全 文 ：一九九四年十二月
天然产物研究与开发
N A T U RA L P RO U DCT R王S EA RH CA N V D D E EL O PM EN I V o L. 6N o . 4
紫云英叶蛋白提取工艺研究 ’
贺筱蓉 李永泉 赵小立 周红军 翁醒华
( 杭州大学生物科学与技术系 杭州 31 0 0 2 ) 8
摘 要 本文采用正文试验对紫云英叶蛋白提取工艺进行了研究 ,结果表明 : 蛋白质萃
取工艺较优条件为 : 萃取剂与紫云英鲜叶料液比为 5 : 1 , 萃取温度为 20 ℃ ,萃取 pH 值
7
. 。 , 萃取剂中盐浓度为 0 . 5% ,绿色蛋白质在 50 ` C时沉淀 , 白色蛋 白质在 p H二 5 . 0 时沉
淀 。 采用此工艺提取得率为 25 . ,写 ,每吨紫云英鲜叶可得粗蛋白 0 . 例 吨 ,所得粗蛋白含
真蛋白 50 %左右 。
关键词 紫云英 ,叶蛋 白 ,提取工艺
前 日
随着 ,、 口 的剧增 . 生活水平的提高 , 人类对蛋白质需求量越来越大 , 而动物蛋白由于饲料
受谷物产量限制已严重短缺 , 因此开发利用地球上绿色植物的蛋白储量 ,是解决问题的重要途
径 。 且纯天然植物 .属绿色食品 ,在世界各国愈来愈受到重视 。 紫云英叶子含丰富的蛋白质 、 维
生素族 化合物 、 叶绿素 、 胡萝 卜素等 . 其中从中提取所得的粗蛋白 ,含蛋白质 50 一 6。% ,脂肪 20
~ 2 5
门 及维生素 、 叶绿素 、 胡萝 卜素等 。 就浙江省计 ,种植面积达 2 0 0 0 多万亩 . 按亩产 1 . 5 吨解
叶 . 每吨鲜叶可提取 。 . 洲 吨植物蛋白 , 浙江省每年可生产植物蛋白 8 0 多万吨 。 此外 . 可用于提
取叶蛋白的作物还有田蔷 、 背蓓 、 洋槐 、 大豆等 。 因此开发植物叶蛋白意义重大 。
材料与方法
1
. 材料
( l) 紫云英 : 开花前割取上部嫩茎和叶子 。
( 2) 萃取剂 : 由极性溶剂 、 弱酸 、 无机盐组成 ,三种物质均无毒 . 能食用 。
2
, 测定方法
( l) 蛋白质含量测定 : 凯氏定氮法测定 二` 。
( 2) 氨从酸含量测定 ; 酸水解蛋 白质 , 用贝克曼 s y 、 t e m 6 3 0 0 氨基酸分析 f义分析 . 色氨酸 用
碱水解方法测定二 。
` 本课题得到浙江 省科委的资助
收摘日期 , 工3 9 丢年 了 月 18 日
DOI : 10. 16333 /j . 1001 -6880. 1994. 04. 017
VO I
.
6 N o
.
4
() 3维生素 、 叶绿素含量侧定 :液相色谱法测定 。
() 4矿质元素含量测定 :采用 日本岛津 A A一 6 7 0原子吸收仪分析 。
3
.提取工艺流程
鲜叶』巡生塑色掩碎成匀浆 加入萃取荆及池萃取 离心一
~弃去不溶性纤维
~粗蛋白溶液近旦呈互 .些今
, 绿色蛋白沉淀一喷雾干操
离心
(热处理 ) , _ _ , _ _ 调 p H 值 _ 、
~ 日色重日俗很一禺心一 }一白色叶蛋白一够干澡’ ~ 上清液 :去蛋白汁液 ,含有一定浓度的糖和氨基酸 ,与上面压榨汁液一起 ,可用于单细胞蛋白发醉
4
. 试验方法 ·
分析工艺流程 ,可以分为两步 , 一步是粗蛋白质的萃取 ,包括绿色蛋白 (含叶绿素 )和白色
蛋白 , 影响萃取效率的主要因素有萃取剂和紫云英鲜叶的料液 比 、 萃取剂 中无机盐浓度 、 萃取
温度和 p H 值 。 这四个因素相互影响 , 因此采用正交试验优化工艺 。 第二步是绿色蛋白和 白色
蛋白的分离 ,前者升温使其沉淀 ,后者调 PH 值使其沉淀 , 因此只有单因素影响 ,较简单 , 采用
单因素搜索就行 。
.5 计算公式
绿色叶蛋白得率 : x . % = 每克鲜叶提取的绿色蛋白干重
白色叶蛋白得率 : x 。 % 一 玺幽蟾粤兽皂粤丝工重创下少乙 , 干曰 』或
