全 文 ：中国农业科学 2010,43(24):5088-5099
Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.24.013
收稿日期：2010-04-21；接受日期：2010-10-15
基金项目：国家自然科学基金项目（30700496）、国家科技支撑计划（2006BAD27B09-2）、广东省国际合作项目（2007B050200014）、广东省自然科
学基金项目（06025364）
作者简介：张芳轩，硕士研究生。E-mail：zhangfangxuan@126.com。通信作者张瑞芬，副研究员。E-mail：ruifenzhang@163.com
不同黑大豆种质资源种皮花色苷组成及抗氧化活性分析
张芳轩 1,2，张名位 1，张瑞芬 1，刘章雄 3，魏振承 1，邱丽娟 3，杨春英 1，张 雁 1，唐小俊 1，邓媛元
（1 广东省农业科学院农业生物技术研究所/农业部功能食品重点开放实验室，广州 510610；2 华中农业大学食品科技学院，武汉 430070；
3 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）
摘要：【目的】了解不同黑大豆种质资源种皮中花色苷的组成、含量及其抗氧化能力分布情况。【方法】采用
酸性甲醇浸提 60 个黑大豆种质种皮中的花色苷，通过与标准品对照，用 HPLC 法分析其种皮花色苷的组成及含量，
同时用 pH 示差法测定各种质的总花色苷含量，采用氧自由基清除能力（ORAC）法测定各种质种皮的抗氧化活性。
【结果】从 60 个黑大豆种质中共检测到飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、
矮牵牛素-3-葡萄糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷和锦葵素-3-葡萄糖苷６种花色苷组分。其中有 44 个品种中检测到上
述全部 6种花色苷组分，而其余 16 个品种只含有其中的 4－5种。矢车菊素-3-葡萄糖苷是所有受试黑大豆种质中
含量最高的花色苷组分。不同黑大豆种质间各单体花色苷和总花色苷含量及其 ORAC 值抗氧化能力差异均较大，其
中总花色苷含量的变幅为 98.8—2 132.5 mg/100g，ORAC 值的变幅为 212.5—1 834.6 μmol TE/g，且各种质总花
色苷含量与其 ORAC 值呈显著正相关关系（r = 0.62, P＜0.001）。采用快速聚类法将 60 个黑大豆种质聚成营养和
花色苷活性成分含量差异显著的三大类群。【结论】不同黑大豆种质种皮花色苷组成基本相同，但其各花色苷单体
及总花色苷含量存在显著差异，花色苷是黑大豆种皮抗氧化作用的重要物质基础。
关键词：黑大豆；种皮花色苷；高效液相色谱；ORAC
Comparative Analysis of the Anthocyanin Profiles and
Antioxidant Activity of Seed Coats from Different Black
Soybean Germplasm Resources
ZHANG Fang-xuan1,2, ZHANG Ming-wei1, ZHANG Rui-fen1, LIU Zhang-xiong3, WEI Zhen-cheng1,
QIU Li-juan3, YANG Chun-ying1, ZHANG Yan1, TANG Xiao-jun1, DENG Yuan-yuan1
(1Key Laboratory of Functional Food, Ministry of Agriculture, Bio-technology Research Institute, Guangdong Academy of
Agricultural Sciences, Guangzhou 510610; 2College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University,
Wuhan 430070; 3Institute of Crop Science, Chinese Acedemy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)
Abstract: 【Objective】 The anthocyanins profiles and antioxidant activity of seed coats from different black soybean varieties
were investigated. 【Method】 Crude extract solution of black soybean seed coats anthocyanins of 60 varieties was obtained by
soaking seed coats in acidified methanol. External standards were used to determine the composition and content of anthocyanins in
each variety by HPLC gradient elution method. The oxygen radical scavenging capacities expressed as ORAC values of black
soybean varieties were also evaluated. 【Result】 Six anthocyanins were found totally in 60 black soybean varieties including
delphinidin-3-glucoside, cyanidin-3-galactoside, cyanidin-3-glucoside, petunidin-3-glucoside, peonidin-3-glucoside and malvidin-3-
glucoside. All the 6 components were detected in 44 varieties of the black soybean, and only 4 or 5 anthocyanins were detectable in
the other 16 varieties. Cyanidin-3-glucoside was the predominant anthocyanin in all the analyzed varieties. Total contents of
anthocyanins and each component showed significant differences between varieties. Total anthocyanins content and ORAC in
various black soybean varieties were highly different with the ranges of 98.8-2 132.5 mg/100g and 212.5-1 834.6 μmol TE/g,
24 期 张芳轩等：不同黑大豆种质资源种皮花色苷组成及抗氧化活性分析 5089
respectively. A significant correlation was found between anthocyanin concentration and ORAC values (r=0.62, P＜0.001). Sixty
black soybean varieties were divided into three groups by K-means clustering analysis, which showed divers levels of nutritional or
bioactive traits.【Conclusion】The components of anthocyanins in different black soybean varieties were similar, but things were
different when it came to the content of individual anthocyanin. Anthocyanins are most significant antioxidant components in black
soybean seed coats.
