全 文 ：第 33 卷 第 4 期
2014 年 8 月
大 豆 科 学
SOYBEAN SCIENCE
Vol． 33 No． 4
Aug． 2014
外源 SA诱导黑大豆根系柠檬酸分泌缓解 Al毒害
王闻闻，陈宣钦，陈 奇，陈丽梅，李昆志
(昆明理工大学 生物工程技术研究中心，云南 昆明 650500)
摘 要:采用溶液培养的方法，以 Al敏感型黑大豆(SB)为材料，研究外源添加水杨酸(SA)对 Al胁迫下 SB根生理生
化指标和 Al胁迫相关基因表达的影响，探讨外源 SA 缓解黑大豆 Al 毒害的分子机理。结果表明:低浓度(10，
20 !mol·L －1)SA缓解了 Al毒引起的根伸长抑制，其中 20 !mol·L －1 SA的缓解效果更明显;而高浓度 SA和 SA合成抑
制剂多效唑(PAC)处理加重了 Al毒引起的根伸长抑制;外源添加 20 !mol·L －1 SA使 Al胁迫下 SB根尖 MDA和H2O2
含量下降，根系分泌物中柠檬酸的含量约是单独 Al处理的 2 倍;基因表达分析表明外源添加 20 !mol·L －1 SA促进 Al
胁迫下 SB根中 12 个 14-3-3 亚型、质膜 H + -ATP酶和柠檬酸通道蛋白(MATE)基因的表达;免疫共沉淀的结果表明外
源添加 20 !mol·L －1 SA提高了 Al胁迫下质膜 H + -ATP酶蛋白磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白结合能力;外源添加 PAC
的效果与外源添加 SA的相反。外源 SA可能通过诱导 Al 胁迫下 MATE 表达，提高 14-3-3 蛋白和质膜 H + -ATP 酶基
因蛋白水平和互作，增加柠檬酸的分泌，增强黑大豆对 Al毒害的耐受性。
关键词:黑大豆;Al胁迫;水杨酸;柠檬酸;14-3-3;H + -ATP酶
中图分类号:S565． 1;Q945 文献标识码:A DOI:10． 11861 / j． issn． 1000-9841． 2014． 04． 0507
收稿日期:2014-03-13
基金项目:国家自然科学基金(31260297);云南省自然科学基金(KKSA201126058)。
第一作者简介:王闻闻(1988-)，女，硕士，主要从事植物营养基因工程研究。E-mail:wangwenwen01@ sina． cn。
通讯作者:李昆志(1963-)，男，教授，主要从事植物生理学方面的研究。E-mail:likunzhi63@ 126． com。
Exogenous SA Alleviated Al Toxicity by Inducing Citric Acid Exudation in Black
Soybean Ｒoots
WANG Wen-wen，CHEN Xuan-qin，CHEN Qi，CHEN Li-mei，LI Kun-zhi
(Biotechnology Ｒesearch Center，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，Yunnan)
Abstract:A method of solution culture to Al-sensitive black soybean(SB)was used to study the effects of exogenous salicylic
acid(SA)on the physiological parameters and Al stress-related gene expression in SB root under Al stress． The aim of the study
is to explore the molecular mechanisms of exogenous SA alleviating Al toxicity in SB． The results showed that a low concentra-
tion(10 and 20 !mol·L －1)of SA alleviated inhibition of root elongation caused by Al toxicity，wherein the alleviation effect of
