全 文 ：第 30卷第 10期
2010年 10月
环　境　科　学　学　报
　ActaScientiaeCircumstantiae
Vol.30, No.10
Oct., 2010
基金项目:国家博士后特别资助基金项目(No.200902093)
SupportedbytheNationalScienceFoundationforPost-doctoralScientistsofChina(No.200902093)
作者简介:崔长征 (1978—),男 ,助理研究员(博士);＊通讯作者(责任作者), E-mail:cuichangzheng@ecust.edu.cn
Biography:CUIChangzheng(1978—), male, assistantresearcher(Ph.D.);＊Correspondingauthor, E-mail:cuichangzheng@ecust.edu.cn
崔长征 , 沈萍 , 张甲耀 ,等.2010.PseudomonasaeruginosaW3产鼠李糖脂的结构表征及理化性质 [ J] .环境科学学报 , 30(10):2030-2034
CuiCZ, ShenP, ZhangJY, etal.2010.StructuralandphysicochemicalcharacterizationofrhamnolipidsproducedbyPseudomonasaeruginosaW3 [ J] .
ActaScientiaeCircumstantiae, 30(10):2030-2034
PseudomonasaeruginosaW3产鼠李糖脂的结构表征
及理化性质
崔长征 1, ＊ , 沈萍2 , 张甲耀 3 ,冯耀宇 1
1.华东理工大学资源与环境工程学院 国家环境保护化工过程环境风险评价与控制重点实验室上海 200237
2.武汉大学生命科学学院 武汉 430072
3.武汉大学资源与环境科学学院 武汉 430072
收稿日期:2010-01-29　　　修回日期:2010-04-08　　　录用日期:2010-06-01
摘要:利用液相色谱 /质谱联用仪(HPLC-ESI-MS)分析了石油降解菌PseudomonasaeruginosaW
3
以甘露醇为碳源所产鼠李糖脂生物表面活性剂
的组成.结果表明 ,所产鼠李糖脂共检出 6种主要的鼠李糖脂同系物 ,均由 1～ 2个鼠李糖分子和 1 ～ 2个含 β羟基的碳链长度为 8 ～ 12的饱和
或不饱和脂肪酸分子构成 ,其主要组分的m/z为 649.6和 621.5,对应的结构是 RhaRhaC10C10和 RhaRhaC8C10 ,分别占总检出物质量的 57%和
15.5%.该鼠李糖脂混合物中双鼠李糖脂的含量达到 90%,是目前报道的双鼠李糖脂含量较高的菌株之一.该糖脂类生物表面活性剂可将水
的表面张力从 71.4mN·m-1降到 30.5mN·m-1 ,临界胶束浓度为 48mg·L-1 ,在高温 、高盐度及高 pH等极端环境下 ,仍能保持较高的表面活
性和乳化能力 ,在生物修复中具有潜在应用价值.
关键词:生物表面活性剂;鼠李糖脂;双鼠李糖脂;Pseudomonasaeruginsa
文章编号:0253-2468(2010)10-2030-05　　　中图分类号:X131　　　文献标识码:A
Structuralandphysicochemicalcharacterizationofrhamnolipidsproducedby
PseudomonasaeruginosaW3
CUIChangzheng1, ＊ , SHENPing2 , ZHANGJiayao3 , FENGYaoyu1
1.StateEnvironmentalProtectionKeyLaboratoryofEnvironmentalRiskAssessmentandControlonChemicalProcess, SchoolofResourcesand
EnvironmentalEngineering, EastChinaUniversityofScienceandTechnology, Shanghai200237
2.ColegeofLifeScience, WuhanUniversity, Wuhan430072
3.ColegeofResourceandEnvironmentalScience, WuhanUniversity, Wuhan430072
Received29January2010;　　　receivedinrevisedform 8April2010;　　　accepted1June2010
Abstract:ThecompositionofrhamnolipidbiosurfactantsproducedbyPseudomonasaeruginosaW3 usingmannitolasacarbonsourcewasanalyzedby
liquidchromatography/massspectrometry.Sixrhamnolipidhomologswereidentified, withstructuresconsistingofoneortworhamnosemoleculeslinkedto
oneortwoβ-hydroxyfatyacidswithsaturatedorunsaturatedalkylchainsbetweenC8 andC12.ThetwomajorcomponentsareRhaRhaC10C10(57%)and
RhaRhaC
8
C
10
(15.5%), withm/zof649.6and621.5, respectively.Theconcentrationofdi-rhamnolipidintheproductcanreachashighas90%, one
ofthehighestratiosintheliterature.Therhamnolipidproductcanreducethesurfacetensionofwaterfrom 71.4mN·m-1 to30.5mN·m-1 , witha
criticalmiceleconcentration(CMC)of48mg·L-1.Italsodemonstratedhighemulsifyingactivityandgoodthermal, pHandsaltstability, exhibiting
potentialforbioremediation.
