全 文 ：第 33 卷 第 3 期
2014 年 6 月
大 豆 科 学
SOYBEAN SCIENCE
Vol． 33 No． 3
Jun． 2014
壳梭孢素对铝敏感型黑大豆铝耐受性的影响
易 嘉，郭传龙，武孔焕，王 琳，赵秀玲，李昆志，陈丽梅
(昆明理工大学 生物工程技术研究中心，云南 昆明 650500)
摘 要:以铝敏感型黑大豆(简称 SB)为材料，研究铝胁迫下壳梭孢素(FC)对 SB 根铝耐受性的影响。结果表明:在
50 μmol·L －1铝胁迫下，添加 1 μmol·L －1 FC处理 8 h能够显著缓解铝胁迫对 SB根生长的抑制作用，使其根的相对生
长率(ＲＲG)增加 36． 4%。免疫共沉淀分析结果表明 50 μmol·L －1铝胁迫下添加 1 μmol·L －1 FC 增强 SB 根中 14-3-3
蛋白与磷酸化质膜 H + -ATPase的结合，使根尖质膜 H + -ATPase活性提高约 1 倍，根氢泵活性和质子外排氢离子能力
显著增强，根尖柠檬酸的分泌量增加显著，增加约 2 倍。这些结果证实铝胁迫下 FC 用于增强 SB 根中 14-3-3 蛋白和
质膜 H + -ATPase的相互作用和质膜 H + -ATPase的活性，从而增加 SB根柠檬酸的分泌作用及其对铝胁迫的耐受性。
关键词:黑大豆;14-3-3 蛋白;质膜 H + -ATPase;壳梭孢素;铝胁迫
中图分类号:S565． 1 文献标识码:A DOI:10． 11861 / j． issn． 1000-9841． 2014． 03． 0389
收稿日期:2013-11-06
基金项目:国家重点基础研究发展计划“973 计划”(2007CB108901)。
第一作者简介:易嘉(1985-)，男，硕士，主要从事植物代谢途径基因工程方面的研究。E-mail:yijiad013@ 163． com。
通讯作者:陈丽梅(1963-)，女，教授，主要从事植物代谢途径基因工程方面的研究。E-mail:chenlimeikm@ 126． com。
Effects of Fusicoccin on Aluminum Tolerance in Al-sensitive Black Soybean
YI Jia，GUO Chuan-long，WU Kong-huan，WANG Lin，ZHAO Xiu-ling，LI Kui-zhi，CHEN Li-mei
(Biotechnology Ｒesearch Centre，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)
Abstract:Effect of FC on aluminum tolerance of Al-sensitive black soybean(SB)roots under Al stress were investigated in
this research． The results showed that adding 1 μmol·L －1 FC for 8 h，it could significantly release the inhibition of 50
μmol·L －1 Al stress on the root growth of SB，and increase its relative root growth(ＲＲG)by 36． 4% ． Co-Immunoprecipitation
(Co-IP)analysis showed that adding 1 μmol·L －1 FC could enhance the interaction between 14-3-3 proteins and phosphoryla-
ted PM H + -ATPase，which increased PM H + -ATPase activity to approximately 1-fold，significantly increasing proton efflux and
citrate secretion to approximately 2-fold in SB roots under 50 μmol·L －1 Al stress． These results confirmed FC was used for en-
hancing interaction of the 14-3-3 protein and PM H + -ATPase and the activity of PM H + -ATPase，thereby increasing citrate se-
cretion and Al-tolerance in SB roots under Al stress．
Key words:Black soybean;14-3-3 proteins;Plasma membrane H + -ATPase;Fusicoccin;Al stress