20 !mol·L －1 SA more significant． However，high concentration of SA and SA synthesis inhibitors paclobutrazol(PAC)in-
creased inhibition of root elongation caused by Al toxicity． Exogenous 20 !mol·L －1 decreased the MDA and H2O2 content in SB
under Al stress，and the citric acid content in root exudates was about twice as higher as that of single Al treatment． Expression
analysis showed that exogenous 20 !mol·L －1 SA enhanced the expression of the 12 substype of 14-3-3 isoforms，plasma mem-
brane H + -ATPase and multidrug and toxic compound extrusion transporter(MATE)gene in SB under Al stress． The results of
the co-immunoprecipitation showed that exogenous 20 !mol·L －1 SA improved the levels of protein phosphorylation for plasma
membrane H + -ATPase and its binding capacity with 14-3-3 protein under Al stress． The effect of exogenous PAC treatment was
opposite with SA． It was suggested that exogenous SA may enhance the SB tolerance to Al stress by inducing MATE expression
and enhancing 14-3-3 and plasma membrane H + -ATPase protein levels and interaction between them to increase citric acid
exudation．
Key words:Black beans;Al stress;Salicylic acid;Citric acid;14-3-3;H + -ATPase
在全世界范围内，大约 30%的可耕种土壤为酸
性土壤，主要分布在对粮食需求量最大的发展中国
家及地区，包括南非、中亚和东南亚等［1］。在我国，
酸性土壤主要分布在长江以南的亚热带、热带地区
及云贵川等地，遍及 14 个省区，约占全国耕地面积
的 21%［2］。在酸性土壤上，Al毒害是限制作物生长
的主要因子之一［3］。对于很多植物而言，微量的 Al
就可以抑制植物根的生长和发育，从而影响植物根
系对养分和水分的吸收，最终影响植物的生长及其
产量。减轻或消除酸性土壤的 Al 毒害是全世界农
业生产中迫切需要解决的重要难题。
在植物的进化过程中，植物进化出了多种耐 Al
和抗 Al方式。植物耐 Al毒的生理学机制通常被分
为两类，即内部耐受机制和外部排斥机制［4］，这两
种机制的主要区别在于解毒位点不同。内部耐受
机制是通过细胞内解毒作用将植物根系已吸收的
Al转化为毒性较小或无毒性的结合形态，来缓解体
内 Al对植物的毒害作用，包括胞内有机配体对 Al
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的螯合和液泡的区室化等。与内部耐受机制不同，
外部排斥机制是限制 Al进入植物细胞，在细胞外螯
合并排除，包括能螯合 Al的配体如有机酸及磷酸盐
的分泌、细胞壁对 Al 的固定、诱导产生的根际 pH
屏障、Al3 +被主动输出细胞外等［5］。在植物的抗 Al