Keywords:biosurfactant;rhamnolipid;di-rhamnolipid;Pseudomonasaeruginosa
1　引言(Introduction)
鼠李糖脂具有增溶 、乳化 、消泡 、降低表 /界面
张力 、分散与絮凝 、抗静电和润滑等多种功能 ,同时
还具有表面活性高 、低毒 、可自然生物降解等特性 ,
是研究较深入的生物表面活性剂之一 ,在石油开
DOI :10.13671/j.hjkxxb.2010.10.001
10期 崔长征等:PseudomonasaeruginosaW3产鼠李糖脂的结构表征及理化性质
采 、食品 、医药 、化妆品等领域具有极大的潜在应用
价值(Banatetal., 2000;VanHammeetal., 2006;
Singhetal., 2007).近年来 ,鼠李糖脂在生物修复
重金属 、持久性有机污染物等污染场地中的应用备
受关注 (Muliganetal., 2006;Palashpriyaetal.,
2008).
鼠李糖脂是由单鼠李糖脂 (mono-rhamnolipid)
和双鼠李糖脂(di-rhamnolipid)组成的混合物 ,其亲
水基团一般由 1 ～ 2个鼠李糖分子构成 ,憎水基团由
1 ～ 2个不同碳链长度的脂肪酸分子构成(Soberón-
Chávezetal., 2005;Yinetal., 2009).单鼠李糖脂
和双鼠李糖脂的合成分别由不同基因编码的转移
酶起决定作用 ,单鼠李糖脂的合成是通过 rhlAB基
因编码的鼠李糖甙转移酶 1(rhamnosyltransferase1)
催化 dTDP-L-鼠李糖和 β-羟基癸酰-β-羟基癸酸结合
而成 ,双鼠李糖脂是通过 rhlC基因编码的鼠李糖甙
转移酶 2 (rhamnosyltransferase2)催化 dTDP-L-鼠李
糖加到单鼠李糖脂上而成(Ochsneretal., 1996;
Rahimetal., 2001).与单鼠李糖脂相比 ,双鼠李糖
脂具有更低的临界胶束浓度 ,更好的生物可利用
性 ,并在促进持久性有机污染物污染场地修复中发
挥更大的作用 (Zhangetal., 1997;Mata-Sandoval
etal., 1999;Dézieletal., 1999).同时 ,双鼠李糖脂
也是治疗皮肤病等药物的重要组成部分(Stipcevic
etal., 2006).但目前大多已报道的菌株所分泌的
鼠李糖脂中 ,双鼠李糖所占比例通常不高 (梁康生
等 , 2005;Yinetal., 2009).Wei等(2008)研究发
现 ,通过发酵培养基优化能够显著提高双鼠李糖脂
含量 ,而且从环境中筛选优良菌株仍是提高双鼠李
糖脂含量的有效方法.
因此 ,本研究利用 HPLC-ESI-MS分离并鉴定石
油降解菌 PseudomonasaerugionsaW3以甘露醇为碳
源所产鼠李糖脂的组分 , 并研究其主要理化性质 ,
以期为该种鼠李糖脂的应用提供参考.
2　材料和方法(Materialsandmethods)
2.1　菌种和培养基
PseudomanasaeruginosaW3 (其 16SrDNA的
GenBank数据库序列号为 FJ786006)分离自武汉青
山石油化工厂附近被石油长期污染的土壤 , 于
-20℃甘油管中保存(Cuietal., 2008).