Key words: black soybean; seed coat anthocyanins; HPLC; ORAC
0 引言
【研究意义】氧化应激是许多慢性退行性疾病发
生发展的主要机制。探寻和研究具有抗氧化活性的天
然植物化学物用于防治衰老相关的多种疾病，如阿尔
茨海默病、动脉粥样硬化等，成为医药、植物化学等
多个学术领域共同关注的课题。花色苷是隶属于黄酮
类化合物的一类多酚类物质。大量体内外研究表明，
花色苷通过其较强的抗氧化清除自由基作用，显示出
抗炎[1]、保护心血管[2]、抗肿瘤[3-4]等多种生物活性。
因此许多富含花色苷的物质如蓝莓、葡萄皮等在国外
已经得到了开发利用。黑大豆是中国传统的药食兼用
的作物资源，《本草纲目》记载“黑豆入肾功多，故
能治水、消胀、下气、制风热而活血解毒”。研究者
通过对比黑大豆和黄大豆种皮及子叶的活性物质组成
及其活性发现，两者的主要区别在于黑大豆种皮中富
含多酚类物质，特别是花色苷[5-6]。已有研究表明黑大
豆种皮花色苷具有多种生物活性，是其发挥保健作用
的重要物质基础[6-9]。因此了解不同黑大豆品种种皮花
色苷的组成及含量对进一步深入研究其生物活性，挖
掘高花色苷含量的黑大豆种质资源有重要意义。【前
人研究进展】有研究指出，不同类型的花色苷因其所
含羟基的数量、位置以及结合糖基的种类等的不同，
抗氧化活性有较大差异[10]。植物中的花色苷组成除了
与植物的种类有关外，同种植物不同的基因型以及不
同的生长环境也会影响其花色苷的组成及含量。目前
关于黑豆花色苷研究较多的是豆科菜豆属黑豆[11-13]，
而对于黑大豆的研究报道相对较少，且研究主要集中
在日本、韩国等国家[13-15]。不同研究所报道的黑大豆
花色苷构成从仅矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-glu）1
种 [14] 至包括 Cy-3-glu 、飞燕草素 -3- 葡萄糖苷
（Dp-3-glu）和天竺葵-3-葡萄糖苷（Pg-3-glu）等在内
的 10 种花色苷（素）不等[15]。Xu 等[6]分析产自美国
北达科他州-明尼苏达州地带的黑大豆种质种皮中花
色苷含量低于 1 mg·g-1，而 Yoshida 等[13]测得的某日本
黑大豆种皮花色苷含量高达 20.4 mg·g-1。研究者指出，
黑大豆品种基因型差异以及生长环境的不同是造成
这一差别的重要原因。【本研究切入点】上述研究
结果表明，由于种质资源种类和生长环境的差异，
黑大豆种皮中花色苷的组成及含量有巨大差异。中
国是大豆的故乡，黑大豆种质资源丰富，但目前关于
中国黑大豆种质种皮花色苷的研究还仅限于用分光光
度法测定其总含量[16]，对其花色苷单体的组成及含量
还未见报道。为较清楚地了解中国黑大豆种质的花色
苷构成情况及其生理活性，挖掘花色苷总含量和某单
体含量较高、保健作用强的黑大豆种质，用作开发保
健食品或提取花色苷的原料，有必要对其抗氧化活性、
单体组成及含量进行分析。本研究采用 HPLC 法，对
中国黑大豆种质资源库中随机抽取的 60 个黑大豆种
质种皮花色苷组成及各单体含量进行分析，同时测定
各种质氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance
capacity, ORAC）【拟解决的关键问题】本研究旨在
了解不同黑大豆种质间花色苷组成及其含量的分布
情况，挖掘出花色苷含量高和抗氧化作用强的黑大
豆种质资源，为揭示黑大豆抗氧化作用的物质基础
提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
黑大豆种质：60 份黑大豆种质由中国农业科学院
作物科学研究所提供，具体见表 1。其中春季和夏季
播种种质数分别为 35 个和 25 个，春播种质中 31 个繁
种地为山西省农业科学院作物品种资源研究所试验田
（太原，2008 年 5—10 月），4 个为黑龙江省农业科
学院大豆研究所试验田（哈尔滨，2008 年 5—10 月），
夏播种质繁种地均为云南省农业科学院粮食作物研究
所试验田（昆明，2008 年 6—11 月）。各种质的生育
期在 86—189 d，其蛋白质和脂肪含量如表 1 所示，由
中国农业科学院作物研究所完成。所有种质分别用塑
料自封袋密封后-20℃避光保存，备用。
1.2 仪器与试剂
安捷伦 LC1200 高效液相色谱系统配 VWD 检测
5090 中 国 农 业 科 学 43 卷
器（美国安捷伦公司），精密酸度计 PHS-3C 型（上
海大普有限公司）；紫外可见分光光度计岛津 1800（日
本岛津有限公司）；恒温震荡器（常州奥华仪器有限
公司）。多功能荧光分析仪 Fluoroskan Ascent FL
（Thermo Fisher Scientific）。
甲醇、甲酸、乙腈均为色谱级（美国 Fisher），
超纯水。含 15 种花色苷的欧洲越橘花色苷提取物、飞
燕草素-3-葡萄糖苷（Dp-3-glu）、矢车菊素-3-半乳糖
苷（Cy-3-gal）、矢车菊素-3-葡萄糖苷（Cy-3-glu）、
矮牵牛素-3-葡萄糖苷（Pt-3-glu）、锦葵素-3-葡萄糖
苷（Mv-3-glu）和芍药-3-葡萄糖苷（Pn-3-glu）花色苷