机制中，Al诱导有机酸的分泌起到了重要作用，被
认为是植物抗 Al的主要机制。
水杨酸(salicylic acid，SA)是植物体内普遍存
在的一种小分子酚类物质，化学名称为邻羟基苯甲
酸。作为新型植物激素和信号分子 SA 广泛参与植
物生长和发育的各个过程，介导植物体对生物和非
生物逆境胁迫的应答［6］。SA 不仅能诱导植物抵抗
真菌、细菌和病毒的侵染，而且还能诱导植物对臭
氧、紫外辐射、低温、热激、干旱、盐害、金属离子等
非生物胁迫产生一定的抗性［7］。虽然近几年来 SA
在抗逆性中研究比较多，但 SA 作为缓解植物 Al 胁
迫的研究却不多见。
有机酸分泌是植物缓解 Al 毒害的最重要机理
之一，最近的研究结果表明 H + -ATP 酶和 14-3-3 蛋
白对 Al毒害下植物有机酸的分泌起着重要的调控
作用。H + -ATP酶是普遍存在于各种生物中的功能
蛋白，它主要参与植物的离子运输、细胞信号转导、
细胞膜形态建成等，与植物的离子养分吸收运输、
逆境抗性等密切相关［8］。在 Al毒和缺磷胁迫下，植
物根尖质膜 H + -ATP酶活性与根系柠檬酸的分泌有
关。白羽扇豆在低磷条件下释放大量柠檬酸，与质
膜 H + -ATP酶通过增强 H +输出参与柠檬酸的释放
有关［9］。大豆的抗 Al 性与根尖柠檬酸的分泌和质
膜 H + -ATP酶的基因表达上调、翻译后调节及活性
提高有关［10］。14-3-3 蛋白是一类广泛存在于真核
生物中的调控蛋白。植物 14-3-3 蛋白通过参与代
谢及信号转导途径来调控植物的生长发育及胁迫
应答［11-12］。14-3-3 对 H + -ATP酶活性也具有正调控
效应;14-3-3 结合到磷酸化的 H + -ATP 酶 C 末端自
抑制域上，泵活性受到激发。低磷胁迫下白羽扇豆
根质膜 H + -ATP 酶和 14-3-3 蛋白的表达水平均表
现为增加的趋势［13］。Al 胁迫下蚕豆中二者的表达
水平及互作水平也表现增加的趋势，从而提高质膜
H + -ATP酶和 H +泵的活性，驱动柠檬酸通道蛋白对
柠檬酸的分泌作用［14］。SA作为一种植物缓解逆境
胁迫的重要信号分子，其对 14-3-3 和 H + -ATP 酶的
调控也有报道。马铃薯中 14-3-3 基因 16Ｒ 启动子
中有一种独特的元件对 SA 处理的响应很强烈［15］;
适宜浓度的 SA 预处理能减轻镉胁迫对葡萄质膜
ATP酶的损伤［16］。由于 SA 与 14-3-3 蛋白及质膜
H + -ATP酶均参与信号转导，响应胁迫应答，且两者
之间有一定的联系，因此，推测 SA 可能通过调控
14-3-3 和 H + -ATP 酶，诱导有机酸的分泌响应 Al
胁迫。
多效唑(PAC)是一种植物生长延缓剂，PAC 作
为 SA生物合成抑制剂，其主要抑制 SA 生物合成过
程中苯甲酸羟化酶的活性［17］。本文从 SA 和 PAC
对 Al胁迫下黑大豆的相对根伸长率、MDA 和 H2O2
含量、根系分泌物柠檬酸含量、14-3-3 蛋白与质膜
H + -ATP酶的基因表达及蛋白互作的影响进行研
究，旨在探讨外源施加 SA 能否增强黑大豆对 Al 的
抗性，为进一步研究 SA 在参与 Al 胁迫应答调控中
的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料培养与处理
以 Al敏感型黑大豆(SB)为试验材料，SB 是云
南本地栽培品种，其种子由本实验室培养并保存。
用常温去离子水清洗健康饱满的种子后，将种子平
铺于垫有湿润滤纸的培养皿内，在黑暗培养箱中恒
温(25℃)催芽。待种子发芽后，挑选发芽一致的种
子播于有网眼的泡沫板上，置于温室内(光照时间
为 12 h·d －1，光照强度为 1200 !mol·m －2·s － 1，昼 /夜
温度为 30℃ /25℃)盛有 Hoagland 营养液［18］的黑色
塑料盆中培养，使用人工养鱼通气装置作为通气设
施，2 d更换 1 次营养液。
幼苗生长 3 d后，将大小一致的 SB 幼苗用 0． 5
mmol·L －1 CaCl2溶液(pH4． 5)预处理 12 h。处理前
用记号笔在幼苗根基处轻轻作一标记，将标记好的
幼苗置于含有 AlCl3 50 !mol·L
