全 文 ：第 4卷　第 6期 环境 工 程学 报 Vol.4 , No.6
2 0 1 0 年 6 月 ChineseJournalofEnvironmentalEngineering Jun.2 0 1 0
二鼠李糖脂对白腐菌降解稻草中
木质纤维素的影响
胡晨璐　袁兴中＊　曾光明　梁运姗　赵佳佳　蒋荣清
(湖南大学环境科学与工程学院 , 长沙 410082)
摘　要　通过固态发酵方式采用白腐菌对稻草中木质纤维素进行降解 , 并研究了生物表面活性剂二鼠李糖脂对该降
解过程的影响。结果表明 , 不同浓度的二鼠李糖脂能在不同程度上提高降解过程水溶性有机碳的含量 , 添加 0.007%和
0.021%二鼠李糖脂的实验组最高 TOC(totalorganiccarbon)浓度较对照组分别提高了 83.6%和 54.5%, 这有利于黄孢原
毛平革菌的生长 , 且延缓了菌体的衰退。添加临界胶束浓度 0.007%和 0.021%浓度的二鼠李糖脂可使 LiP(ligninperoxi-
dase)酶活分别提高 85.7%和 41.2%, 二鼠李糖脂对 MnP(manganeseperoxidase)酶活没有显著影响。生物表面活性剂的介
入促进了白腐菌对稻草中木质素的降解 , 添加 0.007%二鼠李糖脂可使木质素降解率提高 54%。
关键词　生物表面活性剂　二鼠李糖脂　木质素　降解　白腐菌
中图分类号　X705　　文献标识码　A　　文章编号　1673-9108(2010)06-1394-05
Effectsofdirhamnolipidondegradationofstraw
lignocelulosebywhiterotfungi
HuChenlu　YuanXingzhong　ZengGuangming　LiangYunshan　ZhaoJiajia　JiangRongqing
(ColegeofEnvironmentalScienceandEngineering, HunanUniversity, Changsha410082, China)
Abstract　Theefectofdirhamnolipidbiosurfactantondegradationofstrawlignocelulosebywhiterotfungi
insolidstatefermentationwasstudied.Theresultsshowedthatdirhamnolipidatdiferentconcentrationswasable
toenhancethelignindegradation.Dirhamnolipidat0.007% and0.021% (w/w)increasedthereleasedwater
solubletotalorganiccarbon(TOC)by83.6% and54.5%, respectively, whichprovidedanopportunityofin-
creasingthegrowthofPhanerochaetechrysosporiumanddecreasingitsdegeneration.Inaddition, themaximum
activityofligninperoxadase(LiP)wasincreasedby85.7% withdirhamnolipidat0.007% (w/w).Whereas,
dirhamnolipidhavenostimulativeefectsonmanganeseperoxidase(MnP)activity.Thedegradationrateoflig-
ninwasincreasedby54% withrhamnolipidat0.007% (w/w)comparedtothecontrol.