发酵培养基 (g·L-1):KH2PO4 0.7, Na2HPO4
0.9, NaNO3 2, MgSO4·7H2O0.4, CaCl2·2H2O0.1 ,
甘露醇 20;微量元素溶液 2mL, pH=6.7 (Siegmund
etal., 1991).其 中 , 微 量 元 素 为 (g·L-1 ):
FeSO4·7H2O2, MnSO4·H2O1.5, (NH4)6Mo7O24·4H2O
0.6.在 30℃、180 r·min-1条件下振荡培养 ,不同时
间取发酵液离心 ,弃上清 ,并用等体积生理盐水重
悬菌体 ,采用比色法测定培养液的 OD600.
蓝色凝胶鉴定培养基(g·L-1):发酵无机盐培
养基的基础上补加 0.2 g十六烷基三甲基溴化铵
(CTAB), 0.005 g亚甲基蓝 , 15 g琼脂粉(Siegmund
etal., 1991).
2.2　鼠李糖脂的提取
将发酵培养基在 5000 r·min-1下离心 10 min,
并用 0.22μm的醋酸纤维素膜过滤上清液 ,除去部
分菌体和绿脓素 ,滤液用 6 mol·L-1的盐酸调节至
pH=2.0 ,加入等体积乙酸乙酯萃取两次 ,合并有机
相 ,用无水 Na2SO4干燥 , 40℃旋转蒸发除去有机溶
剂 ,得到的浅黄色浆状物为表面活性剂的粗产物.
将 0.5 g该物质溶于 0.05mol·L-1的 NaHCO3溶液 ,
用 6 mol·L-1的盐酸调节至 pH=2.0, 静置过夜 ,
8000 r·min-1离心 5 min,收集的沉淀物经冷冻真空
干燥后 ,即为鼠李糖脂提取物 RLW3.将 RLW3溶于 5
mL的乙腈 /水 (体积比为 5∶5)混合试剂中 , 12000
r·min-1离心 10 min,并经 0.15 μm滤膜过滤后用于
鼠李糖脂的组分分析.
2.3　提取物的 HPLC-ESI-MS分离和鉴定
仪器为 Agilent1100 SeriesLC/MSDTrap,色谱
条件:色谱柱为 AgilentZorbaxSB-C18 (2.1 mm×
150 mm,粒径为 5 μm),流动相为乙腈 /水混合液 ,
采用线性梯度洗脱 ,先在 φ(乙腈)=10%条件下保
持 3min, 然后在 3 ～ 33min内由 φ(乙腈)=10%线
性升到 φ(乙腈)=90%, 并保持 30 min, 流速为
0.25 mL·min-1 ,进样量为 2 μL.质谱条件:ESI源 ,
采用全扫描一级质谱 (fulscan),选择离子全扫描
二级质谱(fulscanMS2),扫描范围 100 ～ 800 (m/
z),电喷雾毛细管喷口电离电压 4.5kV,毛细管温度
350℃,碰撞气体为氮气 ,检测方式为负离子模式.
2.4　表面张力测定
表面张力测定采用板法(platemethod)测定 ,仪
器为 KrǜssK100 (Germany).称取纯化后的生物表
面活性剂 RLW3 0.5 g,溶解在 250 mL超纯水或无
机盐培养基中 ,制成生物表面活性剂母液 ,制成不
同浓度的表面活性剂.向测量杯中准确加入 25 mL
无机盐培养基 ,并加入一定体积的生物表面活性剂
2031
环　　境　　科　　学　　学　　报 30卷
母液 , 30℃平衡 5min,测量其表面张力 ,共计 6次读
数 ,最后记录 6次平均值 ,即为该浓度表面活性剂的
表面张力.
2.5　乳化能力测定
在带刻度试管中加入 5mL液体石蜡和 5mL糖
脂水溶液 ,于 100 W条件下超声处理 30 min,定时
测定乳化相的体积变化 ,以乳化相体积与总体积之
比(乳化指数 , E24)表示乳化性能.相同条件下 3次
重复取平均值.
2.6　糖脂含量测定
糖脂含量以硫酸-苯酚法测定 ,将鼠李糖脂发酵
培养基在 5000 r·min-1下离心 10 min,并用 0.22
μm的醋酸纤维素膜过滤上清液 ,然后取 1.0 mL上
清液 ,分别加入 1.0 mL乙醚 ,振荡器振荡 1 min,静
置 2min,缓慢吸取上层液置于 4.5mL的离心管中 ,
重复抽提 2次 ,合并提取液 ,通风橱内蒸发掉乙醚.