－1和 SA(10，20，40，
60 !mol·L －1)或 PAC 100 !mol·L －1的营养液(0． 5
mmol·L －1 CaCl2，pH4． 5)中，以营养液 (0． 5
mmol·L －1 CaCl2，pH4． 5)处理为对照，处理 24 h 后，
用于测定根的伸长量。
幼苗水培 14 d后，将大小一致的 SB幼苗用 0． 5
mmol·L －1 CaCl2溶液(pH4． 5)预处理 12 h。将预处
理后的 SB幼苗置于含有 AlCl3 50 !mol·L
－1和 SA 20
!mol·L －1 或 PAC 100 !mol·L －1 的营养液(0． 5
mmol·L －1 CaCl2，pH4． 5)中，以 营 养 液 (0． 5
mmol·L －1 CaCl2，pH4． 5)处理为对照，处理 24 h 后，
取植物的根，用液氮速冻后 － 80℃保存，用于生理生
化指标测定、基因表达分析和免疫共沉淀分析。
1． 2 测定指标与方法
1． 2． 1 相对根伸长率 处理植物前用油性记号笔
在植物根基部位进行标记，小心用直尺测量处理前
后从根尖顶端到标记点的距离，处理前后测量值之
差为根伸长量，按照下式计算不同处理根的相对伸
长率:
相对伸长率(%)=处理组植物的根伸长量 /对
照组植物的根伸长量 × 100。
1． 2． 2 MDA 和 H2O2含量 取 － 80℃冷冻保存的
根尖样品测定 MDA和 H2O2含量。采用硫代巴比妥
法［19］测定 MDA 含量，采用二甲基酚橙法［20］测定
4 期 王闻闻等:外源 SA诱导黑大豆根系柠檬酸分泌缓解 Al毒害 509
H2O2含量。
1． 2． 3 根系分泌物柠檬酸收集和含量分析 取 5
只 50 mL的开口试管，每只试管中分别加入 40 mL
H2O，20 !mol·L
－1 SA，50 !mol·L －1 Al，20 !mol·L －1
SA + 50 !mol·L －1 Al，100 !mol·L －1 PAC + 50
!mol·L －1 Al和 10 株长势一致的 SB幼苗，处理 24 h
后，收集处理液低温浓缩干燥，得到根系分泌残留
物。将残留物用 1 mL 的去离子水溶解并过滤，用
HPLC法进行柠檬酸含量分析。HPLC 的条件:紫外
检测波长 214 nm，流动相为 0． 5%(NH4)H2PO4缓冲
液(H3PO4调节 pH至 2． 75)，流速 0． 8 mL·min
－1，柱
温 27℃，进样量 50 !L。以柠檬酸标准品为对照，用
峰面积进行定量。
1． 2． 4 基因表达分析 取 － 80℃冻存的根尖样品，
按照 Trozol试剂说明书上的方法提取根尖总 ＲNA。
按照 M-MLV Ｒeverse Transcriptase 试剂盒说明书上
的方法将总 ＲNA 反转录合成 cDNA。以 28S rＲNA
作为内参，合成的 cDNA 作为模板进行 ＲT-PCＲ 扩
增。在表 1 中列出了 PCＲ 反应中使用的引物序列
及其扩增产物的长度。
表 1 ＲT-PCＲ分析所用引物序列
Table 1 Primer sequences for PT-PCＲ analysis
基因(登陆号)
Gene(Accession No．)
正向引物 /反向引物(5→3)
Forward /Ｒeverse(5→3)
扩增产物长度
Product size /bp
GHA2(AF091303) CTTGGGATAATCTTTTGGAGAAC 250
CTCGGCACGTCTCTTAG
MATE(Gma． 8768． 1) AGTAAGCGTAGCCACAGAA 144
CTGAGATAGAGCCAAGGTC
SGF14a(HM004359) GCGTTACGAGGAGATGGTTG 286
GGATGGGATGAGGTTGGACT
SGF14b(AK285530) TTGAAGATGAAGGGCGATTA 337
CAGAAGTCCAAAGGGTGAGG
SGF14c(HM004361) GTGAGCGTGAAGAGGATAAA 471
AGAAGTCCACAGGGTGAGAT
SGF14d(AK285774 /U70536) TCGTCTACATCGCCAAACTC 217
GCATTCAACTCGTTCCCTTT