Keywords　biosurfactant;dirhamnolipid;lignin;degradation;whiterotfungi
基金项目:国家自然科学基金资助项目(50678062)
收稿日期:2009-06-16;修订日期:2009-08-01
作者简介:胡晨璐(1985～ ), 女 ,硕士研究生 ,主要研究方向为生物
表面活性剂促进堆肥中木质纤维素降解的研究。
E-mail:huchenlu@163.com
＊通讯联系人 , E-mail:yxz@hnu.cn
　　木质素是大量存在于自然界的芳香类高聚物 ,
在所有木本植物的细胞壁中通过形成交织网使细胞
相连 , 来硬化细胞壁 , 起到粘合剂的作用 [ 1] 。它像
其他大多数天然聚合体一样具有各种生物学稳定的
复杂键型而不易被酶水解[ 2] 。白腐菌是最有效的
木质素降解菌 , 可产生有效的木质素降解酶类 ,对
木质素有很强的降解能力 [ 3] 。
已有的许多研究表明 , 添加一定量的表面活性
剂 [ 4 ～ 6]可促进纤维素分解菌产纤维素酶 , 从而有效
促进纤维素的分解。表面活性剂是能够降低溶剂表
面张力的物质 ,其分子结构一般由极性和非极性基
团构成 。而目前多数研究仍局限于化学表面活性剂
的应用 。许多化学合成表面活性剂由于难降解 、有
毒及在生态系统中的积累等性质而破坏生态环境 。
相比之下 , 生物表面活性剂则由于易生物降解 、对
生态环境无毒等特性而更适用于环境污染的治
理 [ 7 ～ 9] 。对于在固态发酵条件下 , 添加生物表面活
性剂以促进微生物降解木质素的过程 ,国内外仍鲜
见报道 。
本研究采用白腐菌固态发酵降解稻草的方法 ,
选取生物表面活性剂二鼠李糖脂添加到反应中 , 通
过分析表面活性剂对木质素过氧化物酶 , 锰过氧化
第 6期 胡晨璐等:二鼠李糖脂对白腐菌降解稻草中木质纤维素的影响
物酶 , 溶解性有机碳 , 木质素降解率等参数的影
响 , 考察二鼠李糖脂作用下微生物降解木质素的特
性 , 以期为进一步探讨生物表面活性剂在木质纤维
素类基质降解过程中的应用和作用机制提供更多依
据 , 对于提高稻草等废木质纤维素的利用率以及减
少生产过程对环境的污染具有积极意义。
1　材料与方法
1.1　菌种来源
实验选用的菌种为白腐菌的典型种黄孢原毛平
革菌 (PhanerochaetechrysosporiumBKMF-1767), 购
自武汉大学中国典型培养物中心。
1.2　菌悬液的制备
菌种接种在马铃薯(PDA)琼脂培养基上 ,待培
养 5 ～ 7 d长满孢子后 ,刮取孢子制成浓度为 2.0×
10
6个 /mL的孢子悬液。
1.3　二鼠李糖脂的制备
生物表面活性剂鼠李糖脂由铜绿假单胞菌
(Pseudomonsaaeruginosa)CCTCCAB93066产生 , 根
据 Liu等 [ 10]的方法制取粗鼠李糖脂。
采用带活塞的层析柱对萃取法得到的粗制的鼠
李糖脂生物表面活性剂进行纯化 [ 11] ,得到固体产物
二鼠李糖脂(Dirhamnolipid, DiRh)。
1.4　固态发酵方法
将稻草洗净 、烘干后用 DWF2100型电动植物粉
碎机粉碎 , 过 40目筛 , 备用 。
一共设置 4个实验组 , 各实验组称取 15g干稻
草粉为固体基质 ,装于相应 250 mL锥形瓶中 , 1组
用液体基质来润湿并设为对照堆组 , 另外 3组分别
用溶有 0.003%、 0.007%、0.021%和 0.042%的二
鼠李糖脂的液体基质润湿 , 灭菌。每组接种孢子
2.0×106个 /mL。实验组初始含水率控制在 80%。
放入 30℃的恒温培养箱静置培养。分别在 4、8、12、
16、20、24、28和 32 d取样 。实验结果均为 3个平行
样的平均值 , 3个平行样间的最大偏差不超过 5%。
本实验采用液体基质组成成分为:VB1 0.001
g/L,酒石酸铵 0.2 g/L, MgSO4· 7H2O0.05 g/L,
KNO3 1.4858 g/L, 葡萄糖 1 g/L, 微量元素液 70
mL/L, pH值自然 。其中微量元素液的成分为:
NaCl1 g/L, CoCl2 · 6H2O0.18 g/L, Na2MoO4 ·
2H2O0.01 g/L, ZnSO4 · 7H2O0.1 g/L, CaCl2 0.1
g/L, CuSO4· 5H2O0.01 g/L, MnSO4·H2O0.5 g/
L, FeSO4 · 7H2O 0.1 g/L, AlK(SO4)2 · 12H2O
0.01g/L, MgSO4· 7H2O3 g/L, H3BO3 0.01 g/L,
NTA(氨基乙酸)1.5 g/L。
1.5　参数测定
在无菌条件下取 2g固体样品 , 于 100 mL的锥
形瓶中用 20 mL蒸馏水溶解 , 置振荡器上以 200 r/
min振荡 1 h, 从而将酶从固体基质上提取出来 。
振荡结束后 , 将锥形瓶中的混合物转移到 50mL的
离心管中 , 8 000 r/min离心 10 min,上清液即为粗
酶液 ,残渣用于测定稻草中木质纤维素的含量 。
木素过氧化物酶(ligninperoxidase, LiP)活性采
用藜芦醇法 [ 12]测定 。
锰过氧化物酶 (manganeseperoxidase, MnP)活
性采用 Rogalski等 [ 13]的方法测定。
浸提液离心后的上清液用 0.45μm微孔滤膜过
滤 , 用 TOC(totalorganiccarbon)测定仪(TOCAnal-
gzer, 德国)测定其中溶解性有机碳(TOC)含量。
菌体干重根据 Kumar等 [ 14]的方法测定 。
根据 Goering等[ 15]的方法测定稻草中木质素的
含量。用纤维素测定仪 ,依次经中性洗涤液 、酸性洗
涤液和 72%硫酸溶液浸洗 ,并称重 ,最后在马弗炉
中 550℃条件下焚烧灰化 。木质素可以由焚烧灰化
前后的重量差值得出 ,而灰分含量为焚烧后的重量
减去坩埚重量。木质素降解率分析公式:
木质素降解率 =(A/B)×100% (1)
其中:A—木质素的降解总量;
B—原样品中木质素的总量。
2　结果与讨论
2.1　表面活性剂对溶解性有机碳的影响
由图 1可以看出 , 二鼠李糖脂对降解过程中水
溶性有机碳的影响 。前 8 d水溶性有机碳增长缓
慢 , 且各组变化差异不大 , 到了 12 d添加 0.007%
二鼠李糖脂的 TOC增长较明显 , 比对照组高出
51%。随着反应的进行 , TOC不断增大并在 24 d达
到了最大值 , 添加 0.007%和 0.021%二鼠李糖脂
使 TOC比对照组分别提高 83.6%和 54.5%, 随后
各组 TOC均缓慢下降并在一定水平浮动 。在整个
过程中 , 添加 0.007%二鼠李糖脂对 TOC的促进效
果尤为显著 , 但添加 0.003%和 0.042%的二鼠李
糖脂对 TOC的浓度无显著影响 。固态发酵中的水
溶性有机碳是可以被微生物直接利用 , 用来合成生
物体的重要组分 。水溶性有机碳的主要成分为葡萄
糖和木糖[ 16] , 葡萄糖和木糖分别是纤维素和半纤
维素的基本单元结构 。分析认为加入二鼠李糖脂促
进了 CMC(CMCase)酶和木聚糖酶的产生 , 从而水
溶性有机碳的含量也较高 。Liu等 [ 17]研究中发现二
鼠李糖脂能有效促进黄孢原毛平革菌产 CMC酶和
木聚糖酶 ,且临界胶束浓度下的促进效果最明显。
2.2　表面活性剂对菌体干重的影响
由图 2可以看出 , 菌体干重在 4 d和 20 d出现
了 2个较大增幅 , 对照样的菌体干重最大值出现在
20d, 添加了表面活性剂的 3组最大值均出现在
24d, 在整个过程中 , 0.042%、0.021%、0.007%、
1395
环 境 工 程 学 报 第 4卷
图 1　表面活性剂对 TOC的影响
Fig.1 　EffectsofsurfactantonTOC
0.003%组的菌体干重都略高于对照组 。二鼠李糖
脂对黄孢原毛平革菌的生长有一定的促进作用 。水
分为微生物生长所必需 ,微生物需要从周围环境中
不断吸收水分以维持其生长代谢活动 ,微生物体内
水及流动状态水是进行生化反应的介质 ,固态培养
物料中的有机营养成分也只有溶解于水中才能被微