总 蛋 白 得 率 : X呱 = x . % + x 白 %
X 1 00
X 1 0 0
萃取过程试验结果及其讨论
以料液 比 (紫云英鲜叶 : 萃取剂 ) 、萃取剂无机盐浓度 、 萃取 p H 值以及温度为试验因素 , 以
所得总蛋白为响应值 , 采用 L , ( 3` )正交试验表 ,重复二次 ,试验因素和水平见表 1 ,试验结果及
极差分析见表 2 ,方差分析见表 3 。
( l) 从表 2 的极差分析和表 3 的方差分析 3[] 可知 , 影响提取得率 因素中 , 萃取体系的 p H
值 ,萃取剂中盐浓度 、 萃取剂和紫云英鲜叶料液 比三个因素均极其显著 ,而萃取温度在试验范
围内几乎没什么影响 ,影响大小次序为 C > B > A > D , 较优的工艺条件为 : 紫云英鲜叶和 萃取
剂的料液比为 1 : 5 ,萃取剂中无机盐浓度为 0 . 5% , 萃取体系 p H 值为 7 . 0 , 萃取温度为 25 ℃ 。
(2 )萃取体系的 PH 值主要和蛋白
质等电点有关 , 经预实验知 , 两者等电
点均在 4 . 5一 5 . 5 之间 , 因此选择 p H
值应大于 6 或小于 J ,但 pH 值过小 ,加
酸量就要增加 , 一是增加 生产成本 ,二
是过酸对产物风 味和口感会产生影响 ,
试验亦表明 , pH ~ 7 比较合适 。
丧 1 萃取过程正交试验因素水平表
仪 人 B C O料液比 无机盐浓度 萃取体系 p H 值 萃取沮度l 6 : l 0 . 班% 5。 0 忍O℃
2 5 : l 0
.
5 % 6
.
0 2 5℃
3 4 : l l写 7 . 0 3 0亡
10 0 V o l
.
6 N o
.
4
农 2 试脸结果及其极位分析
试脸 试验方案 试脸结果
序号 A B % C D X . % X 白 % X % ( X : + X : ) %
1 6
: l 0
.
1 5
.
0 20 8
。
4 9
.
2 2
。
3 2
.
5 10
。
7 1 1
。
7 22
。
4
2 6 . 1 0
。
5 6
.
0 2 5 3
.
7 4
。
3 5
.
7 6
。
4 1 9
。
4 2 0
。
7 4 0
.
1
3 6
1
1 l 7
.
0 30 0
.
1 0
.
5 l
。
6 10
。
2 2 1
.
7 2 0
。
7 4 2
.
4
4 5
. 1 O
。
1 6
。
0 30 9
.
4 7
。
9 7
。
5 6
。
7 1 6
.
9 1 4
.
6 3 1
.
5
5 5
一
l 0
.
5 7
、
0 20 5
.
6 6
。
5 8
。
2 8
.
9 2 3
.
8 2 5
.
4 4 9
.
2
6 5 r l l 5
.
0 2 5 8
.
5 9
.
6 3
.
9 4
.
6 1 2
.
4
`
1 4
.
2 夕 6 . 6
7 4 : l 0
.
1 7
.
0 2 5 8
.
4 8
.
7 4
.
8 6
.
1 1 3
.
2 1 4
.
8 28
.
0
8 4
,
l 0
。
5 5
.
0 3 O 2
。
5 2
。
2 2
。
l 2
。
7 1 4
.
6 1 4
.
9 2 9
.
5
9 4 : l l 6
.
0 2 0 1
.
5 0
.
3 5
.
8 4
.
9 1 7
.
3 1 5
.
2 3 2
.
5
K z 1 0 4
.
9 8 1
.
9 7 8
.
5 1 0 4
.
1 1 5 0 1 5 5
.
2 3 0 2
.
2
K : 1 0 7
.
3 1 1 8
.
8 1 0 4
.
1 9 4
.
7
K : 9 0 1 0 1
.
5 1 1 9
。
6 1 0 3
。
4
义: 1 7 . 5 1 3 . 7 1 3 . 1 1 7。 4
K ,
z
] 7
.