SGF14e(HM004360) TCCGTCTTGGACTTGCACTC 260
CTCAGGCTCAGAAGGTTTGG
SGF14f(HM004358) AGAGTCTAAGGGAAATGAGC 512
CACCTCCATCCTCTGGTAAAT
SGF14g(BT096871) CTACAAAGCCGCTCAGGACA 239
CAGAGGGTAAGGTTATCACGAAG
SGF14h(HM004357) GCCTCATTCCCTCCGCTTCC 433
TCCTGTTTCGGTGCTGCTTC
SGF14i(AK286671) CGAGGAACTTACCGTGGAGG 240
GAGGAAGCGGATGGAATGAG
SGF14j(AK285891) CCCTCGTGAAGCACTACAGA 401
GGATTCTTCTCCCAAGGTGT
SGF14k(AK286798) CTGACCGTGGAGGAGCGTAA 415
GAGCAAGACCCAGCCTGATAG
SGF14l(AK286414) CTGTCGGTAGGGTACAAGAA 567
AGAAGTCCACAGGGTGAGAT
SGF14m(AK286318) TGGAGGTTGAGGAGTTGACG 663
CGGCCTGGTTGTTGCTTAGAT
SGF14n(HM004356) GATGAAATGGTGGATGCC 457
GACCCAAACGAATAGGATGT
SGF14o(AK286943 /AK244317) AACGAGTTGAATGCGAAGCG 460
GGTTGTCCCTGAGAAGTTGC
SGF14p(AF228501) TGAACGCTATGATGAAATG 306
ACTGTGGACTCCGCAATA
28S rＲNA(L36615． 1) CCCAATCGGGCGGTAAAT 267
CGTCTCCACGAGCATATCAA
1． 2． 5 免疫共沉淀 按照 Chen 等［14］的提取方法，
取冻存的根尖样品提取质膜蛋白。为了检测与质
膜 H + -ATP酶结合的 14-3-3 蛋白，将 2 !g C 末端磷
酸化的质膜 H + -ATP 酶(VA2P)的兔抗加到 200 !g
质膜蛋白中，在 4℃下 40 r·min －1振荡 1 h 后，再加
入蛋白 A /G琼脂糖(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，
CA)20 !L在 4℃下 40 r·min －1振荡过夜，琼脂糖在
4℃下 1 000 g 离心 5 min 后沉淀，再用预冷的 10
510 大 豆 科 学 4 期
mmol·L －1 PBS缓冲液 1 mL洗 3 次，每次均在 4℃下
1 000 g离心 5 min 沉淀。最后加入电泳缓冲液 40
!L，加热煮沸后，用 20 !L 进行 SDS-PAGE，然后用
Bio-Ｒad半干式转膜仪将电泳得到的蛋白转到
PVDF膜上。然后用 5%的脱脂奶粉封闭 1 h 后，先
使用大豆 14-3-3 蛋白或 VA2P 的兔抗在 4℃下孵育
过夜，再使用羊抗兔的二抗室温孵育 1 h，最后用底
物化学发光 ELC显示法显影观察结果。
1． 3 数据统计分析
采用 Excel 2003 和 DPS 7． 05 软件进行统计分
析和图表绘制，用 LSD法检测统计显著性差异。
2 结果与分析
CK:0． 5 mmol·L-1 CaCl2;Al 50:50 mmol·L-1 CaCl3;Al 50 +
SA10:50 mmol·L-1 CaCl3 + 10 mmol·L-1 SA;Al 50 + SA20:50
mmol·L-1 CaCl3 + 20 mmol·L-1 SA;Al 50 + SA40:50 mmol·L-1
CaCl3 + 40 mmol·L-1 SA;Al 50 + SA60:50 mmol·L-1 CaCl3 + 60
mmol·L-1 SA;Al 50 + PAC100:50 mmol·L-1 AlCl3 + 100 mmol·L-1
PAC;处理间不同安母代表 0． 05 水平差异显著。下同。
Different small letters indicate significant difference at 0． 05 lev-
