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第 52卷 第 18期 2007年 9月 论 文
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紫云英参与共生固氮的 2个新结瘤素基因的分离与鉴定
丑敏霞① 魏新元② 陈大松③ 周俊初③
(① 西北农林科技大学生命科学学院, 杨凌 712100; ② 西北农林科技大学食品科学与工程学院, 杨凌 712100; ③ 华中农业大学
农业微生物学国家重点实验室, 武汉 430070. E-mail: minxia95@yahoo.com)
摘要 通过抑制差减杂交 , 比较了接种华癸中生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii) 7653R 的紫云英
(Astragalus sinicus)的根与未接种根瘤菌的对照根在转录水平上的差异, 建立了紫云英共生结瘤过程中
的差异表达基因文库, 并在此基础上证实了 2个结瘤特异性基因 AsⅡC259和 AsG2511. 其可读框显示,
AsⅡC259和 AsG2511编码的多肽链长度分别为 134和 58个氨基酸, 其氨基端均含有一个信号肽. 结构
域查询结果揭示, AsⅡC259 编码的多肽链包含了 2 个 N-糖基化位点、一个依赖于 cAMP 的蛋白激酶
(PKA)和 cGMP依赖的蛋白激酶(PKG)磷酸化位点以及一个酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点. BlastP同源
搜索表明, AsⅡC259 多肽链仅与一个来自羽扇豆(Lupinus luteus)根瘤的新结瘤素蛋白表现出较低的同
源性. 对于 AsG2511多肽链, 没有发现任何明显的同源序列. Virtual Northern blot和半定量 RT-PCR分
析表明, AsⅡC259 和 AsG2511 均只在接种根中表达, 说明它们确为结瘤特异性基因; 另外, 这 2 个基
因的表达比豆血红蛋白基因晚 2~4 d, 应为晚期结瘤素基因.
关键词 结瘤特异性基因 紫云英(Astragalus sinicus) 结瘤素 共生 抑制差减杂交

2007-04-11收稿, 2007-08-20接受
国家重点基础研究发展计划资助项目(批准号: 2001CB108901)
豆科植物与根瘤菌 (Rhizobium)、慢生根瘤菌
(Bradyrhizobium)、中华根瘤菌(Sinorhizobium)、中生
根瘤菌(Mesorhizobium)及固氮根瘤菌(Azorhizobium)
(统称为根瘤菌)共生互作的结果导致了一个新的植
物器官根瘤的形成. 根瘤菌生活在根瘤中, 它们具有
将氮气转化为能被植物同化的氨的能力 . 这种共生
关系的建立起始于共生双方的分子对话 . 植物分泌
类黄酮至根际, 诱导根瘤菌的脂质寡聚糖信号分子—
— 结瘤因子的表达. 结瘤因子被宿主植物特异性地
识别后, 根迅速作出一系列反应, 一些结瘤素基因被
表达, 某些皮层细胞开始分裂启动根瘤的形成[1]. 在
共生结瘤过程中 , 那些被诱导表达或表达增强了的
植物基因被命名为结瘤素基因 , 其表达产物称为结
瘤素[2]. 根据表达时间的早晚, 结瘤素基因可以分为
早期结瘤素基因和晚期结瘤素基因 , 前者在开始固
氮前表达 , 后者则在发育完全的、成熟的根瘤中表
达[3].
从结构上看, 根瘤一般分为不定型瘤和定型瘤.
前者主要在温带豆科植物的根上形成 , 它们具有明
显的分层: Ⅰ层为顶端分生组织; Ⅱ层为侵染区; 随
后是富含淀粉粒的Ⅱ~Ⅲ中间带; Ⅲ层为固氮区, 其
中充满类菌体; 最后是接近衰老的Ⅳ层[4]. 定型瘤通
常形成于热带豆科植物上, 在成熟的根瘤内, 包含固
氮细胞的中央组织是均一的[5,6].