9 19
.
8 1 7
.
4 1 5
。
8
K : l 5 1 6
.
9 1 9
。
9 1 7
。
2
R 2
.
9 3
.
2 6
.
8 l
。
6
表 3 方趁分析表
变异来源 自由度 平方和 方差 F F o . 0 5 F o . 01
区组 l 0 . 2 7 0 . 2 7 0 . 2 0 4 . 4 6 8 . 8 5
A 因素 2 2 9 . 2 8 1 4 . 6 4 1 0 . 9 2 月. 4 6 8 . 6 5
B 因素 2 1 1 3 . 6 2 5 6 . 8 1 4 2 . 4 0 4 . 4 6 8 . 6 5
C 因素 2 1 4 3 . 6 0 7 1 . 8 0 5 3 . 6 6 4 . 4 6 8 . 6 5
D 因素 2 9 . 1 4 4 . 5 7 3 . 4 1 4 . 46 8 . 6 5
误差 。 8 1 0 . 6 9 1 . 3 4
总的 l 7 3 0 6 . 6 0
( 3) 萃取剂中所用无机盐 , 主要用于增强萃取体系的离子强度 , 因为被萃取的蛋白质均是
有较大极性的物质 ,据相似相溶原理 ,离子强度越大 ,越易被萃取 。 但蛋白质又是一种胶体 、离
子强度过大 ,会破坏蛋白质分子表面的水化层 ,从而使蛋白质沉淀 ,降低了萃取效率 。 分析表 2
的试验结果 , 盐浓度对白色蛋 白影响程度较绿 色蛋 白大 ,因为绿色蛋白中含有较 多的叶绿素 、
维生素等 , 见表 4 ,这些物质在较大离子强度的溶液中较易溶解 。
(钓料液比过小使一部分蛋 白质不溶解 ,从而影响萃取效果 ;若料液比过大 ,尽管被萃取的
蛋白质较多 , 但后面分离过程中浓度过稀 , 影响沉淀效果 , 最终使得率不高 。 另外 ,料液 比过大 .
使萃取釜和结晶罐设备增大 , 从而增大了成本 , 降低生产效率 , 试验结果表明 ,料液比 1 : 5 较
合适 。
Vo f
。
6 N o
.
4 1 01
丧 弓 两种叶蛋白中维生素及叶绿素 、胡萝 卜素含 l分析 ( m g/1。。) g
类 别 Vc V一 V” V. V“ Vo* 叶绿素 胡萝 卜家
绿蛋白 5 5 。 8 4 0 .7 0。 69 7 4 。 9 检出 检出 99 .4 1 4 .0
白蛋白 1 3 9 。 6 3 6 .0 l。 7 3 0。 8 0 检出 检出 0 .2 9
蛋白质离析试验结果与讨论
在绿色蛋白和 白色蛋白的离析沉淀过程中 , 通过预实验 知 , 绿色蛋 白变性温度相对较低 ,
所以采用加热法沉淀 ;而 白色蛋白变性温度相对高一点 ,大约 60 ℃左右 , 若仍然采用升温加热
法 , 则能耗要增大 ,生产成本亦增大 ;故采用调 p H 值至等电点使之沉淀 。
温度和绿色蛋白得率的关系见图 1 , p H 值和 白色蛋白得率的关系见图 2 。
x 自%
叫402no的Ué0nù凡内匕J,,`
月0亡 5 0 亡 ` 0℃ 温度
图 l 沮度对绿色蛋白得率的影响 图 2 p H 值对白色蛋白得率的影响
( 1) 从图 1 可知 , 绿色蛋白质在 40 ℃开始沉淀 ,在 50 ℃沉淀量最大 。 若大于 60 ℃ ,在后面
的实验过程中就不能得到白色蛋白 , 所以这时尽管所得沉淀量较大 , 但不易使两者分离 。 若温
度继续增高 , 绿色蛋白逐渐从鲜绿色变成墨绿色 , 因为温度过高 , 加快了叶绿素的氧化速度 。
(2 )从图 2 可知 , p H ~ 4 . 5 ~ 5 . 0 之间沉淀量最大 , p H > 5 . 0 白蛋 白又开始溶解 , pH ~ 7 . 0 ,
几乎完全溶解 ,这和前面萃取过程的正交试验结论一致 。 考虑到原溶液 p H一 7 . 0 , 调到 pH 二 5 .
