全 文 ：第 1 0卷
1 9 8
植 物 生 理 学 报
A C T A P H Y T O P H Y S IO L O G I A S I N IC A
、 、 1. 1 0 , N o . 1
F e b
. ,
19 84
紫云英根瘤菌的吸氢与固氮的关系
汪 化 宋鸿遇
(中国科学院上海植物生 理研究所 )
提 要
用气相色谱和 2 , 3 , 5一氯化三苯基四氮哩 ( T T )C 还原测定 , 从 8 株紫云英 、 2 株大豆 , 1 株
弧豆根瘤菌中检出二株在自生条件下具吸氢能力的紫云英根瘤菌菌株 。 观察到氢是诱导氢酶
形成的必需条件 。 增加培养基中的碳底物浓度 , 菌株的吸氢活性受到抑制 。 乙炔和一氧化碳
对吸氢活性具有不同程度的抑制作用 。
从吸氢与不吸氢菌株的回接对比试验 , 似乎没有看到吸氢的菌株对寄主干物质积累有明
显的影响。 并发现自生条件下不吸氢的菌株所形成的根瘤具有吸氢的能力 。
研究依赖 A T P 的离体固氮酶放氢反应已有多年 ( B u le n 等 19 6 5 , K oc 五 等 1 96 7 ) 。
然而探讨根瘤菌在共生条件下放氢现象的普遍性及其对共生固氮效率的意义 , 是 70 年代
中期 cS h u b er t 和 E va sn ( 19 7 6) 提出来的 : 流经多种共生体根瘤系统内固氮酶的电子 ,
一般仅 4 0 ~ 60 %用于氮的固定 , 其余的都消耗在放氢上 。 豆科植物根瘤菌的共 生 固 氮
系统受光合产物供给所限制 ( H a dr y 等 1 97 6 ) , 而放氢过程显然是对光合产物的浪 费 ,
也是造成共生系统无效性 的原因之一 ( cS h u b er t 和 E va sn 19 76 , 19 7 7 ) , 这引起科学工
作者的注意 , 已成为固氮领域中一个活跃的课题 。 目前已发现有少数含有氢酶的根瘤菌
菌种 , 能将固氮酶释放的氢进行回收再利用 。 由于在氢的氧化过程中产生 A T P , 可 以支
持耗能的固氮酶反应 ( D i x o n 1 97 2 , E m e r i o h 等 19 7 9 , R u i z一 A r g u e s o 等 1 9 7 9 a ) , 从而
提高固氮 效 率 , 增 加 干 物 质 积 累 ( S o h u b e r t 等 1 9 7 5 , C a r t e r 等 1 97 5 , A lb r e “ h t 等
1 9 7 9 )
。
与上述意见不同 , G i b so n 等 ( 19 8 1) 认为具吸氢能力的大豆根瘤对植株干重的累积和
总氮含量的增加并无显著效益 , 流经固氮酶电子流的相对效率与共生固氮的有效 性 (总
氮或植物干重 )之间也无严格的相关性 。 为此我们选择国内广泛栽培的绿肥 作 物— 紫云英及其根瘤菌 , 观察氢的回收利用与共生 固氮效率间的关系 。
材 料 和 方 法
根翻菌种类和培养甚
根瘤菌种类见表 1 。 培养基是 M ia er 等人 ( 19 78) 用于研究大豆根瘤菌氢酶活性表达 的 吸 氢 培养
基 , 琼脂加 1 . 5% 。
T T C 还原洲定
在测定时 , 用无菌的生理盐水制备每个菌株的稀的细胞悬液 , 吸一小滴菌液到含有0 . 01 % ( w /v )
T T C 的吸氢培养基平板上 , 培养在29 0 , 并观察其还原 .
酶氮活性的洲定
19 8 3年 4月 1 日收到 。
植 物 生 理 学 报 10卷
1
. 自生条件下的测定 : 根瘤菌培养在 41 x 105 m m 的试管内。 每管含有 5 m l吸氢培养基 , 使成
1
.