生物摄取吸收。对照样组的生物量提前降低应该是
因为固态发酵后期水分的丧失 , 而二鼠李糖脂对底
物介质的水分有较好的保持性能 , 有利于长时间保
持微生物的活性 , 且二鼠李糖脂溶液浓度越高 , 这
种水分保持性能越好 , 但是增幅并不大 [ 18] 。
2.3　表面活性剂对木质素过氧化物酶的影响
由图 3可以看出 ,二鼠李糖脂对木质素过氧化
物酶酶活的影响 。前 8 d木质素过氧化物酶酶活的
变化趋势很相似 , LiP酶活缓慢增长 , 到了 12 d各
组就有了明显的区别 , 添加 0.007%二鼠李糖脂的
实验组增幅最明显 , 0.021%次之 , 且均明显高于
对照组 。随后各组酶活随着反应不断增大 , 最大值
均出现在 28 d, 添加 0.007%和 0.021%二鼠李糖
脂的组最大值分别为 650.4U/L, 491.7 U/L, 比对
照组分别高出 85.7%和 41.2%, 但添加 0.042%二
鼠李糖脂的最大值低于对照组。添加 0.003%二鼠
李糖脂的促进作用不明显 。整个过程中表面活性剂
浓度为 0.007%的酶活均高于 0.021%且都高于对
　
图 2　表面活性剂对菌体干重的影响
Fig.2　Efectsofsurfactantonbiomass
照组。钟华等 [ 19]的研究表明 ,表面活性剂可以促进
微生物的大量生长从而提高其产酶量 , 但本研究显
示酶活的最大值和菌体干重的最大值并不一致 , 所
以这种促进作用应该不是提高酶活的主要原因 。也
有研究表明提高酶活的主要原因是表面活性剂改变
了微生物细胞膜的渗透性 , 使微生物所分泌的胞外
酶更加容易透过细胞膜运输到细胞外部 [ 5] 。 Van
derMeer等[ 20]研究表明 , 生物表面活性剂能提高氧
气的传质系数 , 使固态发酵的水相中溶解了更多的
氧 , 氧气能有效提高黄孢原毛平革菌产 LiP酶 [ 21] 。
本研究测得酶活性提高 , 分析其原因 , 认为是这两
种机制综合作用的结果。
此外本实验中使用的二鼠李糖脂的临界胶束浓
度为 0.007%, 在此浓度下 LiP酶活促进效果最好 。
在临界胶束浓度下 , 气液相交界面的表面活性剂饱
和 , 再继续加入表面活性剂会使表面活性剂聚合成
为胶束 , 表面张力不能进一步下降[ 22] 。 Womack
等 [ 23]认为 , 超过临界胶束浓度的表面活性剂可能
与酶蛋白结合在一起 , 因此对酶活有不利的影响 。
低于临界胶束浓度的表面活性剂不能使表面张力下
降到最低 ,不利于酶活 。
图 3　表面活性剂对 LiP酶活的影响
Fig.3　EfectsofsurfactantonLiP
2.4　表面活性剂对锰过氧化物酶的影响
由图 4可以看出 , 锰过氧化物酶的活性在前
12d增长较缓慢 , 随着反应的进行 , MnP酶活显著
增大 , 在 24 d达到了最大值 , 接着缓慢下降 , 添加
二鼠李糖脂对锰过氧化物酶酶活没有促进作用 。这
与 Liu等 [ 17]的研究结果是一致的 。一般认为提高
酶活的主要原因是表面活性剂改变了微生物细胞膜
的渗透性 ,微生物所分泌的胞外酶更加容易透过细
胞膜运输到细胞外部 [ 20] 。分析认为 , 可能是由于
MnP的合成依赖于 Mn2 +的存在 [ 24] , 所以添加表面
活性剂改善微环境对 MnP活力影响不大 。
2.5　表面活性剂对木质素含量的影响
由图 5可以看出 , 在前 12 d, 各实验组木质纤
维素降解率变化相似 , 降解率缓慢升高 , 到了 16d
有了明显的区别 , 添加 0.007%二鼠李糖脂实验组
1396
第 6期 胡晨璐等:二鼠李糖脂对白腐菌降解稻草中木质纤维素的影响
对木质素降解率的作用比对照组高出 40.3%, 随着
反应的进一步进行 , 降解率持续升高 ,第 32 d, 添
加 0.021%二鼠李糖脂的实验组木质素降解率比对
照组高出 23%, 0.007%组木质素降解率达到了
40%, 比对照组高出 54%。有研究表明生物表面活
性剂溶解在堆肥颗粒间隙溶液中能够降低间隙溶液
的表面张力 , 从而使水在垃圾颗粒表面形成相对均