0所费的盐酸用量较少 , 占用成本小 ,且 pH 二 5 . 0 左右一般不影响产物的 口感和风味 , 故采用
禅 ~ 5 . 0 沉淀白蛋 白 . 白蛋白的沉淀 pH 值在白蛋白等电点附近 . 这与白蛋白组成成分中酸性
氮基酸含量较多有关 . 白蛋白中氨基酸成份分析见表 5 .
衰 5 两种叶蛋白中红签酸的组成及含 t 分析 ( m g g/ 干盆 )
必需氮荃酸 绿色叶蛋白 白色叶蛋白 非必需氮荃酸 绿色叶蛋白 白色叶蛋白
苏氮酸 2 5 . 2 9 2 5 . 1 1 天冬氮酸 5 3 . 9 5 4 9 . 7 5
缘氨酸 2 8 . 8 4 2 0 . 1 9 丝氨酸 2 5 . 1 0 1 7 . 6 6
蛋氮酸 谷氮酸 6 0 . 5 5 7 1 . 9 4
异亮氮酸 2 0. 7 9 1 9 . 4 0 脯氮酸 1 9 . 9 3 2 3 . 6 7
亮氮酸 4 0 . 4 8 5 1 . 6 2 甘氮酸 3 0 . 2 7 3 0。 6 8
苯丙氮酸 30 。 2 2 9 5 . 8 3 丙氮酸 3 6 . 9 8 3 5 . 2 7
组氮酸 1 3 . 5 1 2 8。 2 5 半肤氮酸
核氮酸 2 7 . 4 5 2 7。 5 6 酪氨酸 6 6 . 5 3 3 4 . 6 2
色氮酸 4 5 . 8 0 1劝. 6 9 精氮酸 1 8 . 3 9 2 9 . 9 5
总必需氨基酸 2 3 2, 3 8 2 9 7 . 9 1 总氨基酸 5 4 4 . 0 6 5 7 5 . 6 5
1 0 2 V
o l
.
6 N o
.
4
结 论
(” 综上所述 , 紫云英提取工艺较优条件为 : 萃取过程 , 料液 比 l : 5 、 萃取剂无机盐浓 度
0
.
5%
、 萃取 p H 值 = 7 . 0 、 萃取温度在常温下 ,蛋白质离析过程 ,绿 色蛋白沉淀温度 50 ℃ , 白色
蛋 白沉淀 p H 值一 5 . 0 .
( 2) 采用上述工艺 ,提取得率为 25 . 4% ,按每吨紫云英鲜叶可折算成 0 . 16 吨干叶计 , 每吨
鲜叶可得 4 Ok g 蛋白质 。 每亩土地收割紫云英鲜叶约 1 . 5 吨 ,浙江省有 2 0 0 0 多万亩水田 , 即可
产蛋白质 80 多万吨 ,产量非常可观 , 因而是解决蛋白资源不足的重要途径 。
( 3) 所得产物分成白色蛋 白和绿色蛋 白两种 ,两者真蛋白含量均在 50 %以上 , 并含有丰富
的维生素和矿质元素 。 前者所含必需氨基酸 51 . 72 写 ,可直接用作营养蛋白添加剂 ; 后者既可
作营养添加剂 ,又 可作夭然叶绿素 ,少量添加于食 品中即可改变食 品的风味 ,使之成为人们喜
爱的 “ 绿色食品 ” .
因此植物叶蛋白的开发前景可观 。
参 考 文 献
〔门 张龙翔等 . 生化实验方法和技术 . 人民教育出版社 , 1 9 8 3
〔2」 中山大学生物系生化微生物教研室编 . 生化技术导论 . 人民教育出版社 , 1 9 7 9
〔3〕 裴洪平 . 生物统计学 . 浙江教育出版社 , 19 1
T H E S T U D Y O N E X T R A C I , T E C HN I Q U E A B O U T L E A F P R O T E IN
C O N C E N T R A T E ( L P C ) O F A S T R A G A L U S S IN I C U S
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A加 t r a e t W it h o r t h o s o n a l t e s t s w e s t u d ie d t h e e x t r a e t t e e h n i q u e o f L P C o f A s t r a g a l u s s i n ie u s . T h e r e -
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v e r e a g e n t a n d A s t r a助 l u s s i n i e u s f r e s h
l e a f 认, a s i n th e r a t i o o f f i v e t o o n e , t h e te m pe r a tu r e w a s 2 0 oC . t h e P H w a s 7
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K e y w o r ds A s t r a g a l u s s i n i e u ,
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