全 文 ：江苏省小麦苗枯病菌的遗传多样性初析
尹燕妮 , 张晓梅 , 葛芸英 , 郭坚华*
(南京农业大学农业部病虫监测与治理重点开放实验室 , 江苏 南京 210095)
摘要:采用 ERIC-PCR、 BOX-PCR和 ITS技术 , 对江苏省 6个市的 24个小麦苗枯病菌 (C lav ibacter fangii) 进行遗传多样
性分析 , 并与其他 10种病原细菌进行比较。结果表明 , 在相似率达 60%时 , ITS将 24个小麦苗枯病菌分成了 5簇。以
相似性 60%为界 , ERIC-PCR将 34个参试菌株分为 14簇 , 而 BOX-PCR只得到 9簇 , 暗示这两种短重复序列在基因组中
的分布不同;将两者电泳图谱结合 , 得到介于上述两者间的结果 , 所有菌株被分成 12簇 , 24个小麦苗枯病菌分布在 5
簇中。 3种分析方法相互验证 , 均说明江苏省小麦苗枯病菌基因组存在显著多样性。 ERIC-PCR和 BOX-PCR聚类证明了
小麦苗枯病菌与棒形杆菌属 (Clavibacter) 亲缘关系较近 , 与其他属细菌亲缘关系较远。 ERIC-PCR和 BOX-PCR扩增基
因组 DNA指纹比 ITS图谱具有更强的多样性。
关键词:小麦苗枯病菌;遗传多样性; rep-PCR; ITS
中图分类号:S435.121.4 +9　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000 2030 (2006) 01 0044 05
Genetic diversity ofwheat pathogenC lav ibac ter fang ii
from J iangsu Prov ince, China
Y IN Yan-ni, ZHANG X iao-mei, GE Yun-y ing, GUO Jian-hua*
(Key Laboratory ofM onito ring andM anagem ent of P lan tD iseases and Pe sts, M inistry o f Agriculture,
Nan jing Agricultura l Un ive rsity, Nanjing 210095, China)
Abstract:Tw en ty-fourClavibacter fangii stra ins co llected from six cities of Jiang su P rovince and ten o the r phy topa thogen ic bacteria
w ere ana lysed acco rding to geno typic typ ingm e thods inc luding BOX-PCR, ERIC-PCR, and ITS pro filing (PCR ribo typing). The
analysis o f ITS gene gave 5 c luste rs o fCl. fangii a t the leve l o f 60% sim ilarity a fter dendrog ram analysis. ER IC-PCR revea led that
the re we re 14 c luste rs in 34 stra ins, w hile w ith BOX-PCR m e thod on ly n ine (max im um sim ila rity approx 60%). A t the level o f
60% sim ila rity, the com bina tion of ER IC-PCR and BOX-PCR p rofiles gave 12 clusters o f 34 strains, 24Cl. fangii strains am ong
wh ich w ere div ided into 5 clusters. In summ ary, the results o f ER IC-PCR and BOX-PCR dend rogram analysis sugge st thatCl. fan-
g ii is on ly genetica lly c lo se re lated to genus Clav ibacter, and tha t ER IC-PCR and BOX-PCR are h igher discrim inato ry techniques
than ITS pro filing for de tec ting genetic va riation am ong stra ins and fo r identifica tion a s we ll as classification studies.
Key words:Clav ibacter fangii; gene tic diversity; rep-PCR; ITS
细菌基因组中存在 10种以上可用于指纹分析的短重复序列 , 其中应用较多的是基因外重复回文因
子 (repetitive ex tragen ic pa lindrom ic, REP)、肠杆菌基因间重复一致序列 (enterobac te ria l repetitive in te r-
genic consensus, ERIC)和 BOX插入因子等 [ 1] 。基于这些因子的 rep-PCR已广泛应用于病原菌的不同菌
株的鉴定及基因组多态性评价 [ 2] 。 Louw s等[ 3]对密执安棒形杆菌 (C lavibacterm ich iganensis)的 5个亚种
进行了 rep-PCR分析 , 但未见到对方氏棒形杆菌 (Clavibacter fangii, 下文简称 C lf)的 rep-PCR研究 。
因 16S ～ 23S rDNA间隔区 ITS ( in te rgenic transcribed space)没有特定功能 , 进化速率比 16S rDNA
大 10倍以上 , 且在数目 、 长度和组成上存在相当的差异 , 故在细菌鉴定 、 分类及基因型多样性方面倍
受关注 [ 4 - 5] 。 ITS图谱分析法在沙门氏菌 (Sa lmonella)、 李斯特氏菌 (Listeria)等医学细菌的基因多样
性和病害流行方面应用较多[ 6] 。
小麦苗枯病是 1987年刘庆都等 [ 7]在江苏北部发现并鉴定的一种新病害。此病害早春发生 , 主要症
　　收稿日期:2005 05 09
　　基金项目:国家自然科学基金项目 (39970481);国家高技术研究发展计划项目 (2003AA249020)
　　作者简介:尹燕妮 (1980 ), 博士研究生。*通讯作者:郭坚华 (1966 ), 教授 , 博导 , 从事细菌分子检测和生物防治研究 ,
E-m ail:jhguo@ njau. edu. cn。
　南京农业大学学报　2006, 29 (1):44 ～ 48
Journa l of Nanjing Agricu ltural University
状表现为幼苗心叶受害 , 初期新叶水渍状 , 上部稍发黄 , 继之整个新叶变黄 , 最后新叶枯死 , 引起死苗
或不能抽穗 , 田间小麦发病率可达 10%左右。基于传统生理生化试验和 16S rDNA序列分析 , 郭坚华
