全 文 ：第 48卷 第 1期 土 壤 学 报 Vol.48, No.1
2011年 1月 ACTA PEDOLOGICA SINICA Jan., 2011
＊国家自然科学基金项目(30270051)和湖北省国际合作重点项目(2003CA020)项目
通讯作者 , E-mail:binzhao@mail.hzau.edu.cn
作者简介:曹 玲(1982— ),女 ,硕士 ,主要研究方向:丛枝菌根生理。 E-mail:lingcao82@yahoo.cn
收稿日期:2009-03 -03;收到修改稿日期:2009 -05-08
AM真菌与紫云英 RiT-DNA转化根
双重培养体系的建立＊
曹 玲 赵 斌
(华中农业大学农业微生物学国家重点实验室 ,武汉 430070)
ESTABLISHMENTOFADUALCULTURESYSTEM FORARBUSCULARMYCORRHIZAL
FUNGIANDRiT-DNA-TRANSFORMEDROOTSOFASTRAGALUASINICUSL.
CaoLing ZhaoBin
(StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology, HuazhongAgriculturalUniversity, Wuhan 430070, China)
关键词 双重培养;丛枝菌根;发根农杆菌;转化根
中图分类号 Q939.5 文献标识码 A
丛枝菌根(Arbuscularmycorhiza, AM)真菌是一
类古老的植物共生真菌 ,与植物约有 4亿年共生
史 [ 1] ,能与 80%以上的陆生维管植物形成互惠共生
体 —丛枝菌根 , 可以改善植物对磷素营养的吸
收 [ 2-3] ,增强植物的抗逆性 、抗病力或耐病力 ,与根
瘤菌共同作用于豆科植物促进豆科植物正常的生
长发育 ,提高产量 ,在自然生态系统和实践应用中
发挥着重要作用 [ 4-5] 。
AM真菌营专性共生生活 ,至今尚未实现纯培
养 ,因此对 AM真菌的生理学 、遗传学以及 AM真菌
与植物共生分子机制等方面的研究进展缓慢。近
30年来一些研究者 [ 6-9] 将发根农杆菌 RiT-DNA转
到高等植物细胞 ,诱导出转化根 ,为 AM真菌提供无
菌宿主材料。转化根自合成冠瘿碱激素可在培养
基上无限快速生长 , AM真菌对其侵染率较高 ,形成
共生体后外生菌丝生长旺盛。本实验以能够被华
癸中生根瘤菌(Mesorhizohiumhuakui)侵染的紫云
英转化根[ 10]作为宿主与 AM真菌建立双重培养体
系 。此双重培养体系将为在分子和生化水平上研
究 AM真菌与豆科植物共生机理及两者之间相互作
用提供可操作的技术平台 ,且有望在此双重培养体
系基础上建立 AM真菌 、豆科植物与根瘤菌离体三
重培养体系 ,对于揭示两类微生物共侵染过程及相
互作用机制有重要意义 。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试 AM真菌菌株为 MUCL 43194-Glomus
intraradices,为 RiT-DNA胡萝卜转化根培养所得
(购自 BCCM/MUCL)。
供试细菌为发根农杆菌 K599(Agrobacterium
rhizogensK599),链霉素抗性 ,含质粒 pBI121(本实
验室生物固氮分室提供)。质粒 pBI121为双元载
体 ,含有卡那抗性筛选标记和可表达的 GUS基因 。
1.2 供试植物
紫云英(AstragaluasinicusL.),本室保藏 。
1.3 细菌菌株培养
将 -80 ℃保藏的发根农杆菌 K599接种于含
50 mgL-1链霉素(Str)和 50 mgL-1卡那霉素(Km)
的 LB固体培养基 ,于 28 ℃恒温培养箱暗培养 2 d。
挑取单菌落接种于 LB液体培养基中 , 28 ℃振荡培
养 20 h左右 ,取生长旺盛的菌液 (OD600 =0.6 ～
0.8)进行侵染试验。
1期 曹 玲等:AM真菌与紫云英 RiT-DNA转化根双重培养体系的建立 213
1.4 紫云英的转化
选取颗粒饱满 、大小均匀 、有光泽的紫云英种
子 ,用 75%乙醇预处理 4 min,无菌水冲洗多次 ,再
用 3%次氯酸钠表面消毒 10 min,无菌水漂洗至完
全除去表面残留的次氯酸钠。种子在无菌水中充
分吸涨后 ,均匀铺于水琼脂(0.8%)平板 ,置于培养
箱内 22 ～ 25 ℃暗培养至胚根长约 1 cm,转至光照
培养箱(光照强度 8 000 lx),光照时间 14 hd-1 ,
22 ～ 25 ℃培养 3 ～ 5 d。取已长出子叶的无菌苗 ,在