el． The same below．
图 1 胁迫下不同浓度 SA对 SB相对根伸长率的影响
Fig． 1 Effect of different concentration SA on
relative root growth in SB under Al stress
2． 1 外源 SA 对 Al 胁迫下 SB 相对根伸长率的
影响
Al对植物的毒害作用最典型的症状表现在对
根伸长的抑制作用，根的相对伸长率能够直接反应
植物受 Al毒害的程度［21］。如图 1 所示，与对照相
比，50 !mol·L －1Al 处理显著抑制 SB 的根伸长。在
Al处理条件下，加入外源 SA(10，20 !mol·L －1)逐渐
缓解 Al对 SB 根生长的抑制作用，但随 SA 浓度的
进一步增加(40，60 !mol·L －1)缓解作用并没有继续
增强，反而加重抑制作用;加入外源 PAC 也加重了
Al对根伸长的抑制作用。这表明 SA 对 Al 胁迫下
根伸长抑制的影响具有浓度依赖。与单独 Al 处理
相比，外源添加 20 !mol·L －1 SA时对 Al抑制根伸长
的缓解效果最明显，所以本试验中选择 20 !mol·L －1
SA作为其他试验的处理浓度。
2． 2 外源 SA对 Al胁迫下 SB根尖 MDA和 H2O2
含量的影响
活性氧迸发是 Al 胁迫诱导产生的早期反应之
一，积累的活性氧会对植物细胞造成严重氧化伤
害。质膜过氧化的主要产物是 MDA，其含量高低体
现质膜过氧化的损伤程度。如图 2 所示，单独 Al处
理使 SB根中 MDA 含量显著增高，添加外源 SA 使
MDA含量降低，缓解了质膜过氧化损伤;但添加外
源 PAC 与单独 Al 处理相同，造成了 MDA 含量增
高，对质膜造成伤害。植物体内最主要的活性氧是
H2O2，其含量变化体现植物体内遭受氧化胁迫程
度。如图 3 所示，H2O2含量也有与 MDA 含量相似
的变化，外源 SA使 Al 胁迫下 H2O2含量降低，氧化
胁迫程度明显减轻。
图 2 外源 SA对 Al胁迫下 SB根中MDA含量的影响
Fig． 2 Effect of exogenous SA on MDA content
in SB root under Al stress
图 3 外源 SA对 Al胁迫下 SB根中 H2O2
含量的影响
Fig． 3 Effect of exogenous SA on H2O2
content in SB root under Al stress
4 期 王闻闻等:外源 SA诱导黑大豆根系柠檬酸分泌缓解 Al毒害 511
2． 3 外源 SA 对 Al 胁迫下 SB 根系柠檬酸分泌的
影响
如图 4 所示，未经 Al处理和单独 SA处理后，在
根系分泌物中并没有检测到柠檬酸，并不能诱导 SB
根柠檬酸的分泌。用 50 μmol·L －1 Al 胁迫处理后，
根系分泌物种柠檬酸的含量为 0． 37 μg·g －1 FW，而
在 50 μmol·L －1 Al和 20 μmol·L －1 SA共同处理 SB
后，根系分泌物中柠檬酸的含量达到了 0． 78 μg·g －1
FW，约是单独 Al处理的 2 倍。用 PAC和 Al共同处
理 SB后，柠檬酸的含量显著低于单独 Al处理。
图 4 外源 SA对 Al胁迫下 SB根系分泌物
柠檬酸含量的影响
Fig． 4 Effect of exogenous SA on the citric acid
content in SB root exudates under Al stress
2． 4 外源 SA对 Al胁迫下 SB根中 14-3-3 蛋白、质
膜 H + -ATP酶和柠檬酸通道蛋白(MATE)基
因表达的影响
大豆基因组中有 18 个 14-3-3 基因，它们分别
位于 12 个不同的染色体上。其中，只有 16 个
(SGF14a ～ SGF14p)有转录产物［22］。因此，本试验
中扩增这 16 个 14-3-3 基因，结果如图 5 所示。对照
组中，只有基因 14-3-3p和 14-3-3n 没有检测到基因
表达，其他基因均检测到不同程度的表达;但是，基
因 14-3-3p和 14-3-3n在其他实验组中可以检测到。