等 [ 8]确认其病原菌为 Cl. fang ii。葛芸英等[ 9]对通用引物扩增的 ITS序列分析 , 设计出 1对特异性检测
引物。国内外尚未见对此病菌遗传多样性的相关报道。本研究拟通过 ER IC-PCR、 BOX-PCR和 ITS图谱
分析 , 初析 24个小麦苗枯病菌的遗传多样性 , 同时比较 3种分析方法在多样性研究方面的差异 。
1　材料与方法
1.1　供试菌株及培养条件
供试小麦苗枯病菌和其相关细菌菌株及来源见表 1。所有菌株均在 D 2培养基[ 10]上 28 ℃培养 24 ～
48 h。
表 1　供试菌株
Tab le 1　Bac te ria l stra ins tested
编号 C ode 供试菌株 S trains tested　　　　　　　　　　 来源 Origin 菌株号 No. of strain
1 方氏棒形杆菌 Claviba cter fang ii 江苏连云港 Lianyungang, Jiangsu C lf1
2 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏连云港 Lianyungang, Jiangsu C lf2
3 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏连云港 Lianyungang, Jiangsu C lf3
4 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏连云港 Lianyungang, Jiangsu C lf4
5 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏徐州 Xu zhou, Jiangsu C lf5
6 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏徐州 Xu zhou, Jiangsu C lf6
7 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏徐州 Xu zhou, Jiangsu C lf7
8 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏徐州 Xu zhou, Jiangsu C lf8
9 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏淮安 H uai′an, Jiangsu C lf9
10 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏淮安 H uai′an, Jiangsu C lf10
11 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏淮安 H uai′an, Jiangsu C lf11
12 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏淮安 H uai′an, Jiangsu C lf12
13 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏宿迁 Suq ian, Jiangsu C lf13
14 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏宿迁 Suq ian, Jiangsu C lf14
15 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏宿迁 Suq ian, Jiangsu C lf15
16 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏宿迁 Suq ian, Jiangsu C lf16
17 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏盐城 Yancheng, J iangsu C lf17
18 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏盐城 Yancheng, J iangsu C lf18
19 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏盐城 Yancheng, J iangsu C lf19
20 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏盐城 Yancheng, J iangsu C lf20
21 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏扬州 Yangzhou, Jiangsu C lf21
22 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏扬州 Yangzhou, Jiangsu C lf22
23 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏扬州 Yangzhou, Jiangsu C lf23
24 方氏棒形杆菌 Cl. fang ii 江苏扬州 Yangzhou, Jiangsu C lf24
25 密执安棒形杆菌密执安亚种 C l.m ich iganensis sub sp.m ich iganensis 新西兰菌种中心 ICMP 2550
26 密执安棒形杆菌花叶亚种 C l.m ich iganen sis sub sp. tesselariu s 新西兰菌种中心 ICMP 7221
27 密执安棒形杆菌内布拉斯亚种 C l.m ich iganensis sub sp.n ebra skensis 新西兰菌种中心 ICMP 3298
28 拉氏拉氏杆菌 Ra thayibacter ra thayi 新西兰菌种中心 ICMP 2574
29
萎蔫短小杆菌萎蔫致病变种
Curtobacterium flaccum faciens pv. fla ccum faciens 新西兰菌种中心 ICMP 2584
30 菊欧文氏菌 Erwin ia chrysan them i 江苏 Jiangsu Ch10
31 美国冬青节杆菌 Arthrobacter i licis 新西兰菌种中心 ICMP 2607
32 带化红球菌 Rhodococcus fascian s 新西兰菌种中心 ICMP 2604
33 巨大芽孢杆菌 B acillu sm egaterium 江苏 Jiangsu G a5
34 根癌土壤杆菌 Ag robacterium tum efaciens 江苏 Jiangsu A6
　　Note: ICM P: In ternational Co llect ion of M icro-organ ism from P lant (New Zealand). O ther bacteria w ere isolated and iden tified in ou r
laboratory.