在中国、日本、韩国等亚洲国家, 紫云英(Astragalus
sinicus L.)作为绿肥、饲料及蜜源植物被广泛种植. 在
我国, 它还是一种重要的中药植物. 它和华癸中生根
瘤菌 (Mesorhizobium huakuii)有着专一的共生关系 ,
互作的结果是形成不定型瘤[7]. 另外, 它也能与内生
菌根真菌(Glomus intraradices)建立共生关系 . 除了
植株矮小、生育期短这些生理特征以外, 紫云英还是
一个专一性很强的寄主植物 , 通常只与从自身分离
的根瘤菌共生结瘤 , 唯一的例外报道是一个自
Astragalus ciceri 分离的根瘤菌菌株, 能与紫云英交
叉结瘤[8]. 目前为止, 人们对紫云英在共生结瘤中相
关信息的了解非常有限. Fujie等人[9]曾通过差异显示
法分离了 100 多个在紫云英根瘤中特异表达或表达
增强了的 cDNA克隆, 并证实了一个新的结瘤素基因
AsNODc22. AsNODc22能够编码一个 18 kD功能未知
的蛋白质. 随后, Naito 等人[10]报道了另一个结瘤特
异性基因 AsNODf32, 这个基因编码的多肽类似于
Cys蛋白酶.
为了对紫云英的共生结瘤过程作较为系统的研
究, 以获得新的结瘤素基因和更多有用的分子探针,







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本研究利用抑制差减杂交 (Suppression Subtractive
Hybridization, SSH)技术比较研究了紫云英接种根系
和未接种根系的基因转录情况 , 建立了其结瘤根的
差异表达 cDNA 文库. 目前已有 14 个结瘤特异性或
结瘤增强性基因被报道 . 这些基因所编码的多肽包
括了 Usp家族(universal stress protein family)类似物、
半胱氨酸簇蛋白家族(cysteine cluster proteins, CCP)
同源物以及脂类转运蛋白家族(lipid transfer protein,
LTP)类似物 [11,12]. 本文报道了另外两个新的结瘤特
异性基因 AsG2511和 AsⅡC259及其表达方式, 并结
合序列查询及结构域分析讨论了它们的功能.
1 材料与方法
(ⅰ) 材料. 将紫云英种子浸入 95%(体积比)的
乙醇 5 min, 再以 5%(体积比) NaClO表面消毒 10 min,
无菌水洗涤 8次, 黑暗中于室温下发芽 2 d. 将发芽的
种子无菌条件下浅播于灭菌砂钵中, 浇溉 Fåhraeus无
氮营养液[13], 按照每天 16 h光照/8 h暗期于 18~22℃
培养. 6 d后, 接种 Mesorhizobium huakuii 7653R.
(ⅱ) 总 RNA的分离. 用 Trizol试剂(Invitrogen,
CA, USA)提取, 具体操作按说明书进行. 分别提取
紫云英接种后 21~26 d 的根及相应苗龄未接种根的
RNA, 进行 SSH, virtual Northern blotting及 cDNA末
端快速扩增(RACE)分析.
为了研究基因的表达情况, 分别从接种后 1, 3, 5,
7, 9, 12, 15及 21 d的根以及接种后 27 d的除去根瘤
的根、根瘤、叶片、叶柄中提取 RNA. 同时, 分别提
取播种后 4, 6及 33 d的未接种根中的 RNA作为对照,
进行半定量 RT-PCR分析.
(ⅲ ) SMART cDNA 的合成 . 利用 ClonTech
SMART PCR cDNA Synthesis kit (ClonTech, CA, USA)
进行 cDNA的合成与扩增, 操作按试剂盒说明书进行,
略作如下改动: 取 1 µg纯化后的总 RNA, 加入 cDNA
合成(CDS)引物及 SMARTⅡ寡聚核苷酸, 42℃温育 1
h, 合成第一链 cDNA. 随后, 向 10 µL第一链反应体
系中加入 40 µL Tricine-EDTA缓冲液, 72℃温育 7 min.
取 1 µL上述稀释后的单链 cDNA为模板进行长距离
(LD) PCR. 反应体系为 100 µL. 反应程序为: 95℃,
15 s, 65℃ , 30 s, 68℃ , 6 min, 共 17 个循环 . 于
PTC-100TM Peltier Thermal Cycler (MJ ResearchTM
Inc., Massachusetts, USA)上进行扩增. 此 PCR产物将
被用作 virtual Northern blot.