铝的毒害是酸性土壤中限制作物生长的主要
因子，主要通过危害作物根的生长，从而影响营养
元素和水分的吸收来影响植物的生长和发育［1］。
在进化过程中植物形成了两种耐铝机制，即外部排
斥机制和内部耐受机制。其中铝胁迫下植物根系
分泌有机酸被认为是植物重要的外部耐铝机制之
一，柠檬酸是植物根尖分泌有机酸的一种［2］。
壳梭孢素(fusieoecin，FC)是由扁桃壳梭孢菌
(Fusicoccina，amygdale． L．)产生的一种碳三环双萜
的糖苷类毒素［3］。它在许多方面具有与生长素类
似的作用［4］。FC还是质膜 H + -ATPase 特异性激活
剂，植物经 FC处理后，能增加质膜 H + -ATPase 的活
性［5］。最近的研究结果显示，生长在磷酸铝培养基
上的胡萝卜突变体柠檬酸的分泌量和质膜 H + -AT-
Pase活性的增加有关，质膜 H + -ATPase 可能通过一
个柠檬酸-质子转运体系参与到柠檬酸分泌过程的
调控［6］。14-3-3 蛋白是普遍存在于真核生物中的一
种调控蛋白［7］，它与质膜 H + -ATPase的 C末端自抑
制区内磷酸化序列结合时，形成 14-3-3 /H + -ATPase
复合体从而活化质膜 H + -ATPase［8］，而 FC 能够使
14-3-3 /H + -ATPase这个复合体结合得更加牢固，显
著增强其活性［9］。对普通大豆的研究发现，在铝胁
迫下 FC的存在使质膜 H + -ATPase活性和柠檬酸的
分泌量增加［10］。
云南属于典型的酸性红壤区域，云南小黑豆是
云南当地一个重要的大豆栽培种，我们之前的研究
结果显示云南小黑豆属于铝敏感型黑大豆(Al-sen-
sitive black soybeans，SB)［11］，铝胁迫抑制 SB根尖质
膜 H + -ATPase的磷酸化及与 14-3-3 蛋白的结合，降
低 SB 根尖质膜 H + -ATPase 活性和柠檬酸分泌作
用［12］。本研究以 SB为实验材料通过考察在铝胁迫
下添加 FC 对 SB 根的相对伸长率、14-3-3 蛋白和质
膜 H + -ATPase的相互作用、根尖质膜 H + -ATPase 的
活性、柠檬酸分泌作用等来分析 FC 对 SB 根的铝胁
迫耐受性的影响。
390 大 豆 科 学 3 期
1 材料与方法
1． 1 材料
供试材料云南小黑豆(铝敏感型黑大豆简称
SB)［11］为云南本地的栽培品种。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 大豆的培养 SB种子平铺于垫有湿润滤纸
的培养皿中，在恒温(25℃)黑暗的培养箱中进行催
芽、浸种。待种子长出 2 ～ 3 cm 根后播在有针眼孔
的薄泡沫板上，置于盛有完全营养液［11］的黑色塑料
盆中培养，于白天 25℃ 和晚上 30℃，每天光照
(1 200 μmol·m －2·s － 1)12 h的培养室中进行漂浮培
养，每隔一天更换一次培养液。
1． 2． 2 试验材料的处理 选取生长 14 d 的 SB 幼
苗，先用 pH4． 3 的 0． 5 mmol·L －1 CaCl2预处理过夜
后，分两组处理，其中一组用 0，1 和 2 μmol·L －1的
FC 分别处理 0，2，4，8，12 和 24 h，作为单独的 FC处
理组;另一组在 50 μmol·L －1的铝处理液中添加 0，1
和 2 μmol·L －1的 FC分别处理 0，2，4，8，12 和 24 h，
作为 Al + FC处理组，以不添加铝和 FC 处理作为对
照(CK)。每个不同处理时间点做 6 个重复，记录经
0． 5 mmol·L －1 CaCl2预处理过夜后处理前的根长，然
后再分别记录每个处理时间点处理后的根长度，相
对根 伸 长 率 计 算 参 照 Howeler 和 Cadavid 的
方法［13］。
1． 2． 3 质膜的分离与纯化 将完全营养液中培养
14 d的 SB 幼苗预处理后，置于含有 1 μmol·L －1的
FC和 50 μmol·L －1 AlCl3的溶液 100 mL(含有 0． 5
mmol·L －1 CaCl2，pH4． 3)中处理 8 h，收集 0． 3 g 的
1 ～ 2 cm根尖样品，速用液氮冻存用于质膜的分离。
质膜的分离与纯化采用 Shen等［10］描述的方法。
1． 2． 4 质膜纯度的检测和质膜 H + -ATPase 活性的
测定 H + -ATPase活性测定参照 Ｒabotti 等［14］方法。
质膜蛋白纯度的测定参考 Guo等［12］的方法。
1． 2． 5 免疫共沉淀( Co-IP) 和 Western Blot 分析
免疫共沉淀和 Western Blot 方法以及所用抗体参照
Guo等［12］的方法。