下胚轴中部切开 ,弃根部 ,将剩余部分的切口处完
全浸入 K599菌液中 。以无菌水处理作为对照 ,浸
泡 10 min后 ,用无菌滤纸吸干植株子叶表面菌液 ,
置于 MS培养基上 , 22 ～ 25 ℃、14 hd-1光照培养 。
3 d后转移到含 500 mgL-1头孢噻肟钠(Cef)和不同
浓度 Km(0 , 20, 40, 60 mgL-1)的 MS培养基中进
行紫云英除菌培养 ,同时进行转化根的筛选。
1.5 转化根的检测
20 d后从愈伤组织处剪下无向地性 、颜色较
白 、分枝多的根段 ,标记为 A。同时选取对照根段标
记为 B, 重复 3次 。将剪下的根段放入 1.5 ml
eppendorf管 ,加 GUS染液(成分:75 mmolL-1pH7.0
磷酸缓冲液 、 1 gL-1 X-Gluc、 10 mmolL-1 EDTA、
0.1% TritonX-100、 50 nmolL-1 K4 [ Fe(CN)6 ] 、
50 nmolL-1 K3 [ Fe(CN)6 ] )[ 11]浸没根段 , 37 ℃温育
12 h, 95%乙醇冲洗后 ,解剖镜下观察结果。
1.6 转化根的除菌
从愈伤组织处剪下的转化根 ,转接到双重培养
基(MSR)上 , 22 ～ 25 ℃暗培养 ,每 10 ～ 15 d,剪取转
化根根尖(约 4 cm)转接新鲜 MSR培养基 ,转接 3 ～
4次以完全除去转化根所带细菌。
双重培养采用 MSR培养基 ,组分为(mgL-1):
MgSO4· 7H2O739;KNO3 76;KCl65;KH2PO4 4.1;
Ca(NO3 )2 · 4H2O359;Na-FeEDTA1.6;MnSO4 ·
4H2O 2.45;ZnSO4 · 7H2O 0.28;H3BO3 1.85;
CuSO4· 5H2O 0.22;Na2MoO4 · 2H2O 0.0024;
NH4MoO4 0.034;泛酸钙 0.9;生物素 0.000 1;烟酸
0.1;盐酸吡哆素 0.09;盐酸硫胺素 0.1;钴胺素
0.04;蔗糖 10 000;琼脂 8 000;pH5.5。
1.7 孢子的接种
剪取在 MSR培养基上生长 15 ～ 20 d、长度约
5 ～ 6 cm紫云英 RiT-DNA转化根两条 ,首尾并排放
于含有 MSR培养基的平皿一端。 G.intraradices为
保藏在 MSR培养基中的成熟孢子 ,用解剖刀将培养
基切成 2 mm小块(每个小块约有 10 ～ 20个孢子)
放到距 RiT-DNA紫云英转化根根尖约 1 cm处。每
皿接种 5 ～ 6个带 G.intraradices的培养基块 , 25 ℃
倒置暗培养。
1.8 AM真菌侵染根器官的检查
接种后每 5 d取出平皿在体视显微镜下观察菌
丝的分布 、与根的接触情况 、新孢子的形成等。 40 d
后开始收获。 80 ℃水浴溶化培养基后 ,取出根段 ,
剪成约 1 cm长 ,采用 Trouvelot等[ 12]描述的 Trypan
blue(TB)染色法进行染色 ,显微镜下观察 AM真菌
侵染根器官情况。
1.9 数据统计与分析
试验数据采用统计分析软件 DPSV6.55版 ,显
著性分析采用 Duncan′s多重比较测验法。
2 结果与分析
2.1 Km对紫云英 RiT-DNA转化根筛选的影响
转化根因被转入质粒 pBI121而具有 Km抗性 ,
非转化根没有 Km抗性 ,因此在生根培养基中加入
Km能抑制紫云英非转化根的生长而提高紫云英生
根植株的转化率。
紫云英植株转化后 20 d,观察其在不同 Km浓
度培养基上的生长状况 。在不加 Km的培养基上生
长的紫云英 ,切口处很少长出愈伤组织 ,非转化根
生长旺盛 ,生根植株转化率仅为 46.9(±2.7)%(见
表 1)。而在加有 20、40 mgL-1 Km培养基上 ,紫云
英切口处形成愈伤组织并长出转化根 ,且生根植株
的转化率随着培养基中 Km浓度的增高而增高。而
在含有 60 mgL-1 Km培养基上紫云英叶片变黄正
常生长受抑制 (数据未检测)。可见 Km能够有效
抑制非转化根的生长 ,明显提高生根植株的转化
率。在 Km浓度为 40 mgL-1时生根植株转化率约
为对照的 2倍 。
表 1 Km浓度对紫云英转化根筛选的影响
Km浓度(mgL-1) 植株数 生根植株转化率 1)(%)
0 60 46.9 ±2.7c
20 60 68.7±1.0b
40 60 84.0 ±3.3a
60 60 ND2)
1)数据后的不同字母表示 p<0.01水平上差异极其显著;
2)ND:数据未检测
2.2 紫云英 RiT-DNA转化根的鉴定结果
标记为 A的根段经 GUS组织染色后呈现阳性