匀稳定的液膜 , 为微生物 、O2和养分的传输提供通
道 , 最大可能地改善降解的微环境 [ 25] 。本实验添
加不同浓度二鼠李糖脂对稻草中木质素的降解有不
同程度的促进作用。
2.6　稻草的环境电镜扫描
环境电镜扫描是研究稻草中木质纤维素经白腐
菌降解后的形态上的变化 。图 6(a)是稻草原样的
扫描图 , 可以看出植物的细胞壁由外面的木质素紧
紧包裹着内层的纤维素和半纤维素 , 形态很规则 。
图 6(b)和 6(c)是固态发酵 32 d以后的稻草 SEM
(scanningelectronmicroscopy)扫描图 , 图中表面木
质素形态已不规则 , 被发酵过程中白腐菌所产的酶
系列降解并剥离露出内层的纤维层。添加二鼠李糖
脂的样品和对照样相比 , 木质素结构被破坏降解降
解得更加明显 , 分析原因 , 是由于表面活性剂保持
水分和增强氧气的传送从而改善了白腐菌的生长环
图 6　稻草的环境电镜扫描
Fig.6　Scanningelectronmicrographofstraw
境 , 促进了白腐菌的生长繁殖 , 同时也促进白腐菌
产生有效降解木质素的酶 , 从而强化了木质纤维素
的降解 。
3　结　论
(1)在木质纤维素固态发酵降解过程中 ,二鼠
李糖脂的介入可促进水溶性有机碳的产生 , 而且二
鼠李糖脂对底物介质的水分有较好的保持性能 , 有
利于长时间保持微生物的活性 , 从而有利于黄孢原
毛平革菌的生长 , 使得含有二鼠李糖脂的发酵组的
菌体干重要高于对照组的 , 而且延缓了菌体的
衰退。
(2)添加适当浓度二鼠李糖脂能促进黄孢原毛
平革菌产 LiP酶 , 临界胶束浓度下的二鼠李糖脂效
1397
环 境 工 程 学 报 第 4卷
果最好 。二鼠李糖脂对 MnP酶活没有显著性影响 。
(3)添加二鼠李糖脂可以提高黄孢原毛平革菌
对木质素的降解率 , 从而达到加速降解木质素的
作用。
参 考 文 献
[ 1] AbbotT.P., WicklowD.T.Degradationofligninby
Cyathusspecies.Appl.Environ.Microbiol., 1984, 47
(12):585 ～ 587
[ 2] MartinH.Review:Ligninconversionbymanganeseperoxi-
dase(MnP).Enz.Mic.Technol., 2002, 30(3):454 ～
466
[ 3] MartinH., TamaraV., MikaK., etal.Productionof
manganeseperoxidesandorganicacidsandmineralization
of14C-labeledlignin(14C-DHP)duringsolidstatefer-
mentationofwheatstrawwiththewhiterotfungiNemato-
lamafrowardii.Appl.Environ.Microbiol., 1999, 65
(1):1864 ～ 1870
[ 4] PardoA.G.Efectofsurfactantsoncelulaseproduction
bynectriacatalinensis.CurrentMicrobiology, 1996, 33
(1):275 ～ 278
[ 5] ReeseE.T., ManguireA.Surfactantsasstimulantsofen-
zymeproductionbymicroorganisms.Appl.Microbiol.,
1969, 17(3):242 ～ 245
[ 6] AhujaS.K., FerreiraG.M., MoreiraaR.Productionof
anendoglucanasebytheshipworm bacterium, Teredi-
nobacterturnirae.J.Ind.Microbiol.Biotechnol., 2004,
31(5):41 ～ 47
[ 7] 徐志伟 , 尤勤 , 孙炳寅.生物表面活性剂的工业应用.