标准品购自挪威 Polyphenols Laboratories AS 公司。
2,2′- 偶 氮 二 异 丁 基 脒 二 盐 酸 盐 （ 2,2′-azobis
(2-amidinopropane) dihydrochloride，ABAP)、水溶性
维 生 素 E （ 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchoman-2-
carboxylic acid ， Trolox) 、 荧 光 素 钠 （ 3,6-
dihydroxyspiro 8[isobenzofuran-1(3H),9-(9H)xanthene]-
3-one, disodium salt， FL）均为 Sigma 公司产品。96
孔黑色底部透明微孔板购自 Corning 公司。其它试剂
均为国产分析纯。
1.3 样品处理
参考徐金瑞等[16]的方法稍加改进。黑大豆手工剥
取种皮，粉碎过 60 目筛，准确称取粉碎后的豆皮 0.500
g，置入 10 mL 石油醚浸泡 24 h 脱脂。脱脂后的豆皮
用滤纸过滤并挥干残留的石油醚，10 mL 60%酸化甲
醇溶液（用浓 HCl 将甲醇溶液 pH 校至 2.5）40℃振
荡提取 2 h，3 000 r/min 离心 10 min，分离上清液，残
渣按上述步骤重复提取 1 次，合并上清液定容至 20
mL，作为黑大豆种皮提取液，-20℃避光保存备用。
每份黑大豆种质平行分析 3 次。
1.4 黑大豆种皮花色苷组成及含量的 HPLC 分析
1.4.1 色谱分析条件 色谱分析条件参照 Baj 等[17]
的方法并进行优化。各样品测试液在液相分析前过
0.22 μm 微孔滤膜。色谱柱 XBridge C18 5.0 μm×4.6
mm×25 mm，预柱4.6 mm×20 mm，检测波长520 nm，
进样体积 20 μL，柱温 25℃，记录 20 min 色谱图。
流动相：A：10%甲酸水溶液，B：25%乙腈，25%
甲醇，10%甲酸，40%水。梯度洗脱：0—8 min，16%
—20% B；8—11 min，20%—38%B；11—20 min，38%
—46% B。
1.4.2 花色苷的定性、定量分析 在 1.4.1 所述的色
谱条件下，将黑大豆样品测试液各色谱峰的保留时间
与花色苷标准品的保留时间进行对照，并通过标准加
入法确定黑大豆样品处理液中花色苷的组成。各花色
苷组分的回收率为 92.6%—96.3%。参照外标法所得的
各标准品的峰面积(A)-浓度(C)标准曲线，计算各花色
苷组分的含量。
1.5 pH 示差法测定黑大豆种皮中总单体花色苷含量
黑大豆种皮提取液中总花色苷含量参照 Lee 等[18]
的 pH 示差法进行测定。分别用 pH 1.0 缓冲溶液（25
mmol·L-1 KCl，用浓 HCl 调 pH 至 1.0）和 pH 4.5 的缓
冲溶液（400 mmol·L-1 NaAc，用浓 HCl 调 pH 至 4.5）
按照相同的稀释倍数将提取液进行稀释。测定两种稀
释后的溶液在 520 nm 和 700 nm 的吸光度值。总单体
花色苷含量计算方法如下：
A×MW×DF×1000
ε×1
式中，A—吸光值；DF—黑大豆种皮提取液的稀释倍
数；MW—Cy-3-glu 的分子量，449.2；ε—Cy-3-glu 的
消光系数，26 900。A=(A520-A700)pH1-(A520-A700)pH 4.5。
1.6 氧自由基清除能力分析（oxygen radical absorbance
capacity, ORAC）
各黑大豆种质氧自由基清除能力的测定参照
Wolfe 等[19]的方法，向 96 孔板各孔分别加入 20 μL 不
同浓度的Trolox标准品溶液或按一定比例稀释的黑大
豆种皮提取液，稀释标准品或溶解样品等均以 75
mmol·L-1 磷酸钾缓冲液（pH 7.4）为工作液，空白孔
直接加入 20 μL 缓冲液，再向每孔中加入 200 μL 0.96
μmol·L-1的 FL，37℃孵育 20 min 后，用多道移液器迅
速向各孔加入 20 μL 新鲜配置的 119 mmol·L-1 ABAP
溶液。立即启动多功能荧光分析仪，在 37℃下以激发
波长 485 nm，发射波长 538 nm 连续测定各孔的荧光
强度监测荧光衰退情况，每 4.5min 重复测定 1 次，总
测定时间为 2.5 h。将提取液的自由基作用下荧光衰退
曲线的延缓部分面积（Net AUC）代入 6.25、12.5、 25
和 50 μmol·L-1标准抗氧化物质 Trolox 的 Net AUC 与
Trolox 浓度所做标准曲线，得到各提取液的氧自由基
清除能力 ORAC 值，以 μmol Trolox 当量/g 豆皮表示
（μmol TE/g）。
1.7 统计分析
数据分析采用 SPSS 17.0 统计分析软件包，数据
以 x±SD 表示，花色苷等营养活性物质含量及氧自由
基清除能力分析采用单因素随机区组设计方差分析，
品种间的比较采用 LSD 法；不同播种期的比较采用独
立样本 t 检验，相关性分析采用 Pearson 相关分析；聚
类分析采用 K means 聚类法聚成 3 类，不同聚类类别
