全 文 ：福建省农科院学报 s( 3) : 3 2一 3 7, 19 9 3
oJ 砰朋 l of 几 j必: A c 。成卿王歹 of Ag r众,比初 al sc 姗 ce s
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满江红茎尖低温保存的初步研究
陆培基 , 徐国忠 ` 郑伟文 ` 华泽钊 2 孙卫东 2
(福建省农业科学院红萍研究中心 , 福州 350 01 3 ;
上海机械学院低温生物工程研究室 , 上海 2 0 0 0 93)
摘试攀 本文探讨用二步保护法 , 即冻前用低浓度 D~ 抗冻剂对茎尖进行预处理
, 冻时用高浓度
v s :液作保护剂对旅状满江红和卡州满江红茎尖进行慢速冷冻 ( 0 . 5 一 5 . 0℃ / m i的所取得的效果 。研
究表明 , 茎尖的生理状况 , D M s o 的浓度及处理时间 , 降温速率对茎尖冻后存活率有显著影响 。将
蔗状满江红冷冻到一 30 ℃ 的20 个不同处理中 , 有 18 个处理的53 个革尖存活 , 最高成活率可达 10 % 。
冷冻到一 32 . 5 ℃的8个处理中 , 有 5个处理的 14 个茎尖存活 。
关 . 调 : 满江红 . 茎知 低温保存
A P r e l而 ian r y S t du y o n C r y叩 r e s e r v a t io n o f A z o . la M e r is t em
L u eP 球 , , X u G u o z h o n g , , hZ e n g W e iw e n ’ , H u a Z h e z h a o Z a n d hS u n W e id o n g Z
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o f 少 ot e ct 砷n t r e at m e n t a n d c o l in s r a t e ca n e f f e c t is s n i f ica n t ly o n su r vi v a l r a t e o f th e
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K . y W o r血 : A oz al ; M e r ist e m ; C r yO Pr e s e r v a t i o n
小型水生植物满江红 ( zA of al ) 是真核蔗类与原核 固氮鱼腥藻 ( A an ha en a az gl a ) 的共生体 ,
它既是优质肥料 、 饲料和饵料 , 又是共生固氮研究的好材料 。满江红种质资源的收集与保存是
进行满江红科研与生产的前提 。 长期以来 , 满江红种质资源的保存主要靠无性繁殖 , 不仅耗费
大量人力 、 物力 , 且易受自然或人为的影响 。
生物材料的超低温保存是本世纪 50 年代发展起来的一项新技术 , 其主要原理是 : 将生物
用保护剂进行预处理 , 然后用一定的降温速率 , 使细胞降温到液氮温度 , 若能在降温和复温
的过程中避免胞内结冰等原因造成的伤害或死亡 。则细胞在液氮温度下能处于新 陈代谢近似
收稿 日期 : 19 9 0一 10一 2 0
第 3期 陆培基等 : 满江红茎尖低温保存的初 步研究
中止的状态 , 达到长期保存的目的 。
自从 1 9 7 6年 , se i be i t 第一次成功地将寮香石竹茎尖进行液氮保存以来 , 草葺 、 番茄 、 豌豆
等十几种也被成功地应用于超低温保存 lj[ , 但至今未见有满江红超低温保存的报道 。
鉴于新鲜满江红组织的含水量高达90 一 95 %又有另外一种生物与之共生 , 这些特殊性大
大地增加了满江红超低温保存的难度 , 为此 , 我们在前人的基础上 , 改用二步法对满江红茎
尖组织进行处理 , 取得了初步的进展 , 现报告如下 。
1 材料和方法
1
.
1 材料培养 蔗状满江红 (A . 了“蜘如翻比5 aL m ) 卡州满江红 (A . ca’ iol 俪、 iW ld ) 。茎尖横径
0
.
5一 0 . gm m 带 3一 5 张叶片 , 在 Y 氏无氮培养液预培养 1一 3天 。
1
.