(ⅳ) SSH和差减cDNA文库的构建. 利用ClonTech
PCR-Select cDNA Subtraction kit进行文库的构建. 简
言之, 获取总 RNA 之后, 以链霉素亲和磁珠法分离
poly(A) RNA (PolyATtract® mRNA Isolation Systema
Ⅲ, Promega, USA). 分别以 2 µg紫云英接种后 21~26
d的根及相应苗龄未接种根中的 poly(A) RNA为模板
合成 cDNA, 随后用限制性内切酶 RsaⅠ酶切消化.
酶切后的 cDNA片段作为 Tester和 Driver 进行正向
和反向杂交. 正向杂交中, 以来自接种根的 cDNA片
段为 Tester 进行目的基因的筛选; 反向杂交中, 则以
来自未接种根的 cDNA 片段为 Tester, 去除那些非特
异性表达的基因. Tester cDNA 两端分别连接两个不
同的接头, 该接头含有与 PCR 引物配对的序列及克
隆位点, Driver cDNA不加接头. 将 Tester cDNA分为
两份, 变性, 分别与变性后的 Driver cDNA差减杂交.
紧接着进行第二次杂交 , 亦即差减后的两份 Tester
cDNA之间的杂交. 最后, 扩增 Tester cDNA中特异表
达的 cDNA 片段, 并克隆到 pGEM®-T 载体(Promega)
上.
(ⅴ) 差示筛选. 通过斑点杂交进行. 随机挑取
上述转化子并提取质粒 , 取 1 µL 质粒作模板 , 用
T7/SP6通用引物进行 PCR扩增. 各取 8 µL扩增产物,
加入 0.4 mol/L NaOH (新配)和 10 mmol/L EDTA (pH
8.2)变性. 取变性后的各样品 2 µL, 点于带正电荷的
尼龙膜上(Amersham Pharmacia Biotech Limited, Lit-
tle Chalfont Buckinghamshire, England), 共点 4张重
复拷贝膜. 点好的膜于 2×SSC中漂洗, 晾干, 80℃烘
烤 2 h. 4张重复拷贝膜分别与 4个探针(来自接种根的
差减 cDNA探针、来自接种根的未差减 cDNA探针、
来自未接种对照根的差减 cDNA 探针及其未差减
cDNA探针)杂交.
探针的制备如下: 相应的 cDNA分别以 RsaⅠ消
化, 切除接头, 随后以 32P标记(Random Primer DNA
Labeling kit, TaKaRa, 大连, 中国). 在含有 5×SSC,
5×Denhardt’s, 0.5% (质量体积比)SDS 和 100 µg/mL
变性鲑鱼精DNA片段的预杂交液中, 4张点有样品的
膜于 65℃预杂交 14 h. 加入含探针的杂交液后, 65℃
下杂交过夜. 然后, 于 65℃严紧条件下洗膜. 洗膜条
件为: 2×SSC/0.5% SDS, 2次; 1×SSC/0.5% SDS, 2
次; 0.1×SSC, 0.5% SDS, 2次. 洗膜结束后, 用 X-膜
于−80℃放射自显影.
通过比较 4 张拷贝膜上的杂交情况来初步筛选
差示片段 . 选取仅与来自接种根的探针杂交或杂交







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信号明显高于来自未接种根的探针的克隆测序 , 并
进行 Blast分析.
(ⅵ) Virtual Northern blotting. 为了进一步验证
所选克隆是否代表真正的目的基因 , 我们选取其中
的部分克隆, 以 T7, SP6为引物扩增其中的插入片段,
酶切去接头并进行探针标记 . 分别取来自紫云英接
种根和未接种根的 SMART cDNA 25 µL, 于 1.2%的
琼脂糖凝胶上电泳分离, 变性, 转膜. 探针标记与杂
交过程同上面的差示筛选. 同时, 扩增并标记一段泛
素 cDNA[14]片段作为阳性对照.