1.2　DNA提取和纯化
利用 CTAB法提取细菌组 DNA[ 11] 。用凝胶成像系统 (B io-RAD)测定 DNA含量 。
45 第 1期　　　　　　　　　　　　尹燕妮等:江苏省小麦苗枯病菌的遗传多样性初析
1.3　引物序列及合成
ITS-PCR[ 9]和 rep-PCR所采用的引物如下:
ITS:　L1, 　　　5′-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3′;
L2, 5′-GTGCCAAGGCATCCACC-3′
BOX: BOXA IR, 5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′
ER IC:ERIC1R, 5′-TGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′;
ERIC2, 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′
以上引物由宝生物工程 (大连)有限公司合成 。
1.4　PCR扩增
所有的 PCR扩增反应均在 M JResearch PTC 100 Pe ltier Therma lCycle r基因扩增仪上进行。 ITS扩增
反应采用 20 μL体系 , 包括:10×PCR Buffer (10mmol L - 1 Tris-HC l, pH 8.3;50 mmo l L -1 KC l) 2
μL, 25mmo l L -1 MgC l2 1.2 μL, 0.2 mmo l L- 1 dNTP, 每个引物 20 pmo l, 1 U Taq酶 , 20 ng模板
DNA。循环程序为:95℃ 5 m in;94 ℃ 30 s, 40 ℃ 1m in, 72℃ 1 m in , 35个循环;72 ℃ 10m in。
rep-PCR扩增反应采用 25 μL体系 , 包括:10 ×PCR Buffe r (10 mmo l L -1 Tris-HC l, pH 8.3;50
mmo l L -1 KC l) 5 μL, 25 mmo l L -1 MgC l2 2 μL, 0.2 mmol L - 1 dNTP, 每个引物 50 pmo l, 2 U Taq
酶 , 50 ng模板 DNA。循环程序为:95 ℃ 7 m in;94 ℃ 1 m in, 37 ℃ 1 m in, 65 ℃ 8 m in, 35个循环;
65 ℃ 16 m in。
1.5　扩增产物的检测和分析
取 6 ～ 8 μL扩增产物于 1.5%琼脂糖凝胶上电泳 , 以 5V cm - 1电泳 5 ～ 6 h后 , 用溴化乙锭染色 、
脱色 , 在 B io-RAD系统下观察并进行图像采集和保存 。
聚类分析:将 rep-PCR扩增产物指纹谱带的有无 , 分别转换为 2个数码 , 即有带为 “1”, 无带为
“ 0”, 制成 Exce l文档用于聚类分析;使用 DPS计算机软件的平均连锁法 (UPGMA)绘制聚类树状图 ,
并进行菌株的分簇分析。
根据以下公式计算重复率 (IR)和分辨率 (IC ), 并对 3种方法进行比较 [ 12] 。
IR =(∑ m i M/ ) ×100%　(m i:一个菌株的引物扩增带数;M:所有扩增条带数)
IC =(∑ n i N/ ) ×100% (∑ ni:扩增谱型的总数;N:菌株总数)
2　结果与分析
2.1　 ITS指纹分析结果
ITS方法产生的多态性带较少 , 10条片段集中在 200 bp到 1.5 kb间 (图 1)。以 60%相似率为界 ,
24个 C lf菌株被分为 5簇 , 最大 1簇共包括了 8个菌株 , 其中扬州市的 3个菌株 C lf21、 C lf22和 C lf23的
相似率达 100%。另 4簇中分别包括 6、 4、 4和 2个菌株 。由于得到的多态性扩增条带太少 , 未能够得
到小麦苗枯病菌与棒形杆菌属亲缘关系较近的结果 。
图 1　24个小麦苗枯病菌菌株与 10个相关菌株的 ITS指纹图谱
F ig. 1　 ITS pro filing pa tterns o f tested sta ins
(1～ 34:代表的菌株见表 1。 1 34:Codes of strain s are the sam e as in Tab le 1. The sam e as follow s. )
2.2　 rep-PCR的指纹分析结果
用 ERIC和 BOX引物对所有菌株扩增 , 分别得到 20和 18条多态性片段 , 大小为 100 bp到 4 kb (图
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图 2　24个小麦苗枯病菌菌株与 10个相关菌株的 ER IC-PCR指纹图谱
F ig. 2　DNA finge rp rin ts of tested stra ins gene ra ted by ER IC-PCR
图 3　24个小麦苗枯病菌菌株与 10个相关菌株的 BOX-PCR指纹图谱