加入 1.0mL0.05 mol·L-1 pH=8.6NaHCO3溶解残
余物 ,加入 1.8 mL质量分数 0.19%的 3, 5-二羟基
甲苯 (溶于 53% H2 SO4中),对照为 1.0 mL0.05
mol·L-1 pH=8.6 NaHCO3和 1.8 mL3, 5-二羟基甲
苯混合液.80℃水浴 30 min,室温冷却 15 min,用紫
外分光光度计于 421 nm处比色测其吸光值.根据鼠
李糖的标准曲线将读数转换成鼠李糖的浓度 ,再乘
以系数即为得到的鼠李糖脂浓度.
3　结果(Results)
3.1　PseudomanasaeruginosaW3菌株摇瓶发酵动态
PseudomanasaeruginosaW3能够在蓝色凝胶鉴
定培养基的菌落周围产生深蓝色晕圈 ,初步确定该
菌合成的生物表面活性剂为鼠李糖脂.摇瓶发酵
培养过程中菌体的生长曲线(以 OD600表征)、相应
培养液中的糖脂含量 、pH值的变化曲线如图 1所
示.图 1结果显示 ,随着菌株生长 ,培养液 pH开始
升高并在菌体生物量最大时增至最高(pH=8.4),
随后逐渐降低.鼠李糖脂的生成滞后于菌体的生
长 ,在菌体生长进入稳定期时快速增长 ,糖脂的质
量浓度最高可达 9.5 g·L-1 ,这表明提取鼠李糖脂
的最佳时期是菌株生长稳定期的中期.
图 1　PseudomonasaeruginosaW3的摇瓶发酵动态
Fig.1　TimecourseofrhamnolipidsproducedbyPseudomonas
aeruginosaW3 cultivatedat30℃ inaeratedculturewith
mannitolascarbonsource
3.2　鼠李糖脂提取物中各组分的分离与鉴定
图 2为 PseudomonasaeruginosaW3所产鼠李糖
脂 HPLC-ESI-MS分析的总离子流图 ,表 1为各组分
的分子离子峰 、保留时间及相对含量.表 1结果显
示 ,该提取物中主要含有 6种鼠李糖脂同系物 ,由 1
～ 2个鼠李糖分子和 1 ～ 2个含 β羟基碳链长度为 8
～ 12的脂肪酸分子组成 ,其中 , 1种组分含有不饱和
脂肪酸.质谱分析结果显示 ,其主要成分的 m/z为
649.6和 6 2 1.5 , 对应的结构是 RhaRhaC10 C10和
图 2　PseudomonasaeruginosaW3所产鼠李糖脂同系物 HPLC-ESI-MS分析的总离子流图
Fig.2　HPLC-ESI-MStotalionchromatogramofthePseudomonasaeruginosaW3 rhamnolipidhomologueextract
2032
10期 崔长征等:PseudomonasaeruginosaW3产鼠李糖脂的结构表征及理化性质
RhaRhaC8C10 , 质量分数分别占总检出物质量的
57%和 15.5%.PseudomonasaeruginosaW3是目前报
道合成双鼠李糖脂含量较高的菌株之一 ,双鼠李糖
脂含量达到约 90%.
表 1　假单胞菌 W3所产鼠李糖脂同系物中各组分的结构及相对
含量
Table1　Chemicalstructuresandrelativeabundanceofrhamnolipid
homologuesproducedbyPseudomonasaeruginosaW3
糖脂结构 保留时间 /min m/z 质量分数
RhaRhaC8C10 25.5 621.5 15.5%
RhaC8C10 27.8 476.8 0.9%RhaRhaC10C10 28.6 649.6 57.4%
RhaRhaC10C12∶1 30.5 675.6 7.6%RhaC10C10 31.5 503.6 9.3%
RhaRhaC10C12 32.0 677.7 8.4%
　　注:Rha表示一个鼠李糖脂分子;Cn表示一个碳链长度为 n的
烷基脂肪酸分子;Cn:1表示一个碳链长度为 n的含一个不饱和键的
烷基脂肪酸分子.