5% 的琼脂斜面 。 从保存菌种的斜面培养基 (P a n kh ur st 19 7 ) 上接一环菌到吸氢培养基的斜面上 ,
然后在 29 oC 空气里培养一周后 , 用无菌的血清塞代替棉塞 , 并按管子的体积加入 5% 的纯氢 , 平衡 以
后 , 每管抽出 100刃气体样品并用气相色谱法分析 以侧定最初的氢浓度 。 继续培养在 29 0 的水浴 内 ,
每隔一定时间抽取 10 皿 气体并用国产的 10 型气相层析仪 . 具热导检测器 , 装有 4 m m x l m 的分 子
筛 S A 柱 , 氢为载气 , 以测定氢的消耗 。 未接种的斜面作对照 。
2
. 根痛吸氢的测定 : 从植株上取下的根瘤 , 经 24 或 4 8小时饥饿后 , 放在 8 m l血清瓶内 , 用橡
皮塞塞紧 , 按体积加入 5% 的纯氢 , 以后的培养和测定与自生条件下相同 。 用空瓶或无根瘤的根 作 对
照 。
续云英接种和栽培
紫云英种子表面灭菌 ( iV cn en t 19 70 ) 。 萌发后种在灭过菌的装有石英砂的瓶内。 2~ 3天后 , 用 培
养 4 8 小时的细菌悬液 (约 105 / m l) 接种 , 然后用灭菌的烧杯覆盖 。 植物培养在自然光照和自然温 度 的
温室内 。 视干湿程度用 J e sn en 的无氮培养液 (V icn en t 19 70) 浇灌 。 一定时期后收获 。 并作各项测定 。
固氮醉活性的洲定
按以前 (上海植物生理研究所固氮室 1 974 )改进法气相层析检测乙烯形成。
, 体蛋白的洲定
菌体经生理盐水洗涤二次 , 用 1 N N a 0 H 在沸水浴内煮 5~ 10 分钟 ,然后按 玩 w 叮 等 ( 19 51) 的方
法测定 。 牛血清蛋白为标准曲线样品。
结 果
一 、 几种根抽菌对 T T C 的还原和耗氮的测定
经测定的 8 株紫云英 、 2 株大豆 、 l 株豉豆根瘤菌中 (表 l ) , 只有二株紫云英根 瘤
菌 ( 8 9和 10 9) 能够利用外源氢 。 它们在吸氢培养基上分别吸收 6 60 . 9和 6 1 1 . 5 毫微克分
子的氢 /毫克蛋 白 /小时 。
从对 T T C 的还原来看 , 除 2 株大豆根瘤菌各需 5 、 8 天外 , 其余的都需 3天 。
表 1 几种根油菌对 T飞, C 的还原与吸氮的关系
T a b l e 1 R
e la t i o n b e t w e e n T
.
T
.
C
.
r e d u e t io n b y s e v e r a l s P e e ies of R h i z o b i u m a nd 玩一u P at k e ·
菌 株 菌落中心变红的时间 (天 )
S t r a i n
T i m e o f e h a n g in g e o l o n y c o l o u r
t o r 〔 d ( d a y s )
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( n 伽I H : /m g P r o et in / h )
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紫云英根瘤菌 R . as t r a g a l i
8 9
10 9
7 4
10 7
10 0
10 5
10 3
7 0
大豆根瘤菌 R万叻 on ic u m
6 6 0
1 5 35
20 6 9
虹豆根瘤菌 R . 。妙n
3 3 0
吸氢量是培养64 . 5小时的测定 。 数值为三个重复的平均 。
T h e s P e e iif e a e t i v i t y o f h y d r o g e n a s e w a s e a lc u la t e d a t 6 4
.
5 h
.
a ft e r in e u b a it o n
.
T h e d a at r e P o r tde
a r e t h e a v e r a g e o f t r i P l i e a t e a s s a ys
.