24 期 张芳轩等：不同黑大豆种质资源种皮花色苷组成及抗氧化活性分析 5091
间的比较采用单因素方差分析，组间比较采用 LSD
法。显著性水平为 0.05。
2 结果
2.1 不同黑大豆种质种皮花色苷构成
为了确定黑大豆种皮中花色苷的构成，本研究首
先以含有 15 种花色素单糖苷的欧洲越橘花色苷提取
物为对照，参照 Baj 等[17]建立的越橘花色苷 HPLC 分
析条件，将相同色谱条件下的黑大豆种皮提取液的色
谱图与欧洲越橘色谱图进行了对照。发现从黑大豆种
皮提取液中分离到的 6 个色谱峰分别与欧洲越橘的
Dp-3-glu、Cy-3-gal、Cy-3-glu、Pt-3-glu、Pn-3-glu 和
Mv-3-glu 的保留时间一致。进一步通过标准品加入法，
确定黑大豆种皮中含有的为上述 6 种花色苷。
但是这一用于分析越橘花色苷构成的色谱条件扫
描时间达 90 min，虽然能够将黑大豆花色苷很好的分
离，但耗时过长，因此本研究进一步将色谱条件进行
了优化，使得各花色苷组分有效分离的同时，将所有
可检测的花色苷的出峰时间缩短到 20 min 以内。所得
色谱图如图 1 所示。
1: Dp-3-glu ; 2: Cy-3-gal ; 3: Cy-3-glu; 4: Pt-3-glu ; 5: Pn-3-glu; 6:
Mv-3-glu
图 1 Z17504 黑大豆种皮花色苷色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of anthocyanins in the seed coat
of black soybean variety Z17504
采用分析欧洲越橘花色苷的色谱条件，本研究所
分析的 60 个黑大豆品种种皮中共同含有的花色苷组
分为 Cy-3-glu、Pt-3-glu 和 Pn-3-glu 这 3 种。在其中的
44 个品种中 6 种花色苷全部检测到，大黑豆 09176、
黑豆 17501、黑金元和小黑豆 09172 等 4 份种质未检
测到 Dp-3-glu，前三者以及宾县黑豆中也未检测到
Mv-3-glu，而 Cy-3-gal 则在黑豆 09202、大黑豆 09195、
小黑豆 09172、黑豆 17537、小黑豆 09196、大黑豆
09218、大黑豆 17499、小黑豆 09198、小黑豆 09169、
小黑豆 09207、赤腚豆和杂豆等共 12 个品种中没有被
检出。
2.2 不同黑大豆种质种皮花色苷总含量及各成分比
较
本研究采用 pH 示差法和计算 HPLC 测得各单体
花色苷含量总和的方法测定了 60 份黑大豆种质种皮
总花色苷含量，相关性分析发现二者呈显著正相关关
系，相关系数为 0.95（P<0.001），这与 Abdel-aal 等
[20]分析不同颜色的大米、小麦、玉米等谷物种皮花色
苷构成及含量时所得到的两种花色苷总含量测定结果
的相关系数为 0.9973 相一致。但是本研究中两种测定
方法所得结果具有很高的一致性，其回归方程为：y
（HPLC 法）＝0.965x（pH 示差法）+23.35（图 2），
而 Abdel-aal 等发现用分光光度法测定的总花色苷含
量较液相法测定结果偏高了 40%，与本研究差别较大。
造成这种差异的原因一方面是由于两项研究中采用不
同的分光光度法：Abdel-aal 等采用的是单一 pH 测定
方法；另一方面可能与两项研究中受试物的花色苷构
成种类差别较大有关。
图 2 两种方法测定黑大豆种质种皮总花色苷含量散点图
Fig. 2 Scatter plot between total anthocyanins in black
soybean seed coats determined by HPLC and pH
difference method
尽管由于提取过程中少量的损失以及 HPLC 检测
下限的限制，在黑大豆种皮中一些含量非常低的花色
苷可能无法被检出，但考虑到本研究中 6 种花色苷的
检测下限均低于 20 ng·mL-1，可以认为这些未检出的
花色苷组分对总含量的影响是很小的。同时 HPLC 法
5092 中 国 农 业 科 学 43 卷
通过与各标准品对照能够更加准确地反映各种质花色
苷的真实水平，且该方法便于与国内外同类研究结果
进行对比分析，因此本研究中涉及黑大豆种质种皮总
花色苷含量时，如无特殊说明均以 HPLC 法测得各单
体花色苷含量之和计。
根据表1中60份黑大豆种质各单体及总花色苷含
量的总体分布情况可以看出，不同种质间花色苷总含
量差异显著，变幅为 98.8—2 132.5 mg/100g，其中有
19 份种质含量超过 1 000 mg/100g，产自山西的大黑
秧为总花色苷含量最高的品种，达 2 132.5 mg/100g，
细黑豆 17507 和小黑豆 17508 次之，分别为 1 815.6
和 1 575.7 mg/100g。Cy-3-glu 在本研究所分析的 60
个黑大豆种质中均为含量最高的花色苷组分，占总含
量的 48.77%—94.14%，有 5 份种质 Cy-3-glu 含量超过
1 000 mg/100g，分别为黑豆 17501、小黑豆 17508 、
小黑豆 17539、细黑豆 17507 和大黑秧，其中仍以大
黑秧含量最高 1 617.4 mg/100g，占总含量的 75.85%，