F ig. 3　DNA finge rp rin ts o f tested stra ins genera ted by BOX-PCR
2, 3)。以 60%的相似率为界 , ERIC-PCR和 BOX-
PCR分别得到 14和 9簇 , 暗示 ERIC在基因组中
的分布比 BOX更为多样。为更准确反映菌株间基
因组存在的差异 , 将两者电泳指纹图谱进行综合分
析 , 所有菌株被分成了 12簇 (图 4)。 24个 C lf菌
株分布在 5簇中 , 且它们的相似率小于 40%, 可
见江苏省小麦苗枯病菌基因组多样性显著。与 ITS
指纹分析结果相比 , 此方法提供的信息量较大 。
最大 1簇包含来源于 6个市的 C lf1、 C lf2、
C lf4、 C lf5、 C lf6、 C lf7、 C lf8、 C lf9、 C lf10、 C lf11、
C lf12、 C lf13、 C lf14、 C lf15、 C lf16、 C lf18、 C lf19
和 C lf21, 共 18 个菌 株 。 C lf3、 C lf17、 C lf20、
C lf22、 C lf23和 C lf24与其他 C lf菌株间差异较大 ,
来源于 3个市 , 所以未能发现菌株间基因组的多样
性分布与地理来源之间的必然联系。来源于扬州市
的 4个菌株分布在 3簇中 , 说明该地区病菌基因组
间存在显著的多样性 。
聚类结果表明 , 小麦苗枯病菌与其他棒形杆菌
属菌株在约 30%相似率上相聚 , 亲缘关系较近 ,
而与拉氏杆菌 (Rathay ibacter)、 短小杆菌 (Curto-
bacterium )、 欧文氏菌 (Erw in ia)、 节杆菌 (Ar-
throbacter)、 红球 菌 (Rhodococcus ) 、芽 孢 杆菌
图 4　24个小麦苗枯病菌菌株与 10个相关菌株的 ER IC-
PCR、 BOX-PCR指纹图谱的树状聚类分析
F ig. 4　 C luste r ana lysis o f tested stra ins based on DNA
fingerp r in ts da ta gene ra ted us ing ER IC-PCR and
BOX-PCR prmi e rs
47 第 1期　　　　　　　　　　　　尹燕妮等:江苏省小麦苗枯病菌的遗传多样性初析
(Bacillus)和根癌杆菌 (Agrobacterium ) 7个属的
亲缘关系较远。
2.3　3种方法的比较
由表 2可以看出 , 3种分析方法的重复率都比
较高且相近 , 但分辨率的差异比较大 , ER IC-PCR
的区分率最高 (97.40%), ITS分析法分辨率最低
(35.78%), BOX-PCR介于两者之间 (85.23%)。
3　结论和讨论
表 2　3种方法分析小麦苗枯病菌多样性的重复率和分辨率
Tab le 2　 Reproduc ib ility ( IR ) and d isc rmi ina tory index
(IC) o f ITS pro filing and ER IC-PCR and BOX-
PCR forC l. fang ii
分析方法
Typ ing m ethod
谱型数
Number of types
重复率 /%
I
R
分辨率 /%
I
C
ERIC-PCR 28 92. 68 97. 40
BOX-PCR 20 94. 11 85. 23
ITS profi ling 9 99. 64 35. 78
　　江苏省小麦苗枯病菌基因组差异较大。来源于不同市的菌株间亲缘关系差异很大 , 最低相似率为
30%, 最高为 90%。地理差异对此病菌的系统进化存在着作用 , 但未能得出基因组间差异与地理来源
间的必然联系。扬州市 4个菌株基因组间存在显著异质性 , 与该病害的起源有关 , 符合刘庆都等 [ 7]的报
道 。小麦苗枯病菌与棒形杆菌属的亲缘关系较近 , 进一步验证了郭坚华等[ 8]将其定义为棒形杆菌属下
一个新种的结论 。
rep-PCR技术能在种 、 致病变种 (生化型)、菌株水平上区分和鉴定植物病原细菌 , 也可用于测定
病原菌群体遗传多样性 , 从而有助于揭开病原菌的起源 、进化和系统发育关系 , 为病害的监测与防治提
供重要的信息资料和科学依据 。在 rep-PCR分析中 , ERIC-PCR和 BOX-PCR分析结果存在差异 , 且
ER IC-PCR比 BOX-PCR具有更高的分辨率 , 这与 Judd等[ 13]研究结论相一致 。 de B ruijn[ 14]研究 Rhizobi-
um meliloti的遗传多样性时也证明 ERIC-PCR在多样性研究方面更具优势。与 rep-PCR相比 , ITS分析对
不同菌株的分辨率较低[ 12] , 在多样性研究中常作为其他方法的补充 , 但此方法在病原菌鉴定方面应用
很广。
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责任编辑:夏爱红
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