生物技术 , 1995, 5(3):6 ～ 7
[ 8] 梅建风 , 闵航.生物表面活性剂及其应用.工业微生
物 , 2001, 31(1):54 ～ 57
[ 9] 范立梅.生物表面活性剂及其应用.生物学通报 ,
2000, 35(8):21 ～ 22
[ 10] LiuJ., YuanX.Z., ZengG.M.Effectofbiosurfactant
oncelulaseandxylanaseproductionbyTrichodermaviride
insolidsubstratefermentation.ProcessBiochemistry,
2006, 41(10):2347 ～ 2351
[ 11] YuanX.Z., RenF.Y., ZengG.M., etal.Adsorption
ofsurfactantsonaPseudomonasaeruginosastrainandthe
efectoncelsurfacelypohydrophilicproperty.Appl.Mi-
crobiol.Biotechnol., 2007, 76(4):1189 ～ 1198
[ 12] 李越忠 , 高培基 , 王祖农.黄孢原毛平革菌合成木素
过氧化物酶的营养调控.微生物学报 , 1994, 34(1):
29 ～ 36
[ 13] RogalskiJ., SzczodrakJ., JanuszG.Manganeseperoxi-
daseproductioninsubmergedculturesbyfreeandimmo-
bilizedmyceliaofNematolomafrowardi.Bioresource
Technology, 2006, 97(3):469 ～ 476
[ 14] KumarA.Ganesh, SekaranG., SarayuKrishnamoorthy.
SolidstatefermentationofAchraszapotalignoceluloseby
Phanerochaetechrysosporium.BioresourceTechnology,
2006, 97(3):1521 ～ 1528
[ 15] GoeringH.K., VanSoestP.J.AgriculturalHandbook
No.379 ForagefiberAnalyses:Apparatus, ReagentesPro-
ceduresandSomeApplications.Washington:USDA, 1970
[ 16] CharestM.H., AntounH., BeauchampC.J.Dynamics
ofwater-solublecarbonsubstancesandmicrobialpopula-
tionsduringthecompostingofde-inkingpapersludge.
BioresouseTechnol., 2004, 91(3):53 ～ 67
[ 17] LiuX.L., ZengG.M., TangL., etal.Efectsofdirh-
amnolipidandSDSonenzymeproductionfromPhanero-
chaetechrysosporiuminsubmergedfermentation.Process
Biochemistry, 2008, 43(11):1300 ～ 1303
[ 18] 钟华.基于生物表面活性剂的堆肥微环境条件的改良
[硕士学位论文 ] .长沙:湖南大学 , 2005.46 ～ 47
[ 19] 钟华 , 曾光明 , 黄国和 , 等.鼠李糖脂发酵液强化蔬菜
基质好氧降解研究.环境科学与技术 , 2005, 28(1):
9 ～ 11
[ 20] VanderMeerA.B., BeenackersA.A.C.M.,
BurghardR., etal.Gas/liquidmasstransferinafour-
phasestirredfermentor:Effectsoforganicphasehold-up
andsurfactantconcentration.ChemicalEngineeringSci-
ence, 1992, 47(9 ～ 11):2369 ～ 2374
[ 21] 李华钟 , 章燕芳 , 华兆哲 , 等.黄孢原毛平革菌选择性
合成木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶.过程工程学
报 , 2002, 2(2):137 ～ 141
[ 22] HeleS.S., DuffS.J.B., CooperD.G.Efectofsur-
factantsoncellulosehydrolysis.Biotech.Bioeng., 1993,
42(5):611 ～ 617
[ 23] WomackM.D., KendallD.A., MacDonaldR.C.De-
tergentefectsonenzymeactivityandsolubilizationoflipid
biolayermembranes.Biochim.Biophys.Acta, 1983,
733(1):210 ～ 215
[ 24] BrownJ.A., AlicM., GoldM.H.Manganeseperoxi-
dasegenetranscriptioninPhanerochaetechrysosporium:
Activationbymanganese.J.Bacteriol., 1991, 173
(11):4101 ～ 4106
[ 25] AyyarS.P., SabatiniD.A.Surfactantadsolubilization
andmodifiedadmicellarsorptionnonpolar, polarandion-
izableorganiccontaminants.Environ.Sci.Technol.,
1994, 28(9):1874 ～ 1881
1398