大 黑 豆 09176 虽 然 含 有 最 高 比 例 的 Cy-3-glu
（94.14%），但因其总花色苷含量只有 614.9 mg/100g，
仍为 Cy-3-glu 绝对水平较低的种质。此外，Dp-3-glu
和 Pt-3-glu 也是在大部分黑大豆种质中含量相对较高
的花色苷组分，小黑豆 17534、宾县黑豆和小黑豆
17508为含Dp-3-glu最高的种质，其含量依次为394.9、
322.3、321.9 mg/100g，黑早豆 17531、细黑豆 17507
和黑黄豆 17502 为 Pt-3-glu 含量最高的种质，其含量
依次为 198.2、149.0 和 125.7 mg/100g。Pn-3-glu 和
Mv-3-glu 在大部分种质中含量较低，其中只有大黑秧
（176.0 mg/100g）和黑豆 17501（118.5 mg/100g）两
份种质 Pn-3-glu 含量超过 100 mg/100g， 而 Mv-3-glu
则仅黑早豆 1 个（103.8 mg/100g）。Cy-3-gal 是本研
究所分析的黑大豆种质中平均含量最低的花色苷组
分，其平均含量只有 5.9 mg/100g，含量最高的种质也
只有 43.9 mg/100g（大黑秧）。
2.3 不同黑大豆种质种皮各花色苷单体构成比分析
研究表明，植物体内不同种类的花色苷是以相同
的化合物为底物——二氢山萘酚，经不同种类酶的催
化生成，这些花色苷合成酶因具有相同的底物而存在
竞争关系，不同物种及相同物种的不同种质间花色苷
合成酶的催化活性存在差异[21]。本研究从不同的黑大
豆种质种皮中检测到自然界最常见的 6 种花色素（苷）
中的 5 种，仅天竺葵素及其糖苷没有检测到。这些不
同花色苷构成比例的分布情况在一定程度上可以反映
不同黑大豆种质中各花色苷合成通路相关酶表达及活
性的差异。通过分析 60 份黑大豆种质中各花色苷组分
占总含量的百分比的分布情况（表 2）发现，Cy-3-glu
作为自然界中最常见的花色苷也是所有黑大豆种质中
质量百分比最高的花色苷组分，其含量在不同黑大豆
种质中占总花色苷含量的 48.77%—94.14%，种质间变
异系数仅 13.70%，而平均构成百分比居第二位的
Dp-3-glu 则是 6 种花色苷中构成百分比变幅和变异系
数最大的。
进一步对各花色苷构成百分比进行相关性分析
（表 3）发现，Cy-3-glu 与 Dp-3-glu 和 Pt-3-glu 的构
成百分比存在显著负相关关系，相关系数分别为-0.83
和-0.79，其 P 值均小于 0.001；同时 Dp-3-glu 还与
Pn-3-glu 的构成百分比呈显著负相关（r=-0.76，P＜
0.001）；而 Pn-3-glu 和 Mv-3-glu 间则呈较强的正相
关关系（r=0.52，P＜0.001）。
2.4 不同黑大豆种质种皮抗氧化活性及其与花色苷
总含量及各单体含量的相关性分析
本研究采用 ORAC 法分别测定了 60 份黑大豆种
质种皮提取液的抗氧化活性。从表 1 的结果可以看出，
其 ORAC 值分布范围为 221.5—1 834.6 μmol TE/g，不
同种质间差异较大，花色苷含量最高的大黑秧也是
ORAC 值最高的种质。目前用 ORAC 法测定黑大豆种
皮抗氧化活性的研究还比较少，尤其是对不同黑大豆
种质分析还未见报道。Xu 等[6]对单一黑大豆种皮的抗
氧化活性分析发现其 ORAC 值为 450μmol TE/g，远低
于本研究所得的各黑大豆种质的平均 ORAC 值（750.5
μmol TE/g）。
大量研究报道花色苷具有很强的抗氧化活性，因
此本研究对各种质总花色苷各单体花色苷含量与其
ORAC 值进行了相关性分析，结果如表 4 所示。由表
中可以看出，总花色苷含量与 ORAC 值呈显著正相关
关系，相关系数 r=0.62（P＜0.001），提示种皮提取
液中花色苷为其重要的抗氧化活性成分。进一步分析
各花色苷组分含量与种皮提取液ORAC值间的相关关
系表明，除 Dp-3-glu 和 Pt-3-glu 之外的其它 4 种花色
苷含量均与 ORAC 值呈显著正相关关系。
2.5 60 份黑大豆种质的聚类分析
大豆是优质蛋白质资源，大豆油中的 n-3 系列不
饱和脂肪含量高于花生油等其它多种植物油。黑大豆
作为较珍贵的一类大豆资源除具有上述优点外，种皮
中富含的花色苷类物质在大量的体外研究中显示具有
促进人体健康的生理活性。本研究以标准化转化后的
黑大豆种质的蛋白质和脂肪的质量百分比含量、种皮
24 期 张芳轩等：不同黑大豆种质资源种皮花色苷组成及抗氧化活性分析 5093
表
1
6
0份
黑
大
豆
种
质
脂
肪
、
蛋
白
质
、
种
皮
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0±
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56
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34
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1.