即深色根段 ,表明 Ri质粒已经成功转入紫云英根
214 土 壤 学 报 48卷
段 ,而对照的紫云英根段 B呈现 GUS阴性即白色根
段(图 1)。这表明从愈伤组织处长出的无向地性 、
颜色较白 、分枝多的根段均可确定为转化根。
图 1 紫云英 RiT-DNA转化根 GUS染色
2.3 紫云英 RiT-DNA转化根的生长情况
紫云英转化后约 7 d就长出愈伤组织 , 14 d左
右从愈伤组织处长出转化根 ,转化根与非转化根相
比较有较明显的特征:转化根无向地性 ,颜色较白 ,
分枝多 ,根毛多(图 2)。
图 2 紫云英 RiT-DNA转化根(箭头)
新转接的紫云英 RiT-DNA转化根根段在 MSR
培养基上生长迅速 ,根尖平均生长速度约 4 mmd-1 ,
分枝细 ,根毛多 。由于转化根的生长无向地性 ,转化
根在生长过程中一部分伸向培养基中一部分伸向空
中。经过 3 ～ 4代除菌后 ,生长 15 d左右的转化根段
即可用于双重培养体系。
2.4 G.intraradices的萌发状况及对紫云英 RiT-
DNA转化根的侵染
含有 G.intraradices琼脂块在 MSR培养基上
3 d开始萌发 ,每个孢子只有一个萌发管 ,新形成的
菌丝较纤细且生长速度很快 ,并形成分枝状结构 ,
菌丝的生长表现出明显的趋根性 , 7 d后菌丝接触
到根段 ,随后部分菌丝包围根段 ,在根段表层形成
附着胞结构(图 3),表明双重培养体系已经初步建
立。约 15 d外生菌丝布满平皿并形成很多成促生
长的分枝状结构 。 TB染色后可以清晰地看到
G.intraradices在根内形成的泡囊 (图 3)和丛
枝(图 3)。
培养 21 d形成第一个次生孢子 , 30 d后 ,在培
养皿中形成大量的成熟孢子(图 3)。新形成的孢子
离根较远 ,大部分在培养基内部 ,培养基上空也有
少量新形成的成熟孢子 。本实验发现 ,接种后一个
月是孢子形成的最旺盛时期 ,且产孢集中在大约一
周的时间内 ,尤其是紫云英 RiT-DNA转化根开始
变黄的时候产孢最旺盛 。
3 讨 论
从本研究结果来看 ,合适的抗生素浓度对紫云
英转化根形成的效率影响较大 。适当的 Km浓度
(mgL-1)会提高紫云英 RiT-DNA转化根形成的效
率 ,而过高的 Km浓度(60 mgL-1)抑制转化根形
成。当 Km浓度为 40 mgL-1时 ,紫云英转化根因
RiT-DNA所带的 Km抗性而大量生长 ,非转化根则
受到 Km抑制生长缓慢且数量较少 。当 Km浓度为
60 mgL-1时 ,由于浓度过高 ,无论转化根还是非转
化根均受到抑制。这与 Boisson-Dernier等的研究结
果相一致 [ 13] 。
AM真菌与紫云英双重培养体系的建立具有重
要的理论和现实意义 ,是研究 AM真菌形态学 、生理
学 、生物与非生物胁迫应答 、根际生物(PGPR、病原
菌 、线虫)的相互作用 、分类系统进化等方面的理想
模式 ,更是目前公认的唯一能够提供无污染 AM真
菌材料的方法 ,这使分子生物学 、生物化学技术广
泛应用到 AM真菌的研究中 。采用此双重培养体系
能够进行 AM真菌与豆科植物相互识别信号和共生
机制的研究。同时此双重培养体系也使 AM真菌 、
豆科植物与根瘤菌离体三重培养体系的建立成为
可能 ,将为揭示两类微生物共侵染过程及相互作用
机制起到推动作用 。
本实验中 AM真菌 G.intraradices次生孢子形
成的高峰期集中在 7 ～ 10 d的时间 。Bago等利用番
茄和 G.intraradices构建的双重培养体系也观察到
同样的结果[ 14] 。这个现象可能与观察所选取的时
间范围 、菌种本身的特性或某些培养条件有关 。本
实验中也观察到 ,在菌丝生长过程中 ,未接触到根
段的菌丝会分化成 3 ～ 4 级的分枝吸收结构
(Branchedabsorbingstructures, BAS),这种结构大多
1期 曹 玲等:AM真菌与紫云英 RiT-DNA转化根双重培养体系的建立 215
以垂直主干菌丝的方向生长。 Becard和 Fortin认为
BAS可能是外生菌丝与根直接作用的结果 [ 8] 。
Karandashov等则认为培养基成分的改变如培养过
程中培养基 pH的降低 、根产生的代谢产物等均可
能促进外生菌丝产生 BAS[ 15] 。 BAS是否仅存在于
双重培养体系中 ,我们还知之甚少 。因此还需要进
一步研究 BAS的成因以及 BAS的具体功能。
图 3 G.intraradices侵染紫云英 RiT-DNA转化根 TB染色及新孢子形成
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