这可能是 14-3-3p和 14-3-3n 的组成表达较弱，因此
在对照组中没有检测到。除了 14-3-3c、14-3-3e 和
14-3-3h基因外，Al胁迫下 SB 根中 14-3-3 基因的表
达水平明显高于未经 Al 处理的对照组;除了 14-3-
3b、14-3-3c、14-3-3g和 14-3-3h基因外，单独 Al处理
下 SB根中 14-3-3 基因的表达水平明显低于加入外
源 SA的植株;除了 14-3-3o 和 14-3-3p 基因外，单独
Al处理下 SB根中 14-3-3 基因的表达水平均高于加
入外源 PAC的植株。同时，用 ＲT-PCＲ 分析了不同
处理下 SB根中质膜 H + -ATP 酶和柠檬酸通道蛋白
基因(GHA2 和 MATE)的表达情况，结果表明:单独
Al处理下 SB根中 GHA2 和 MATE 基因的表达水平
高于未经 Al 处理的对照组和加入外源 PAC 的植
株，但低于加入外源 SA 的植株。基因表达的结果
表明:Al胁迫能诱导 SB根中 14-3-3 蛋白、质膜 H + -
ATP酶和柠檬酸通道蛋白基因的表达;Al 胁迫下加
入外源 SA能进一步诱导这些基因的表达，但是加
入外源 PAC对 Al胁迫的诱导有不同程度的抑制。
14-3-3a ～ 14-3-3p 表示大豆中的 14-3-3 基因(SGF14a ～
SGF14p)。
14-3-3a - 14-3-3p are soybean 14-3-3 genes (SGF14a -
SGF14p)．
图 5 外源 SA对 Al胁迫下 SB根中柠檬酸
通道蛋白(MATE)、14-3-3 蛋白和质膜
H + -ATP酶基因表达的影响
Fig． 5 Effect of exogenous SA on the gene
expression of multidrug and toxic compound
extrusion transporter(MATE)，14-3-3 protein
and plasma membrane H + -ATPase
in SB root under Al stress
2． 5 外源 SA 对 Al 胁迫下 SB 根中质膜 H + -ATP
酶蛋白磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白互作的
影响
免疫共沉淀分析结果如图 6 所示，SB经单独 Al
处理后，根中质膜 H + -ATP 酶的磷酸化水平高于未
经 Al处理的对照组植株;Al 处理下，加入外源 SA
使 SB根中质膜 H + -ATP 酶的磷酸化水平高于单独
Al处理植株，而加入外源 PAC 后，质膜 H + -ATP 酶
的磷酸化水平则低于单独 Al 处理。与磷酸化质膜
H + -ATP酶结合的 14-3-3 蛋白表现出相似的趋势，
外源 SA促进了 Al 胁迫下 14-3-3 蛋白与磷酸化质
膜 H + -ATP酶的结合。外源 PAC 抑制了 Al 胁迫下
14-3-3 蛋白与磷酸化质膜 H + -ATP酶的结合。
512 大 豆 科 学 4 期
图 6 外源 SA对 Al胁迫下 SB根中质膜 H + -ATP酶蛋白
磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白互作的影响
Fig． 6 Effect of exogenous SA on the levels of
protein phosphorylation for plasma membrane
H + -ATPase and its binding capacity with
14-3-3 protein in SB root under Al stress
3 讨 论
SA作为新型植物激素和信号物质，广泛参与植
物的生物和非生物胁迫响应。有研究发现，Al 胁迫
刺激大豆［17］、决明子［23］内源 SA 含量改变。但内源
SA在缓解 Al胁迫中的具体作用尚不清楚。本试验
结果表明:外源低浓度 SA(10，20 !mol·L －1)可以缓
解 Al对 SB根伸长的抑制作用，而高浓度 SA(40，60
!mol·L －1)和 PAC 则进一步加重了 Al 胁迫引起的
