离心管
内，加入 1.2 ml预热的 2% CTAB提取液，振荡混
匀，于 65℃水浴 60 min，期间每隔 10 min摇匀一
次，动作轻柔。取出离心管，冷却至室温，10 000
rpm离心 3 min；取上清液，加入等体积的氯仿 ：异
戊醇（24∶1）混合液，慢慢颠倒混匀至溶液呈乳浊
状，10 000 rpm离心 15 min。吸取上清液转移至另
一 2 ml离心管，加入等体系氯仿：异戊醇混合液，
充分混匀，10 000 rpm离心 12 min。重复一次，取上
清液至新离心管，加入 1/10体积的 5 mol/L NaAc和
2/3至等体积的异丙醇（NaAc和异丙醇用前预冷），
充分混匀，室温静置 30 min；12 000 rpm离心 12
min。弃上清液，用 70%乙醇洗涤沉淀 2～3次，风干
后加入 300μl TE溶液，沉淀溶解完全后，加入
1/100体积的 RNase酶于 37℃消化 60 min，以去除
RNA。加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）
混匀后，12 000 rpm离心 10 min，取上清转移于空
1.5 ml离心管，再次抽提。弃上清液，70%乙醇洗涤
沉淀 2～3次，风干后加入 200μl TE溶液充分溶
解，存放于 4℃或 - 20℃备用，若长期不用，应存放
于 - 70℃。
1.4 DNA的检测
1.4.1 DNA 浓度和纯度检测 取 10 μl DNA溶
液稀释 100倍，在紫外分光光度计下分别在 260
nm和 280 nm时检测其吸光值及 DNA浓度，根据
OD 260/OD280的比值判断 DNA纯度。
1.4.2 DNA 质量检测 取 10μl DNA母液，电压
5 V/cm 下，在 1.5%琼脂糖凝胶中电泳 45 min，
SRYBGOLD染色后用凝胶成像系统检测质量。
2 结果与分析
2.1 不同保存时间对 DNA产物的影响
不同保存时间下的野生锥栗基因组 DNA经紫
外分光光度计检测，结果见表 1。保存 10 d到 12个
月后，所提取的野生锥栗 DNA样品均为白色或透
明状，OD值大部分处于 1.640～1.861之间，说明所
提取的锥栗 DNA纯度较高，满足一般 PCR扩增的
要求。超过 12个月后，所提取的 DNA样品开始呈
现黄色、黄褐色、直到褐色，表明 DNA样品纯度开
始下降，保存时间越长，被氧化程度越高，所提取的
DNA纯度则越低。
从表 1可以看出，随着保存时间的延长，DNA
浓度也呈现逐步下降的趋势。锥栗叶样硅胶保存 10
d到 10个月之间，提取的 DNA样品易被 TE溶解，
得率和浓度较高，而超过 10个月以后，DNA浓度和
得率都急剧降低，同时 OD值也有所降低，如保存期
为 11、12个月的 DNA样品 OD值仅为 1.638、1.640，
可见此阶段是叶样保存 DNA出现降解变化的转折
期。此后 DNA浓度呈持续下降趋势，在保存期达到
14、15个月时略有上升，但 DNA样品的纯度明显
下降，OD值由 1.776下降为 1.59。在 16个月后浓
度急剧下降，分析原因可能是保存 16个月后抽提
的 DNA样品不易被 TE溶解，由于在提取过程中沉
淀溶解不充分，从而丢失部分沉淀造成。而保存 18
个月的样品 DNA沉淀褐色、粘稠，不易溶解，浓度
和得率最低，可能是随着时间的延长，叶样细胞逐
渐受损，细胞中的 DNA结构的完整性逐渐被破坏，
生理活性状态相应失常，酚类物质被氧化所致。
2.2 基因组 DNA电泳结果
不同保存时间下所提取的基因组 DNA在 1%
琼脂糖凝胶上电泳结果如图 1。图中显示：保存时
间在 10 d、2、4、6、8、10个月的情况下样品 DNA均
有一条亮且整齐的谱带，而自保存期达到 11个月
刘国彬等：锥栗叶样保存时间对 DNA提取质量的影响 9
（上接第 7页）
生物提取方法的关键技术。
参考文献：
[1] 刘正初. 麻类纤维提取工程微生物研究回顾与展望[J]. 中国农
业科学，2007，40（增刊 1）：363-367.