1． 2． 6 质膜 H +泵活性测定 质子从膜内向外的
泵出根据吖啶橙(AO)A492处吸光值淬灭的方法
测定［15］。
1． 2． 7 根柠檬酸分泌量的测定 水培 2 周的 SB幼
苗，预处理过夜后，然后分别置于 100 mL 含有 50
μmol·L －1的 AlCl3溶液，只加 1 μmol·L
－1 FC 溶液，1
μmol·L －1 FC + 50 μmol·L －1 AlCl3溶液(含有 0． 5
mmol·L －1 CaCl2，pH4． 3)以及预处理液中(CK)，处
理 8 h后，收集 SB的根尖分泌液，真空抽干后溶于 1
mL蒸馏水中，用 HPLC测定柠檬酸分泌量［12］。
1． 2． 8 根尖分泌 H +的测定 采用 Tomasi 等［16］的
嗅甲酚酯染色法测定根尖 H +的分泌。
1． 3 数据分析
各项生理指标的检测均进行 3 次重复，采用统
计学分析软件 SPSS16． 0 进行单因素方差分析(one-
way ANOVA)，进行统计学分析(P ＜ 0． 05)。
2 结果与分析
2． 1 FC对铝胁迫条件下 SB根生长的影响
如图 1 所示，无铝胁迫下，随着 FC 处理时间的
延长，SB的相对根伸长率(ＲＲG)呈现出先上升而
后下降的趋势(图 1A)，在处理 4 h时 FC对 SB根生
长的刺激效果达到最佳，此时，与对照(CK)相比，
2 μmol·L －1比 1 μmol·L －1的 FC 处理对 SB 的根生
长的影响更明显。当在 50 μmol·L －1铝胁迫下，以
及铝胁迫下添加 1 和 2 μmol·L －1的 FC(图 1B)，随
着铝处理时间的延长，铝胁迫对 SB 根生长的抑制
作用越来越大;在铝胁迫下添加 FC，随着处理时间
(A)不同浓度 FC处理对 ＲＲG的影响;(B)在铝胁迫下添加不同浓度 FC对 ＲＲG的影响;图中标有不同字母表示差异显著。下同。
(A)Effects of different concentration FC on the ＲＲG of SB;(B)Effects of different concentration FC on the ＲＲG of SB under Al stress;
Figure marked with the different letters indicates difference is significant． The same below．
图 1 铝胁迫下激活剂 FC处理 SB对其根相对生长量的影响
Fig． 1 Effects of FC on the relative root growth(ＲＲG)of SB under 50 μmol·L － 1 Al stress
3 期 易 嘉等:壳梭孢素对铝敏感型黑大豆铝耐受性的影响 391
延长，SB的 ＲＲG呈现出先上升而后下降的趋势，在
FC处理 4 h后，与对照相比，SB 的 ＲＲG 最大，说明
FC可以缓解铝胁迫对 SB 根生长的抑制作用;在处
理 8 h 后 FC 的作用效果减弱，此时不同浓度的 FC
处理效果没有显著差异。由于铝胁迫处理 8 h 后对
SB根生长的抑制作用显著，而铝胁迫下添加
1 μmol·L －1FC处理 8 h 后缓解作用也较显著。故
在后续实验中在 50 μmol·L －1铝胁迫下 FC 的使用
浓度为 1 μmol·L －1，处理时间为 8 h。
2． 2 FC对铝胁迫条件下 SB根尖质膜H + -ATPase
与 14-3-3 蛋白互作及其活性的影响
如图 2A 所示，结果表明 SB 经 50 μmol·L －1铝
胁迫处理 8 h后与对照(CK)相比，质膜 H + -ATPase
的磷酸化水平及其结合的 14-3-3 蛋白量都显著下
降;1 μmol·L －1FC单独处理 SB根 8 h后与 CK相比
质膜 H + -ATPase的磷酸化水平及与之结合的 14-3-
3 蛋白量显著增加(大约 1 倍);在铝胁迫处理同时
添加 FC(Al + FC)处理，SB 根尖质膜 H + -ATPase 的
磷酸化水平及与之结合的 14-3-3 蛋白量恢复至比
对照(CK)更高的水平。分析 50 μmol·L －1铝胁迫
下添加 1 μmol·L －1 FC 处理 SB 根 8 h 后根尖质膜
H + -ATPase的活性(图 2B)，结果表明与 CK 相比铝
胁迫单独处理使 SB根尖质膜 H + -ATPase 活性下降
(约 30%)，FC单独处理使 SB根尖质膜 H + -ATPase
活性显著增加(约 70%)，在铝胁迫的同时添加 FC
处理使 SB根尖质膜 H + -ATPase活性恢复至对照的
147． 6%。以上结果表明 FC 能够逆转由于铝胁迫
而导致质膜 H + -ATPase 磷酸化水平和活性的下降
作用，增加其与 14-3-3 蛋白的相互作用。
(A)Co-IP分析 SB根尖质膜H + -ATPase与14-3-3 蛋白的互