1期 汪 化等 :紫云英根瘤菌的吸氢与固氮的关系
二 、 菌株 8 9与4 7吸氮的时间过程的差异
为了进一步证实菌株 8 9是吸氢的 , 而菌株 74 是不吸氢的 。 在不同时间 , 从培养在
吸氢培养基加 5 % 氢的容器内抽取气体样品 , 以测定其耗氢量 。 从图 l 可见 , 8 9号菌随
着培养时间的延长 , 氢的消耗量越来越大 。 而 74 号菌始终不制氢 。
·汾厂紫云英根瘤菌菌株 7 4 ( R · a s t r a g a l iK 妞 ` X 1 15 10 15 2 0培养时 间 I n e u b a r j o n 之lm e ( h ) 5 l r a i n 74 )
赫135F科淤weh20 11HI阶旅乃us名ojd加已\。工ut之à扮ō念祠v招。越.身:国
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F ig
.
1
图 1 菌株 89 (H uP + )和菌株 7 4 (H叩一 )在自生条件下利用外源氢的时间过程
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e t i m
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u sr e s o f矶 u p t a k e in fr e e 一 l i v io g R · 口价只夕a五 s t r a i n 8 9 (H u +P ) a n d 7 4 (H u p一 )
非共生培养的紫云英根抽菌在限制碳底物条件下吸氮的一些特性
氮的影晌 在没有发现固氮酶活性的条件下 , 必须预先用氢处理氢酶活性表达
以前的培养物 。 从表 2 可见 , 无论 89 号或者 109 号菌 , 凡是预先培养在吸氢培养 基 加
5% 氢的容器 内 , 在培养 2 2 小时的测 定时都有氢酶活性 。 而没有用氢预先处理的培养物 ,
在相同时间则没有氢酶活性 。 加氢后随着培养时间的延长 , 则都有氢酶活性 。 可见 , 为
了诱导氢酶的合成 , 氢是必需的 。
表 2 不同培养条件对萦云英根油菌吸氮的影晌
T a b le Z E日乞e t o f d ife r e n t c u l t u er e o n d i t io n o n
珍斑鑫
菌 株 培 养 条 件
从 u p at k e of hR 伽 b苦. m as t左碧口il
一 一 一 一 一侧定时间及吸氢膺董—eT s t t ime a n d H : 一 u P t a ke a e t i v i t y( n m o I H : m/ 9 P r o et in / h )
S t r a i n C u l t u r e e o n d i t io n s
2 2 ( h ) 6 4
.
5 ( h )
在吸氢培养基上预 先培养1 天
P er in e u b a t io n 1 1 d a y s o n H
: 一 u P t a耽
m e d i u m
6 6 0
.
9
在吸氢培养基 + 5万氢内预先培养 8天
P er in
e u b a t io n 8 d a y s on H
: 一 u P t a ke欣 d i u m + 5多H :
16 4 9
.
5 7 7 1
.
8
*
在吸氢培养基上预先培养 1 天
P此 i n e u b a t io n 1 1 d a y s o n H : 一 u tP a k e
m e d i u r n
在吸氢培养基 + 5多氢内预先培养 8 天
P r e i n e ub
a t io n 8 d a y s o n H : 一 u P t a ke
0
3 0 4
.
4
5 1 1
.
5
70 3
.
9
me d i
u m + 5拓 H ,
数值是三个重复的平均数 。
* 因为测定时容器内的氢早已吸完 , 事实上应比这个数大 。
T h e d a t a r e P o r t e d a r e th e a v e r a g e o f t r i p lie a t e a s s a ys
·
* I n fa
c t , ht e d a t u m r e po
r t e d s h o u ld b e m
o r e la r ge b
e c a us e a t it m e o f d e t e r m in i n g
,
h y d r o g e n in th e
e
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t a i n er h a d al r e a dy b
e e n e o n su m e d uP
·
2
. 培养基中碳底物浓度对吸氮的影晌 培养基中的碳源提 高 10 倍 (图 2 ) , 菌株
89 ( H
u P
+
)一直培养到 2 1 7 . 5 小时仍表现不吸氢 。 而在二种不同浓度碳底物培养基上 的
植 物 生 理 学 报 10卷
.卜`lwe.e
L
250
} 吸氢培养基的 正常碳源
}
N o r m a , c a 『b o n s u b s , r a , e s
15
{
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10卜 /
图 2
F ig
.