2 保护剂 采用二 甲亚矾 ( D M s o ) 作为预处理的保护剂 。浓度以 v/ v 计算 , 用 Y 氏无氮培
养液配制 。 v S Z玻璃化保护剂的组成为 : 46 %丙二醇 ( v/ v) , 6%聚乙二醇 (分子量等于 60 0 ) ,
w v/ 用 Y 氏无氮培养液配制 。
1
.
3 预处理 将 Y 氏无氮培养液与 DM S o 配制成不同浓度的溶液 v( / v ) , 然后将茎尖浸入
不同浓度的上述保护剂溶液中 , 从稀到浓 , 进行不同的时间处理 。
1
.
4 降 温 在 I c m x I c m 的薄铜片上 , 滴一滴 v S Z液 , 将预处理过的茎尖用吸水纸吸干水
分 , 放入 v S Z滴中 , 处理过的茎尖浮于液面 , 铜盘悬挂在液氮缸 口 , 按一定的降温程序降温 ,
到达指定温度时 , 平衡 5分钟 。
1
.
5 复 温 迅速提升铜盘 , 用热风机 ( 2 0 0 0w ) 使铜盘迅速升温到 35 ℃ , 速率为 24 0℃ / m in 。
1
.
6 培 养 升温后的茎尖按预处理时保护剂的最终浓度 , 以 5 %浓度梯度稀释 , 每步 15 一
20 分钟 , 后在 Y 氏无氮培养液中培养 , 温度 20 一 25 ℃ , 光照 20 0 0L x , 茎尖成活率以新叶长出
5叶为准 。温度测定用铜一康铜热电偶 (直径 0 . l m m ) , 紧贴于铜板上 。 降温程序由微机控制低温
生物降温仪执行 (上海机械学院低温生物工程研究室研制 ,降温速率范围 0 . 01 一 20 ℃ / m in) , 用
x w x 一 2 0 4 2自动平衡记录仪记录降温曲线 (上海大华仪表厂制 ) 。
2 结果 和讨论
.2 1 二步保护法的冷冻保护作用
我们曾用 DM S o 对红萍茎尖在室温条件下进行预处理 , 并在冷冻时用作保护剂 , 均未取
得预期效果 。 究其原因 , 主要是茎尖外的保护剂结冰造成茎尖死亡 。 w et he r 等 ( 1 9 8 0) 曾指出 ,
胞外溶液的结冰会诱发胞内冰晶的形成 , 进而导致细胞死亡闭 。 我们的试验结果证明了这一结
论 。从表 4可见 , 在室温下红萍茎尖用 5%的 D M S O 预处理 1 2小时 , 在冷冻时又用 5%的 D M s o
作保护剂 , 当冷冻至一 13 . 5℃时 , DM S o 已开始结冰 , 因此 , 实际上茎尖在未达到一 20 ℃的冷
冻终温时已因保护剂的结冰而受到严重损害 , 以至于全部死亡 。正如表 4所示 , 单用 D M S O 作
保护剂即使进一步增加浓度和预处理时间 , 虽然能使保护剂的冰点有所降低 , 但它们都在达
到冷冻终温之前结冰 , 以致所有供试茎尖无一存活 。
为了防止胞外溶液结冰 , 我们又采用了80 年代由 H af y 等发展的一种玻璃化保存方法 5[] 。
该法是以高浓度的大分子量的防冻剂处理样品 , 并结合加压 , 快速将样品降到液氮中进行保
存 。这种防冻剂 ( vS Z ) 在低温下形成一种玻璃化状态 , 不产生晶态冰 , 从而可防止胞外结冰对
福建省农科院学报 第 8卷
细胞的伤害 。然而 , 初步的试验结果表明 , 如不对茎尖进行预处理 , 仅在冷冻时用 V S Z作防冻
剂 , 超过 一 15 ℃时 , 茎尖亦未能存活 , 可能是由于胞内溶液结冰所致 。 以后又尝试用 v S Z在室
温下对茎尖进行预处理 , 以提高细胞内溶液的浓度 , 降低其冰点 , 然而即使用低浓度的 v s : ,
对红萍茎尖也有很高的毒性 。
于是 , 我们在上述试验的基础上 , 结合以上两种方法的优点 , 发展成 “ 二步保护法 ” , 即
在室温下先用 D M S o 对茎尖进行预处理 ; 在冷冻时 , 再用 v S Z作保护剂 。实验结果列于表 1 。
表 1 二步保护法对蔽状满江红茎尖的冷冻保护效果
T a b l e 1 T h e e f f e c t o f t h e t w o
一 s t e P P r o t e e t i o n o n th e e r y o Pr o t e e t in n o f A