3.3　理化性质
3.3.1　表面张力与临界胶束浓度　将纯化后的
RLW3配成 400mg·L-1的超纯水或无机盐培养基溶
液 ,在 30℃测定不同浓度鼠李糖脂的表面张力 ,绘
制浓度与表面张力的对数曲线 ,结果如图 3所示.由
图 3可知 ,随着鼠李糖脂浓度的增加 ,溶液的表面张
力从 71.4 mN·m-1开始明显降低 , 浓度为 48
mg·L-1时 ,表面张力降到最低值 30.5 mN·m-1.当
样品浓度继续升高时 ,溶液的表面张力不再降低 ,
基本维持在 30.5mN·m-1左右 ,表明该表面活性剂
图 3　PseudomonasaeruginosaW3产生生物表面活性剂的
CMC测定
Fig.3　Criticalmiceleconcentrationofthebiosurfactantproduced
byPseudomonasaeruginosaW3
的 CMC值为 48 mg·L-1.而常用的化学合成表面活
性剂和已报道的微生物合成的鼠李糖脂的 CMC值
分别为:十二烷基磺酸钠(SDS)2120 mg·L-1 ,十六
烷基三甲基溴化铵 (CTAB)1300 mg· L-1和
PseudomonasaeruginosaS2分泌的鼠李糖脂 250
mg·L-1(任洁等 , 2009).因此 , 该鼠李糖脂提取物
的 CMC明显低于一般合成的化学表面活性剂和部
分已报道的生物表面活性剂 ,具有更高的表面活性.
3.3.2　温度 、盐度 、pH值对鼠李糖脂稳定性的影响
为研究菌株 PseudomonasaeruginosaW3所产鼠李糖
脂 RLW3对温度 、盐度 、pH值的稳定性 ,将质量浓度
为 50 mg·L-1的鼠李糖脂溶液在不同条件下处理
后 ,测定其表面活性和乳化能力(图 4).加热RLW3
图 4　温度(a)、盐度(b)、pH值(c)对RLW
3
稳定性影响
Fig.4　Efectoftemperature(a), osmolarity(b)andpH(c)onthestabilityofthebiosurfactantsproducedbyPseudomonasaeruginosaW3
2033
环　　境　　科　　学　　学　　报 30卷
至不同温度并保持 30 min,冷却至 30℃后测量其表
面张力和乳化能力 ,图 4a结果表明 , RLW3溶液在
121℃保持 30 min后 , 其表面张力仍为 30.5
mN·m-1 ,乳化能力为 65%,说明在此温度下可保持
其表面活性和乳化能力.在 RLW3溶液中加入一定
量的 NaCl, 30℃时测量其表面张力和乳化能力(图
4b),结果表明 , 10%的盐度溶液对 RLW3溶液表面
活性无影响 ,但随着盐浓度的增加 ,能够略微抑制
RLW3溶液的乳化能力.用稀盐酸或氢氧化钠溶液调
整 RLW3溶液至不同的 pH值 ,测定其表面活性和乳
化能力(图 4c),结果表明 ,在 pH=4 ～ 10范围内基
本上保持表面活性稳定 ,当 pH小于 3时会使表面
活性迅速降低 ,这可能是低 pH值造成鼠李糖脂沉
淀 ,同时会显著降低乳化能力.
4　结论(Conclusions)
1)PseudomonasaeruginosaW3以甘露醇为碳源
能够合成 6种主要的鼠李糖脂同系物 ,均由 1 ～ 2个
鼠李糖分子和 1 ～ 2个含 β羟基碳链长度为 8 ～ 12
的饱和或不饱和脂肪酸分子构成 ,其主要成分的
m/z为 649.6和 621.5,对应的结构是 RhaRhaC10C10
和 RhaRhaC8C10 ,质量分数分别占总检出物质量的
57%和 15.5%.
2)鼠李糖脂混合物中双鼠李糖脂的含量达到
90%,是目前报道双鼠李糖脂含量较高的菌株之一 ,
且具有很强的表面活性 ,可将水的表面张力从 71.4
mN·m-1降到 30.5 mN·m-1 ,其临界胶束浓度为 48
mg·L-1.
3)在高温 、高盐度及高 pH等极端环境下 ,该鼠
李糖脂仍具有较高的表面活性和乳化能力 ,在生物
修复中具有潜在应用价值.
责任作者简介:崔长征 (1978—), 男 ,助理研究员 , 研究方向
为 持 久 性 有 机 污 染 物 的 生 物 降 解 研 究. E-mail:
cuichangzheng@ecust.edu.cn.
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