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±2
.2
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7.
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3.
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7.
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10
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±9
2.
6
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±9
.7
83
.9
±1
6.
5
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±5
.3
13
43
.3
±7
3.
5
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±2
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10
59
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±4
4.
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5096 中 国 农 业 科 学 43 卷
表 2 不同种类花色苷在黑大豆种质中的构成百分比分布
情况
Table 2 Distribution of anthocyanins percentage composition
in different black soybean varieties
花色苷种类
Anthocyanins
变幅
Range (%)
构成百分比
Percentage
composition (%)
变异系数
Coefficient of
variation (%)
Dp-3-glu 0－46.79 11.20±9.49 84.78
Cy-3-gal 0－2.06 0.67±0.40 59.87
Cy-3-glu 48.77－94.14 72.50±9.93 13.70
Pt-3-glu 0.33－17.95 8.23±3.45 41.95
Pn-3-glu 0.04－12.37 4.49±2.55 56.72
Mv-3-glu 0－9.40 2.90±2.08 71.52
总花色苷含量和 ORAC值 4 个营养和活性指标为聚类
变量，通过 K means 聚类法将 60 份黑大豆种质聚成了
3 类，各类的组成及营养、活性物质含量分布情况如
表 5。从表中可以看出，Ⅰ类为高脂肪黑大豆种质，
但其蛋白质含量、种皮花色苷含量及抗氧化活性都较
低；Ⅱ类为高脂肪高活性黑大豆种质，其花色苷含量
及抗氧化活性为 3 类中最高，脂肪含量也与Ⅰ类相当，
但其蛋白质含量较低，与Ⅰ类无显著性差异；Ⅲ类为
高蛋白黑大豆种质，其种皮花色苷含量虽与Ⅱ类相当，
但抗氧化活性显著性低于后者。
3 讨论
3.1 不同黑大豆种质种皮花色苷组成及含量分析
以往分析花色苷组成的研究多是通过核磁共振、
液质联用等波谱法对各组分分别进行鉴定，可以确保
各组分定性分析的准确性，然而此类分析方法的样品
前处理过程过于繁杂，无法用于大批量样品的花色苷
组成分析。同时，应用该分析方法的前提是需要通过
一系列的分离纯化过程，得到各花色苷组分的单体，
如果所分析的样品没有足够高的处理量，在经过多次
纯化的过程中含量较低的组分很难被检出。花色苷是
一类对光、温度、pH 等理化条件十分敏感的化合物，
表 3 不同黑大豆种质间各花色苷构成百分比的相关系数（前者）及Ｐ值（后者）
Table 3 The correlation coefficients (the former ones) and P (the latter ones) values between individual anthocyanins percentage
composition
Dp-3-glu Cy-3-gal Cy-3-glu Pt-3-glu Pn-3-glu
Cy-3-gal -0.04/0.77
Cy-3-glu -0.83/0.00 0.18/0.16
Pt-3-glu 0.38/0.00 -0.30/0.02 -0.79/0.00
Pn-3-glu -0.76/0.00 -0.06/0.66 0.05/0.00 -0.38/0.00
Mv-3-glu -0.30/0.02 -0.32/0.01 -0.26/0.05 0.03/0.85 0.52/0.00
表 4 不同黑大豆种质种皮各花色苷组分含量与种皮 ORAC 值的相关性
Table 4 Correlation between individual anthocyanins contents and the ORAC values of seed coats in 60 black soybean varieties
总花色苷 Total anthocyanins Dp-3-glu Cy-3-gal Cy-3-glu Pt-3-glu Pn-3-glu Mv-3-glu