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D M s o 预处理
P r e 一 t r e a ti n g b y D M S O
冻时处理
C o l i n g
一 t rae t i n g
浓度
C o n e e n t r a t i o n
(% )
时间
T i m e
(h )
保护剂
P t o t e e讯 n t
冷冻速率
C o l i n g r a t e
(℃ / m i n )
温度
T e m pe
r a t u r e
(℃ )
保护剂结冰状况
S t a t e o f
rP ot
e C t a 协 n t
茎尖成活率
S u t v i v a l
( % )
5
.
5
.
1 2
.
12
.
5 % D M SO
V S Z
一 2 0 . 0
一 2 0 . 0
冻结 F r oz e n
不冻结 N o n 一 r r o z e n
1 0% D M SO
V S Z
一 2 5 . 0 冻结 F r oz e n
一 2 5 . 0 不冻结 N o n 一 r r o e n
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5
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.
5 一 2 7 . 5 不冻结 N o n 一 f r o z e n 5 4 . 5
1 5
.
0 0
.
5
从表 1可见 , 在室温下茎尖用 5 %的 D M S o 处理 1 2小时 ; 在冷冻时 , 又用 v S Z处理 , 冷冻终
温为一 20 ℃茎尖全部存活 , 而冷冻时用 5% D M S O 处理的对照则全部死亡 ; 进一步增加预处理
的浓度和时间 , 红萍茎尖在一 25 C 和一 27 . 5 ` C 低温下的存活分别达 42 . 1%和 54 . 5% , 而其相
应的对照依然无一存活 , 这表明 , 用 “ 二步保护法 ” 对提高红萍茎尖在低温下的耐受性和存
活率有良好的效果 。
2
.
2 影响冻后茎尖存活率的因素
2
.
2
.
1 满江 红的生长季节和 茎尖生理状况 不同季节的满江红茎尖 , 冻后存活率差异很明
显 。晚秋的蔗状满江红茎尖冷冻效果最好 ,春夏的茎尖存活率低 。这可能与秋季昼夜温差大 、体
内累积较多 、 胞内内含物增多 、 蛋白质浓度增大有关 。健壮的茎尖冷冻效果也好 , 这可能与保
护剂对健壮茎尖的毒性较小有关 (表 l ) 。
2
.
2
.
2 预处理保护剂的浓度与处理时间 保护剂的浓度和处理时间是影响满江红茎尖冻后
存活率的重要因素 。增加保护剂浓度 , 可以使冷冻温度进一步下降 (表 2 ) , 但浓度增加到一定
时 , 茎尖冻后存活率则明显下降 。本实验中 , 用 20 % DM S o 处理 0 . 5小时以上的茎尖 , 冻后均不
会存活 。这可能与浓度过高 , 产生过大的溶液损伤效应有关 。
第 3期 陆培基等 : 满江红 茎尖低温保存的初步研究
在同一浓度和降温速率下 , 适当地增加处理时间则可以提高冻后存活率 (图 1 、 2 ) 。 图 1可
表 2 预处理浓度对卡州满江红茎尖存活率的影响
aT b l
e 2 T h e e f fe
e t o f P r e t r ea t e d e o n ce n t r at io n o f D M S O
o n th e m e r ist
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.
c a r o l加衍加
保护剂浓度
C o n e e n t r a t i o n
( % V / V )
处理时间
T im e
( h )
冷冻温度
C o l i n g
t e m eP 扭亡u托 ( ℃ )
茎尖成活率
S u r v i v a l t a t e
(% )
一 2 0 . 0
一 2 2 . 5
1 6
.