作;(B)SB根尖质膜 H + -ATPase活性。
(A)Interaction of PM H + -ATPase and 14-3-3 protein in SB
roots with Co-IP analysis;(B)Activity of PM H + -ATPase in SB
roots．
图 2 质膜 H + -ATPase与 14-3-3 蛋白的
相互作用及其活性的分析
Fig． 2 Analysis of interaction of PM H + -ATPase
and 14-3-3 protein as well as its activity
2． 3 FC对铝胁迫条件下 SB 根尖质膜 H +泵活性
和柠檬酸分泌的影响
如图 3 所示，在 50 μmol·L －1铝胁迫下添加 1
μmol·L －1 FC 处理 SB 根 8 h 后，结果表明与对照
(CK)相比，铝胁迫处理(Al)使 SB 根尖的 H +泵活
性显著降低至对照的 17． 6%，在 Al + FC 处理后
使 SB根尖的 H +泵活性增加至对照的 132． 4%(图
(A)SB根尖 H +泵活性;(B)SB根尖 H +外排作用;(C)SB根尖柠檬酸分泌。
(A)H + pump activity in SB roots;(B)H + efflux in SB roots;(C)citrate secretion in SB roots．
图 3 SB根的 H +泵活性、H +的外排及其柠檬酸分泌
Fig． 3 H + pump activity，H + efflux and citrate secretion in SB roots
392 大 豆 科 学 3 期
3A)，在质膜提取液中加入短杆菌肽后显著消除了
H +泵的活性，这证实所提取的质膜纯度比较高。溴
甲酚酯染色实验中(图 3B)，在铝胁迫 SB 根周围黄
色较浅，范围也小，说明 H +分泌作用较弱。Al + FC
处理使 SB 根周围黄色较重，范围增大，说明铝胁迫
下添加 FC 刺激了质膜 H + -ATPase 的活性增加 SB
根尖 H +的外排作用。SB根柠檬酸分泌量的变化趋
势与其质膜 H + -ATPase 活性的变化一致，与 CK 相
比，Al处理使 SB 根尖柠檬酸分泌水平上升不显著，
而单独 FC处理使 SB 根柠檬酸分泌水平增加 1． 5
倍，在 Al + FC处理使 SB根尖柠檬酸分泌水平增加
1． 3 倍(图 3C)。这些结果表明铝胁迫下 FC增加了
SB根尖的质膜 H + -ATPase 活性和 H +泵活性且可
以提高 SB根柠檬酸分泌作用。
3 讨 论
本研究发现在 50 μmol·L －1铝胁迫下抑制了 SB
的根生长，在 24 h时抑制达到 50%。天然的植物激
素 IAA(吲哚乙酸)能缓解植物的重金属胁迫，明显
促进根的生长［17］。Takahashi 等也证实 IAA 诱导拟
南芥黄化苗上胚轴早期的伸长作用是通过 IAA 诱
导质膜 H + -ATPase 的磷酸化作用使其与 14-3-3 蛋
白的结合增强、活性增加，分泌更多的质子酸化细
胞质外体空间而实现［19］。本研究发现在正常情况
下，用极低浓度的 FC(1 ～ 2 mol·L －1)处理 SB，在较
短时间内有促进 SB根伸长的作用，增加 SB 根对铝
的耐受性，说明早期的 FC 处理和 IAA 引起的细胞
和下胚轴伸长的作用效果和机理一致，是因为 FC
刺激质膜 H + -ATPase 的活性使质子大量分泌到质
外体中引起细胞壁松弛，细胞伸长使 SB 根的相对
根伸长率增加。在铝胁迫下 FC 在短时期内也可以
拮抗铝抑制 SB根的伸长作用，增加 SB 对铝胁迫的
耐受性。随着 FC处理时间的延长，SB 的相对根伸
长率减少，FC对根的生长表现为抑制作用，可能随
着 FC处理时间的延长使 SB 根内部细胞死亡，从而
影响根的生长。这可能也是在铝胁迫下 FC 使用时
间延长后其缓解铝抑制 SB 根伸长作用下降的
原因。
Tomasi等［16］研究结果说明在磷缺乏条件下添
加 FC处理时使白羽扇豆的羽根柠檬酸分泌量增
加，是因为 FC的存在增加了质膜 H + -ATPase 与 14-
3-3 的结合，从而增强质膜 H + -ATPase 的活性和质
子的外排作用使柠檬酸分泌增加。与这些报道相
一致，本研究结果也证实 FC 处理 SB 显著增强根质
膜 H + -ATPase与 14-3-3 蛋白的结合使其活性提高，
增强 SB根氢泵活性和质子的分泌作用，柠檬酸分
泌量也相应增加。在铝胁迫下添加 FC 也增强 SB
根质膜 H + -ATPase 的活性和柠檬酸分泌从而增强
了 SB根对铝胁迫的耐受性。
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