P 值 0.00 0.82 0.00 0.00 0.11 0.00 0.01
r 值 0.62 -0.03 0.68 0.72 0.21 0.75 0.32
表 5 60 份黑大豆种质聚类信息及 3类间的方差分析结果（x±SD）
Table 5 Classification information of 60 black soybean varieties and ANOVA analysis of different groups (x±SD)
分类
Classification
种质数
Number
种质编号
Serial number
蛋白质含量
Protein content
(%)
脂肪含量
Lipids content
(%)
种皮花色苷含量
Total anthocyanins concent
in seed coats (mg/100g)
种皮 ORAC 值
ORAC of seed coats
(μmol TE/g)
Ⅰ 26 1,4,7,8,10,18,20,21,22,24,25,27,29,
31,32,34,37,41,42,47,48,52,55,56,5
7,58
40.9±2.0a 17.9±1.5b 422.5±224.8a 605.3±232.6a
Ⅱ 12 3,6,9,14,17,23,40,49,50,51,53,59 41.4±1.4a 17.5±1.3b 1047.2±378.0b 1176.0±279.4b
Ⅲ 24 2,5,11,12,13,15,16,19,26,28,30,33,
35,36,38,39,43,44,45,46,54,60
45.8±1.7b 16.2±1.1a 1028.7±333.5b 690.5±209.7a
数字后字母完全不同时，表示组间差异达显著性水平（P＜0.05） Means in a column without a common letter differ statistically (P＜0.05)
24 期 张芳轩等：不同黑大豆种质资源种皮花色苷组成及抗氧化活性分析 5097
分析的前处理过程越复杂，耗时越长，则越容易造成
花色苷分解，影响结果的准确性。以往同类研究中，往
往从黑大豆种皮中仅仅分离到 2－3 种花色苷[14-16]，纯
化过程中造成的低含量组分的丢失可能是重要的原因。
本研究利用花色苷类化合物在 505－530 nm 具有
特征吸收峰的特点，用 HPLC 标准品加入法直接对黑
大豆种皮花色苷的粗提液进行了测定，从 60 份黑大豆
种质的种皮中检测到 Cy-3-glu 等 6 种花色苷，很大程
度上简化了分析过程，适合大批量样品花色苷的分析
检测，且检测到的花色苷种类也多于绝大部分以前的
研究报道。
本研究所分析的 60 份黑大豆种质中，有 48 份检
测到 Cy-3-gal。在以往对黑大豆的研究报道中仅 Lee
等[21]在韩国黑大豆种质 Cheongja 3 中检测到有微量
Cy-3-gal 存在，在其它研究中均未见报道，可能与其
在大部分黑大豆种质中含量甚微有关。含量最高的黑
大豆种质大黑秧总花色苷含量高达 2 132.5 mg/100g，
与目前可检索到的韩国（20.18 mg·g-1）[14]、日本（20.4
mg·g-1）[13]等国家黑大豆种质花色苷含量的最高结果
接近，其含量远高于人们通常所认为的高花色苷来源
物质—蓝莓[（720±50）mg/100g 干物质][22]，是花色
苷的丰富来源。且其 Cy-3-glu 含量高达 1 617.4
mg/100g，可用作分离制备该花色苷的原料。本研究
结果表明，Cy-3-glu 在各种质中均是含量最高的组分，
这与以往的检测结果相一致，但不同种质间 Cy-3-glu
含量仍有较大差异（48.77%—94.14%）。其中超过总
花色苷含量 90%的只有 3 个种质，这与 Kim 等[15]报道
的来自韩国的 5 个黑大豆种质 Cy-3-glu 含量均占总含
量 90%以上有较大差别。
3.2 黑大豆种质种皮花色苷构成比及含量影响因子
不同黑大豆种质间花色苷合成酶表达及活性水平
的基因型差异是造成花色苷含量及构成比差异的主要
原因。如前所述，植物体内相同的底物在不同的花色
苷合成酶的催化作用下分别进入矢车菊素及其糖苷和
飞燕草素及其糖苷的合成通路，前者可经酶促反应转
化为芍药素及其糖苷，而后者则是矮牵牛素和锦葵素
及其糖苷的前体[23]。对照 2.3 各花色苷构成百分比的
相关性分析结果可以发现，Cy-3-glu 的构成百分比与
飞燕草素合成通路中的 Dp-3-glu 和 Pt-3-glu 的构成百
分比呈显著负相关；同样，Dp-3-glu 的构成百分比与
矢车菊素合成通路中的 Cy-3-glu 和 Pn-3-glu 的构成百
分比呈显著负相关。即通向两条合成通路的不同花色
苷合成酶对相同底物的竞争是造成这一负相关关系的
重要原因。
鉴于植物体内存在以相同物质为底物的两条不同
的花色苷合成通路，不同黑大豆种质种皮各花色苷组
分构成百分比的差异提示黑大豆种质间各花色苷合成
酶存在基因型的差异。
大量研究表明，植物花色苷的生成水平明显受到
光照等外界环境因子的影响。本研究分析的 60 份黑大
豆种质播种期分为春、夏两季，对两个不同播种期的
种质资源进行 t 检验发现，夏播品种种皮花色苷含量