0 一 2 5 . D
洲 一 .25 。
2 0
.
0
3
.
0 一 艺执 U
以看出 , 茎尖在 5 % DM s o 中处理 4小时 ,
冻后存活率为 O ; 4小时到 7 . 5小时 , 随处
理时间的增加 , 存活率也相应提高 ; 7 . 5
小时到 1 8 . 5小时 ,存活率相对比较稳定 。
这似乎表明 D M S o 在 胞 内浓度 处于平
衡状态的所需时间是 比较长的 。 图 2中也
可以看出 , 茎尖经 5% D M S o .7 h5 处理
后 , 再用 10 % D M s o 不同时间的处理 , 冻
后存活率也随时间的增加而提高 。
在保护剂处理茎尖过程中 , 还可见
到茎尖先收缩 ,后复原的现象 。 当 DM S o
浓度为 5 一 10 %时 , 0 . 5小 时后 , 茎尖 收
缩 , 1 . 5小时左右 ,收缩最甚 ,尔后慢慢复
原 ;到 一4 , 5小时左右基本复原 。 收缩可能
nUnóO
:
自万.…二J匕SóaUC亡刁n“
.11工
是 由于胞 内渗透 压小于胞 外 D M S O 液
的渗透压 ,胞内水分 向外渗透 ,细胞失水所引起的 。 复原则可能是渗透性保护剂等渗入细胞所
致 。倘若如此 ,那末茎尖的这种变化 ,势必会对不同处理时间的茎尖冻后的存活率产生影响 。
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图 1 5 % D M so 处理时间对蔗状满江红茎尖存活率
的影响
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m e ir s t e m su r vj val of 月
. 了以衣浏勿初肠吕
预处理 P r e 一 t r e a t i n g : R 一 1 0 , 2 . s h ; R 一 1 5 , 0 . s h
冷冻速率 e o l i n g r a t e : 0 . 5℃ / m i n
冷冻温度 e o l i n g t e m p e r a t u r e : 一 3 0 ℃
2 4 6
图 2 10 % D M os 处理时间对蔗状满江红茎尖存活率
的影响
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e t o r t r ae t in s t i m e o f 1 0 % D M S O
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. 了以众忠勿翻触名
预处理 P r e 一 t r e a t i n g : R一 5 , 7 . s h ; R 一 1 5 , 0 . s h
冷冻速率 e ol i咫 r a t e : 0 . s aC / m i n
冷冻温度 e o l sn g t e m eP r a t u r e : 一 3o C
2
.
2
.
3 冷冻速率 冷冻速率的选择也是影响茎尖冻后存活率的重要因素 。 从表 3中可以看出 ,
随着冷冻温度的下降 , 冷冻速率也湘应地下降 。在保护剂预处理条件不变时 , 则可通过调节冷
福建省农科院学报 第8卷
冻速率以提高茎尖存活率 。
从上述结果看 , 预处理保护剂浓度 、 保护剂处理时间以及冷冻速率之间是相关的。 茎尖在
某一浓度中处理足够的时间 , 增加浓度可以使冷冻温度下降 ; 在预处理保护剂浓度不变时 , 适
当地增加处理时间 , 可以增加茎尖存活率和降低预冷温度 ; 在保护剂浓度和处理时间均不变 ,
适当地降低降温速率 , 也可以提高茎尖存活率并使预冻温度下降 。
了恤bl e 3
农 3 降沮邃率对旅状满江红茎尖存活率的形响
Tb e e f fe tC of e o l i
n g r a et o n th e m e r is t e m su r v l v a l o f A
.