2
菌株 的 (H u p 斗 )在不同浓度碳
底物培养基上的吸氢
姚一 u P t a k e o f fr e e 一 l iv i n g R . as tagr a li
(
s t r a in 8 9 )
e u l t u r e d in t h e e a r b o n
s u b s t r a t e s o f d i fe
r e n t e o n c e n t r a t i o n
万忿之1。.昌目dnl月工
ǎ枷\斗佘积狠ó塑戚胆咨
碳翻荔10培 T e n r im e s rh e h ig h
产。q,戈P￡n目。、工卫三于
o f n o r m a l 口 r b o n S u b s : r a t e s
50 100
一工 洲 ~ - . - 一 J一 一刀七- - 一」一一1 50 20() 25 0
培养时间 I n e u ab t i o n t im e (h )
菌体数量几乎是一样的 。
3
. 乙炔和一叙化碳对吸氮的影晌 表 3 表明 , 40 % 的乙炔抑制了 57 . 4% 的氢 酶
活性 。 而 5%和 10 %的一氧化碳分别抑制了 2 3 . 8 和 68 . 8%的氢酶活性 。
衰 3 乙块和一叙化碳对自生策云英根瘤菌氮醉活性的影晌
T a b le 3 E fe
e t o f C : H : a n d C O o n 氏 u p t a k e a c t iv i t y i n fr e e · l ivi n g形如西动m a , rasr a li
菌 株 类 型
S t r a in t y P e T er a t n l祀 n t
吸 氢 活 性
H一 u p t a k e a e t iv i t i y
( n m o l o f H :
·
h一 1 · m g P or et in )
抑 制 万
R e P r e s s e d 多
8 9 H u P +
4 0拓 C : H :
3 28 5
.
7
*
13 9 8
.
7
*
10 0
5 7
.
4
8 9@ H
u p + 5拓 C O
10拓 C O
82 7
.
5
* *
6 3 1
.
0
* *
25 8
.
0*
*
10 0
2 3
.
8
6 8 8
数值为三个重复的平均 。
. * 数值为四个重复的平均。
T h e d a t a r e P o r忱 d a r e t h e va e r a g e o f t r iP l i e a t e as ay s
.
. * T h e d a t a r e op
r t e d ar e th e a v e r a g e Of fo
u r r e P lie a t es
.
四 、 乙炔和一饭化碳对不同类型菌株所形成的萦云英根启吸氮的影晌
4 0 %的乙炔对菌株 8 9 和菌株 74 所形成的紫云英根瘤的吸 氢 分 别 抑 制 了 3 3 . 9 和
57
.
3% ( 表 4 ) 。 而 2 0% 的一氧化碳对 8 9 和 107 菌株所形成的根瘤分别抑 制 了 80 . 3 和
7 4
.
9%
。
五 、 不同菌株类型回接寄主植物对千物质积累的影晌
表 5 和表 6 是二次回接试验的结果 。 用自生条件下吸氢的菌株回接的植株干重并不
比用不吸氢的菌株回接的干重高 (虽然有个别的处理略偏高些 ) 。 看来植株干物质的积累
似与植株的瘤数 、 瘤重关系更为密切 , 而与自生条件下菌株有无吸氢能力 , 则无明显的
相关性 。
1期 汪 化等 :紫云英根瘤菌的吸氢与固氮的关系
表 4乙块和一妞化碳对萦云英根油吸氮的影晌
T ab l e4E f f e et o fC: H: an dC O onH:一 upt ak e
a et iv it yn it h en o d uls eo fA st r a召 as l u
菌 株 类 型
St r ain t y p er T e
at l l飞 ent
吸 氢 活 性
H
Z一 uP t ak ea et iv it y
(nm o lo fH:x h一 1义 m gn o d
.
)
抑 制 不
R eP r e
s s ed多
C K
9 8H uP +
40多 C ZH:
89
.
6
*
59
.
2
*
10 0
3 3
.
9
C K
74H uP一
0 4拓 C ZH:
90
.
9
3 8
.
8
*
10 0
57
.
3
C K 3 7 5
.
9
* *
9 8⑧ H up+
20多 C O 74 . 2 * *
10 0
80
.
3
C K
10 7H
uP一
20拓 C O
3 83
.
6* *
9 6
.
1 * *
10 0
74
.