显著高于春播品种（1 042.0 mg/100g vs 575.1 mg/100g，
P＜0.001）。进一步对各种质花色苷含量与其生育期
进行相关分析，结果表明两者呈显著正相关（r=0.41, P
＜0.001），且夏播种质的生育期显著长于春播种质
（138.2 d vs 116.2 d, P＜0.001），提示夏播种质的生
育期较长，可能是其较春播种质含有更高水平种皮花
色苷的重要因子。
此外，本研究所分析的夏播黑大豆种质的繁种地
均为云南省，而春播种质分别产自山西省和黑龙江省。
云南省属于中国低纬度高海拔地区，其平均日照时间
较长，是中国紫外线辐射最强的省份之一。紫外线照
射可以明显提高花色苷合成酶的催化活性[21,24]，是促
进植物合成花色苷的重要因子。Reddy 等[25]研究发现，
阳光中的紫外线是促进黑米幼秧苗中花色苷合成的必
要因子。由此可见，除基因型差异外，日照时间和紫
外线强度等因子也可能是造成各种质花色苷含量差异
的重要原因。
3.3 黑大豆种质的抗氧化活性与花色苷含量的关系
与 DPPH 自由基清除能力、ABTS、FRAP 等体外
抗氧化活性分析方法属于单电子转移机制不同，
ORAC 法自由基清除机制为抑制氢原子的转移而终止
自由基的链式反应，与生命现象中的自由基具有高度
的一致性[26]，故而自 1993 年问世以来，被广泛应用
于大量的抗氧化活性研究中。同时该方法采用了统一
的抗氧化标准物质 Trolox 为参照，使得不同实验室的
研究结果间具有较好的可比性。本研究测得的各黑大
豆种质种皮 ORAC 平均值为 750.5 μmol TE/g，最高可
达 1 835.6 μmol TE/g，远高于产自台湾、美国等地黑
大豆的 ORAC 水平[6,27]。
不同黑大豆种质种皮花色苷含量与其ORAC值相
关性分析发现其相关系数为 0.62，尽管结果提示两者
间有较强的相关性，但与徐金瑞等[16]研究发现的黑大
豆种皮抗氧化活性与其总酚含量相关系数达 0.915 有
较大差距。产生上述差距的原因：一方面与两项研究
5098 中 国 农 业 科 学 43 卷
采用了不同的抗氧化活性测定方法有关，同时也提示
在黑大豆种皮中除了花色苷外，还存在其它具有抗氧
化活性的多酚类物质。Xu 等[6,27]已从中检测到原花青
素、多种酚酸类物质和异黄酮等多酚类物质，这些物
质在不同黑大豆种质中的含量以及其对抗氧化活性的
贡献，有待进一步研究。
各花色苷组分含量与ORAC值相关关系分析结果
表明，Cy-3-glu与ORAC值呈显著正相关关系（r=0.72，
P＜0.001）。Cy-3-glu 是各黑大豆种质中含量最高的
花色苷组分，也是自然界抗氧化活性最强的花色苷种
类之一，上述结果表明 Cy-3-glu 是黑大豆种皮中主要
的抗氧化组分。尽管 Cy-3-gal 含量与 ORAC 也呈正相
关关系，但其含量占总花色苷含量最高只有 2.06%，
且未见关于该花色苷的抗氧化活性特别高于其它花色
苷的研究报道，因此尚不能认为该组分是黑大豆种皮
主要的抗氧化活性成分。不同黑大豆种质 Cy-3-gal 与
Cy-3-glu 含量间的强正相关关系（r=0.81，P＜0.001）
是造成 Cy-3-gal 与 ORAC 间相关关系的主要混杂因
子。此外，Dp-3-glu 和 Pt-3-glu 是仅次于 Cy-3-glu 的
黑大豆种皮中含量较高的花色苷组分，且有研究发现
Dp-3-glu 具有强于 Cy-3-glu 的自由基清除活性[28-29]。
但根据上述相关性分析结果，两者的含量与 ORAC 间
无相关关系。结合前述 Cy-3-glu 与这两种花色苷占总
花色苷的构成百分比间显著的负相关关系，不难理解
在同一黑大豆种质中 Cy-3-glu 与这两种花色苷因合成
过程中竞争相同底物所致的此消彼长的关系使得含量
相对较低的 Dp-3-glu 和 Pt-3-glu 的抗氧化活性为含量
较高的 Cy-3-glu 所掩盖，因而未呈现相关关系。
3.4 60 份黑大豆种质的聚类分析
本研究结合黑大豆蛋白质、脂肪等主要营养成分
含量及其种皮总花色苷含量和抗氧化活性ORAC值对
受试黑大豆种质进行了聚类分析，将 60 份黑大豆种质
聚成了营养及活性特征差别显著的三大类。其中Ⅱ类
具有最高的种皮总花色苷含量和抗氧化活性，但蛋白
质含量较低，而Ⅲ类则是蛋白质含量最高的一类。不
同类别间营养及活性成分的差异体现了各类别间明显
的基因型差异。这一聚类结果可以为以培育高营养和
（或）高活性黑大豆种质为目的的育种研究工作提供
指导。
4 结论
本研究通过 HPLC 法从 60 份黑大豆种质种皮中
检测到 Dp-3-glu、Cy-3-gal、Cy-3-glu、Pt-3-glu、
Pn-3-glu、Mv-3-glu 共 6 种花色苷。不同黑大豆种质
间各单体花色苷、总花色苷含量以及抗氧化活性存在
明显的基因型差异。Cy-3-glu 在各品种中均为含量最
高的花色苷组分。大黑秧是总花色苷和 Cy-3-glu 含量
最高的黑大豆种质（2 132.5 mg/100g 和 1 617.4
mg/100g）。不同黑大豆种质种皮花色苷含量与其
ORAC 值呈显著正相关关系（r=0.62，P＜0.001）。
60 份黑大豆种质通过聚类分析分成高脂肪、高脂肪高
活性和高蛋白等 3 种不同类型。
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（责任编辑 曲来娥）