D M S O 浓度
C o n ce
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时 D M S o (写v /v )
处理时间
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( h )
降温速率
C o l i n g r a t e
(℃ / m i n )
冷冻温度
C o 】i n g
t e m ep ar t u r e (℃ )
存活率
S u r v i v a l
(% )
3 6
.
0
3 0
.
0
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苦 P r e一 taer
t i n g a t 2 5℃ ; the ot h e sr 15 P r e一 tr ae tde a t 4℃ .
用这种方法 , 将蔗状满江红茎尖在 一 30 ℃和一 32 . 5℃的预冻温度下冷冻均获成功 。 在
一 3 0℃的温度下进行的 20 个处理 , 有 18 个处理中获得了 53 个存活的茎尖 , 其中 5个处理的茎尖 ,
戴藻均能正常生长 。其余的处理共生藻生长受到抑制 。 在 25 ℃温度下用 5% D M S O 处理 7 . 5小
时 , 10 % D M S O 处理 6小时 , 15 % D M S o 处理 0 . 5小时 , 冷冻速率为 0 . 5℃ / m in 的处理茎尖存
活率最高可达 1 0 % , 且存活的茎尖蔗藻生长均正常 。 用同样的预处理程序和冷冻速率 , 将卡
州萍茎尖冷冻到一 30 ℃也获得了37 %的存活率 。
在一 32 . 5℃温度下进行的 8个处理中 , 有 5个处理获得成功 , 存活 14 个茎尖 , 但这些茎尖
的共生藻大多受到抑制 。
冻后存活的蔗藻共生的旅状满江红茎尖经培养 , 繁殖后 , 连续进行 3次生物量测定和固氮
酶活性测定表明繁殖速度均比对照快 , 但经生物统计 , 总的来说 , 差异不显著 。 而固氮酶活性
均比对照提高 (表 4 ) 。
第 3期 陆培基等 : 满扛红茎尖低沮保存的初 步研究
表 4 冷冻后旅状满江红生物 t 和固氮陇活性测定
T a bl e 4 Th
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一
f i x in g fO t h e e r y o- t r ea t de m
e r si t e m fo A
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冷冻温度 测产量
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资
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C o l in s t e m pe r a t u r e
(℃ ) 1 1 1
固氮酶活性
N i t r og e n
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( u m o1 C : H。厄 f r ea h W t . h )
2
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0 0 3 2
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C K
资 : 数字为 3次重复平均值 。 M e a n o r t h r e e r e p u ca t ion
总之 , 本研究表明采用我们自己建立的二步法 , 通过对预处理保护剂的选择 , 预处理浓
度 , 时间以及降温速率的调节 , 可在一 30 ℃和 一 32 . 5℃使蔗状满江红茎尖存活 。 卡州满江红茎
尖也能在一 30 ℃存活 。
致 谢 : 本课题是刘中柱研究 员提 出并指导下进行的 , 林沧博士对该研究给予大力支持 , 谨
此表示感谢 。
参 考 文 献
[ 1〕凡 f y , e . M一 , s 6 . v 一t r i r一ca t ion : 人 n o w a p件 ao e h t o or , n e r y o p r e , r v a t lon i n “ T at n s p一a tion : A p p rao e h e s ot G r a f t R e je e t ion ”
M e r u am H
.
T ( de ) A l a n R
.
L IS , In e : 30 5一 3 3 5
[ 2〕 K a r t h a K . K . 19 8 5 . e r y o p r es vr a t ion of P la n t 。 一s a耐 。 邝 a n s c R c p r es , In e : 12 0一 13 1
[ 3〕 M a z u r , P . 1 9 6 5 . Q u二 o r i n jU r v i n fr oez n a n d t恤 w 比 , 一l , F e d . rP oc . 2 4 ( 2 ) : s 一 1 7 5
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