9
吸氢活性以毫克鲜重根瘤计算 。
* *吸氢活性以毫克干重根瘤计算 。
H
:一 upt ak a e et iv it y (nm
o lo f巩 · h一 i· m gr f.n o d us l e一 1 ).
*.H:
一 uP t ak a e et iv it y (nm
o lo fH
:
·
h一 1· m gdr yn o d uls e一 1 )
.
表 5菌株类型对装云英生长 、 固氮和吸里的影晌
孕 T
ab l eSE价 et o fR hi zo i b um st r ain t y ps eon gr ow t hn it r o g en i fx at ion an d
H一 uP t ak eoA fst r口 gaS U ls fn葱 cs u
菌 株 根 瘤 数 (个 /株 )
No
.
o fn o d uls e
(P er p lant )
瘤 干 重
m (g/株 )
No d
.
dr yw t
.
(m g/P l
ant )
吸 氢
H
:一 uP t ak e
(nm o l/ m g
dr y
n o d
.
/ h )
植株干重
(m g/株 )
P latn dr yw t
·
(m gP / l
ant )
一 多
固氮酶活性
Nit r o g en as e
(nm o
1C: H; /
m gd
r yn o d
.
/ h )
13 9 18 61
.
8
157 174 5
.
6
||卜 |一日ó
St rx an
9 8H
up+3
.
90
.
40 3 7 5
.
94 1
.
9 8
74H
uP一 4 . 60 .4 61 6
。
9 8
0 17H uP一 5。 0 0
.
0 53 3 8
.
65 2
。
30 14 2 10 63
.
9
C K 10
.
7 5 10 0
表内的数值除吸氢是二个重复的平均值外 , 其余各项均为四个重复的平均 。
植物培养51 天后收获 ; 收获前一周植物转到连续光照中培养 。
T h e d a t a r e P o r t e d a r e th e a ve
r a g e of fo u r r e P li c a t e s
, e x e e P t t h a t H ,
· u P t a ke is ht
e a v e r a g e of d
u P lie a t e
a s s a y s
·
P l a n st w e r e h a r v e s t e d a ft e r 5 1 d a产 . B foe er a ~ k of 企
z a r
vse
之in g , p l a n st w e r e 邵 o wn u n d e r e o n -
t in u o u s l igh t (l i g h t i
n t e n s i t y 加 O W /砰 ) .
植 物 生 理 学 报 1 0卷
裹 6菌株类型对策云英生长 、 固氮和吸氮活性的影晌
T a lb
e 6Ee f
e t ofR h i
zo b i um s tr a i n t P ye s o n g r ow th n i tr o ge n f i a xt io n a nd
H :
· uP take of A万 t, 口g a lu s s艺n ic us
菌 株 吸 氢
H :
一 u p t a k
一拓
S t r a i n
根 瘤 数
(个 /株 )
N o
.
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1 1O d u k s
( P e r P l a n t )
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( m g /个 )
N o d
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I】 U《 l
/m g
植株干重
(m g /株 )
P la nt d yr w t
.
(m g P/ l
a n t )
固氮酶活性
N i t r o g e n嫂
( n om l C
: H一 /g
f r
·
n o d
.
/h )
17 6 6
.
7*
3 7 7 9
.
7.
8 0 8 3
.
7
6 5 6 8
.
8
0
6,
J尹04.…n少nùē吕4门054古1几né月 r通门1J.曰1卫nùóUtz月了20.…Z心,一J1.了0斗1卫,一伪山,走, .ōd .ù勺乙内1二.…nū17尸勺0ù勺内`ù久口刀呀八门n八1八、úōz.….…3工f曰0489 H u P +] 0 9 H u P +7 4 H u P 一
10 7 H u P一
C K
表内的数值是三个重复的平均。
植物培养4 8天收获 。
T h e d a t a r e p o r t e d a r e t h e a v e r a g e o f t r i p l i e a t e a s s a y s
.
lP a n t s w e r e h a r v e s t e d aft
e r 4 8 d a ys
.