根伸长抑制，研究发现 20 !mol·L －1 SA 对缓解 SB
的 Al毒害效果最明显。
在 Al胁迫下植物体内活性氧产生并累积从而
破坏植物组织结构与功能，造成氧化损伤，甚至导
致植物死亡。近几年的研究表明，SA 能缓解 Al 胁
迫对决明子［24］、栝楼［25］等植物造成的氧化胁迫伤
害。本试验的结果也表明，SB 植株在 Al胁迫下，外
源 SA 能改善 Al 对质膜的伤害，表现为 SB 根尖
MDA和 H2O2含量也下降。但对 SA缓解 Al胁迫造
成的氧化胁迫的具体机制，可能是通过激活抗氧化
防御系统来缓解 Al 毒害，也可能是通过其他机制，
有待进一步深入研究。
已有大量研究发现，植物在 Al胁迫下可通过根
系分泌有机酸来抵御 Al 毒害，且植物抗 Al 性同有
机酸分泌之间为显著正相关的关系［26］。在 Al 胁迫
下，外源 SA 能促进刺激大豆［17］、决明子［23］分泌更
多的柠檬酸，增加对 Al的耐性。在本试验中，SB 在
Al胁迫下分泌柠檬酸，加入外源 SA 柠檬酸的分泌
量约是单独 Al处理的 2 陪。最近有研究显示，与植
物耐 Al能力相关的柠檬酸通道蛋白归属 MATE 家
族;MATE是一类广泛存在于微生物、植物及哺乳动
物细胞中的蛋白家族，是多药及毒性复合物的排出
转运蛋白。有研究发现，在盐胁迫条件下，外源 SA
能显著降低小麦根系 Na +，提高根系 K +的向上运
输选择性，显著提高植物体的抗盐性［27］;减少菊花
根系 Na +含量并增加根系 K +、Ca2 +、Mg2 +的含量，
缓解盐胁迫对菊花植株的伤害［28］;外源 SA 可能通
过对胁迫下物质的运输进行一定的调控，缓解胁迫
对植物的伤害。从基因表达分析的结果，可以看出
Al胁迫诱导 MATE 基因的表达，外源 SA 可能通过
调控 MATE的表达刺激 SB 分泌柠檬酸，增加对 Al
的耐性。
植物有大量的 14-3-3 基因家族及多种的 14-3-3
亚型，它们对某些靶蛋白有不同的亲和力。这些
14-3-3 亚型表现出很高的细胞和组织特异性，包括
表达特异性和亚细胞定位特异性［29］。最近的研究
发现，Al 胁迫下蚕豆通过增加质膜 H + -ATP 酶和
14-3-3b基因的表达水平、质膜 H + -ATP酶的磷酸化
水平及其与 14-3-3 的结合，从而提高质膜 H + -ATP
酶和 H +泵的活性，驱动柠檬酸通道蛋白对柠檬酸
的分泌作用［14］。在本研究中，Al 胁迫下 SB 质膜
H + -ATP酶和 14-3-3 基因的表达水平、质膜 H + -
ATP酶的磷酸化水平及其与 14-3-3 的结合能力提
高;外源 SA 处理进一步增加了质膜 H + -ATP 酶和
14-3-3 基因的表达水平、质膜 H + -ATP 酶的磷酸化
水平及其与 14-3-3 的结合能力。有文献报道，外源
SA对质膜 ATP酶活性有一定的影响，如盐胁迫下，
外源 SA可以缓解盐胁迫引起的质膜 ATP 酶、液泡
膜 ATP酶和 PPase 活性降低，提高菊花根系对 K +、
Ca2 +、Mg2 +的吸收，减少对 Na +的吸收，从而缓解盐
胁迫对菊花植株的伤害程度［28］。在本研究中，外源
SA可能通过调控 14-3-3 和质膜 H + -ATP 酶的基因
和蛋白水平，从而提高质膜 H + -ATP 酶和 H +泵的
活性，驱动柠檬酸通道蛋白对柠檬酸的分泌作用，
最终缓解 Al胁迫对 SB的毒害。
有机酸分泌是目前为止发现的植物缓解 Al 毒
害最重要机制。综上所述，Al胁迫下，外源 SA增加
SB根系柠檬酸的分泌，增加对 Al的耐性。一方面，
外源 SA可能通过诱导 MATE 的基因表达，增加柠
檬酸分泌;另一方面，外源 SA 可能通过诱导 14-3-3
蛋白和 H + -ATP酶的基因表达，提高 H + -ATP 酶磷
酸化水平及其与 14-3-3 蛋白的结合能力，增加 H +
泵活性，使根系柠檬酸分泌量增加。但是，是 SA 诱
导 Al胁迫下 MATE的表达增加，还是 14-3-3 蛋白与
H + -ATP酶互作增强对柠檬酸分泌起主导作用，还
不清楚，有待进一步研究。
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