[2] Y Zhang，Z Liu，X Chen. Cloning and expression of a mannanase
gene from Erwinia carotovora CXJZ95-198[J]. Annals of Microbi－
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[3] 李剑芳，邬敏辰，夏文水. β-甘露聚糖酶高产菌株选育以及产
酶条件的研究[J]. 食品与发酵工业，2005，31（9）：9-12.
[4] 郭 勇. 酶工程（第二版）[M]. 北京：科学出版社，2004.100-102.
[5] 肖 阡，宋光泉.有机化学[M]. 广州：中山大学出版社，1996. 272.
[6] 王钦德，杨 坚. 食品试验设计与统计分析[M]. 北京：中国农业
大学出版社，2002. 331-349.
（责任编辑：石 君）
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第 4期
以后，条带亮度减弱且条带出现弥散，虽然保存 13
个月样品 DNA浓度比保存 14、15个月的低，但由
于其 DNA纯度较高，条带亮度高于后者；保存 16
个月以后的样品只有微弱条带，而保存 17、18个月
的样品则无条带检测出，推测可能的原因是保存
17个月以后的样品 DNA大部分被降解。图 1还显
示：各泳道点样孔较亮，说明点样孔还残留部分杂
质，这可能与抽提到的 DNA样品中含有未彻底去
除的多糖和其它次生代谢产物等杂质有关，由于这
些物质具有粘连特性，常与 DNA结合成复合物，使
得 DNA分子无法离开点样孔，经荧光染料染色而
发亮。
3 小结与讨论
设置了不同保存时间的处理对硅胶干燥的野
生锥栗叶样提取的 DNA样品浓度、纯度和得率进
行比较，结果表明，随着保存时间的延长，基因组
DNA的浓度整体呈下降趋势，得率和纯度也有所
下降。前期（保存期从 10天到 10个月）变化比较平
缓，DNA浓度等各项参数无显著差异；中期（保存
期从11个月到 13个月）是细胞结构变化最大的时
期，DNA各项参数都急剧变化，浓度大幅度下降，
颜色变深，质量下降；后期（保存期从 14个月至 18
个月）虽然稍有回升，但总体呈下降趋势，至保存
18个月时降解十分严重，抽提的 DNA浓度、得率
和纯度均降至最低。表明硅胶干燥法保存植物材料
的最佳时期为 10 d～10个月，此阶段是提取植物
基因组 DNA的最佳时期。
实验材料取之不易，实验材料的保存方法及保
存有效期对实验的顺利进行具有重要意义。但实验
材料不同，硅胶干燥法保存的有效期也不尽相同。
靖相密等[2]在不同保存方法对腊梅 DNA提取效果
的实验中发现，保存 1 a的叶片与刚干燥的叶片所
提取的 DNA无区别；谢中稳等[1]曾利用硅胶干燥法
从普通野生稻叶片中制备 DNA，所提 DNA完全适
用于作 RAPD分析和建立总 DNA库；李学营等[5]证
实硅胶干燥保存的枣属植物叶片在 0.5 a内提取的
DNA无明显变化；笔者实验结果表明：硅胶干燥法
保存锥栗叶样在干燥后 10 d～12 个月期间抽提，
DNA质量无明显变化，13个月后开始降解，可知锥
栗硅胶保存有效期在 12个月内，与靖相密[2]研究结
果相同。
参考文献：
[1] 谢中稳，葛 颂，洪德元. 从普通野生稻硅胶干燥的小量叶片
中制备 DNA用于 RAPD分析和总 DNA文库的建立[J]. 植物
学报，2000，41（6）：807-812.
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效果的影响及 ISSR-PCR验证[J]. 分子植物育种，2008，6（2）：
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[3] 胡学林，乔 霞，吴 婷，等. 核桃叶片不同保存方法对其 DNA
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[5] 李学营，彭建营，彭士琪. 部分枣属植物硅胶干燥叶片 DNA提
取方法的比较[J]. 河北农业大学学报，2006，29（1）：38-40.
（责任编辑：张广平）
图 1 不同保存时间下提取的锥栗 DNA样品电泳图
（M-标样、1～14分别为保存时间 10 d到 16个月的样品）
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
湖南农业科学10