由于上午从根上取下的根瘤 , 到下午才测定 , 故数值偏低 。
T h e d a t a r e P o r t e d a r e s m
a l l e r t h a n r e a l n u m b e r
,
b e c a u s e th e it m e w 】l e n n o d u l e s w e r e P i e k e d fr o m
t h e P l a n t s 15 d i fe
r e n t
.
讨 论
从上述试验来看 , 8株紫云英根瘤菌中只有 2 株在吸氢培养基上能够利用外源氢 ,
吸氢的菌株 占测定菌株总数的 25 % , 这与以往的调查结果 大 致相似 ( iL m 1 9 7 8 , R iu z -
A嗯 u e s o 等 1 9 8 1 , aP h w a 和 D o gr a 1 98 1 , iL m 等 1 9 5 1 ) 。 但在我们的试验中 , 吸氢的菌
株和不吸氢菌株对 T T C 的还原并没有多大差异 。 有别于 M a ler 等 ( 1 9 7 8) 和 aP h w a 与
D og ar ( 198 1) 分别在大豆根瘤菌和绿豆根瘤菌上的工作 。 事实上 目前还不 清 楚 T T c 还
原 与氢酶活性之间是否有专一性 ?
与自生固氮菌 ( S m i ht 等 19 7 6 ) 、 光合细菌 (宋鸿 遇 等 1 9 7 9 ) 、 蓝 绿 藻 ( B o t h e 等
1 9 7 7 , 陈因和方大惟 1 982 、 1 98 3) 中报道 的一致 , 我们观察到 40 % 的 乙 炔 和 5 、 10 、
20 % 的一氧化碳对 自生条件下的紫云英根瘤菌及其在寄主植物上所形成的根瘤的吸氢都
有不同程度的抑制作用 (表 3 、 4 ) , 虽然 R lu z一 rA g讹 so 等人 ( 1 9 7 9) 在大豆根瘤类菌 体
上没有观察到这种现象 。
有意义的是在 自生条件下不吸氢的菌株 , 当回接寄主植物后所形成的根瘤表现了吸
氢 的能力 (表 6 、 6 ) 。 这种现象 (就我们所知 ) 目前文献中报道不多 。 一般认为 , 自生条件
下不吸氢的菌株 , 当回接到寄主植物后形成的根瘤仍然不能利用氢 ( R iu z一 A gr u es o 19 8 1 ,
aP h w
a 和 D o g ar 1 9 81 , iL m 等 1 9 81 ) 。 这似乎是合理的 , 因为编码氢酶的遗传讯 息 与
固氮酶一样 , 寓于细菌体内 , 而寄主植物的影响可以忽略不计 。然而也有一些工作表明 ,
寄主对共生体形成吸氢 ( H u p + ) 或不吸氢 ( H u p 一 ) 的根瘤具有影响 , 寄主可以调节根瘤
的吸氢或不吸氢 ( G i b s o n 等 1 9 8 1 ) 。 M a i e r 和 M e r b e gr ( 1 9 8 2 )用几株 自生条件下不 能 吸
氢 的大豆根瘤菌的突变株回接寄主植物后 , 从其根瘤中分离到的类菌体 , 有的能够利用
1期 汪 化等 :紫云英根瘤菌的吸氢与固氮的关系 9 6
氢 , 有的仍不能利用氢 。 关键似乎在于氧的浓度对细菌合成氢吸收系统起着决定性的调
节作用 。 野生型根瘤菌在漫长的进化过程中 , 会不会在其形成氢吸收系统对氧有着不同
的要求 ? 如果是这样 , 那么 , 在自生条件下检测不出吸氢能力的菌株 , 在共生条件下 ,
由于所处的低氧环境诱导或者经过寄主其它因子的调节 , 从而能够合成氢的吸收系统 。
我们试图在实验室条件下验证具吸氢能力的紫云英根瘤菌菌株与寄主的干物质积累
之间的相关现象 , 结果并没有看到 自生条件下吸氢的菌株对其寄主的干物质积累有较显
著的增加 。 看来影响豆科植物共生固氮条件下的植株干物质积累的因子较多 , 有待进一
步的研究 。
参 考 文 献
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e n e d t o a s s e s s t h e r o le o f h y d r o g e n a s e i n i n e r e a s i n g t h e e if
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