(ⅶ) 半定量 RT-PCR 分析. 取不同来源的总
RNA各 1 µg, DNaseⅠ(无RNase, TaKaRa)消化以去除
基因组 DNA. 以纯化后 RNA 为模板合成并扩增
cDNA. 以 5′-CACCAATATAACACATACTTA-3′和 5′-C-
ATCAAAACTAGTATGGCAA-3′为引物扩增 AsⅡC259,
以 5′-GAGAAGAGTTATGGCAGC-3′和 5′-CCATTGT-
TGATAATTTTTCAC-3′为引物扩增 AsG2511, 具体操
作参考 One Step RNA PCR kit (AMV) (TaKaRa), 即 50
µL 反应体系于 50℃保温 30 min, 反转录合成第一链
cDNA; 94℃ 2 min失活反转录酶; 接着开始 PCR循环:
94℃变性 30 s, 退火(温度依引物而不同)30 s, 72℃延伸
1 min; 最后 72℃延伸 5 min. 取指数扩增期内的最大循
环数(预实验中取不同循环数时的 PCR 产物进行分析,
结果未显示): AsG2511为 24次, AsⅡC259为 28次. 5 µL
产物于 2%的琼脂糖凝胶电泳分析, 利用 Kodak Gel
Logic 100 Imaging System (Eastman Kodak Company,
New Haven, CT, USA)软件分析 mRNA的相对积累量,
所得数据进行统计分析. 以 18S rRNA的一个片段作为
阳性对照, 其 RT-PCR 过程同上, 只是总循环数为 15
个. RT-PCR过程至少重复 3次.
(ⅷ) RACE 法获得目的基因的全长 cDNA. 利
用 SMARTTM RACE cDNA Amplification kit (Clon-
Tech)和基因特异性引物(GSP)扩增目的基因的 5′及
3′-cDNA末端; 随后, 根据此末端 cDNA序列设计 5′
和 3′-末端引物, 以 5′-RACE-Ready cDNA为模板, 通
过 LD-PCR 扩增目的基因的全长 cDNA. 同时, 全长
cDNA的克隆还可以通过 5′及 3′-RACE产物重叠部分
的拼接获得. 5′-RACE 中用于 AsⅡC259 的 GSP1 为
5′-CAGCAGTAATTGGAGAATGATCGCTCGA-3′, 用
于 AsG2511 的 GSP1 为 5′-CATAAAATTGTCACTA-
TCGCAAATCCATCGAC-3′; 3′-RACE中用于AsⅡC259
的 GSP2 为 5′-AGCCCATGATGAAGAGCGTGAAC-
CAAAT-3′, 用于 AsG2511 的 GSP2 为 5′-TGATAAT-
GATTGTTTTACGGAGTGTCTCCGTG-3′. 全长 cDNA
随后与 pGEM-T载体(Promega)相连.
(ⅸ) 序列分析和统计分析. 目的基因的氨基酸
序列推测利用 BioEdit 软件进行 [15]. 同源搜索利用
Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行. 理论上
的等电点(pI)和分子量(MW)通过 Compute pI/MW 软
件预测 (http://ca.expasy.org/tools/). 通过对 InterPro-
Scan (http://www.ebi.ac.uk/)、Pfam (http://www.sanger.
ac.uk/Software/)和 PROSITE (http://www.predictpro-
tein. org/)数据库的查询 , 证实氨基酸保守结构域 .
SignalP 3.0 Server软件预测信号肽的存在及其可能的
切割位点(http://www.cbs.dtu.dk/services/). 二级结构
分析通过 PSIPREDView程序[16]进行.
利用 SPSS 11.0 for Windows中的单向方差分析
(One-Way ANOVA)程序, 对半定量 RT-PCR中的数据
进行统计分析.
2 结果
2.1 差减 cDNA文库的构建和 SSH cDNA序列分析
SSH cDNA 片段连接 T-载体并转化大肠杆菌后
挑取了 400多个转化子, 利用斑点杂交进行阳性克隆
的第一次筛选. 与未接种根相比, 选择那些在接种根
中的表达强度明显提高(至少 3倍)的克隆进行测序并
分析, 结果得到了 57个不同的 cDNA克隆(表 1). 核
苷酸序列的 BLAST 分析表明, 其中一些片段与已报
道的结瘤素基因之间存在着一定的同源性 , 如早期
结瘤素基因 ENOD2, 晚期结瘤素基因 nodulin-26 以
及豆血红蛋白基因; 3 个片段编码紫云英天冬酰胺合
成酶基因; 还有一些片段与某些代谢或水解酶有不
同程度的序列相似性. 另外, 有 30 个片段没有找到
同源基因.
2.2 Virtual Northern blot结果分析及目的基因的克隆
通过 virtual Northern blot, 我们证实了两个只在
接种根中表达的代表克隆(图 1). 利用 5′及 3′-RACE
方法, 获得了它们的全长 cDNA 序列, 分别命名为
AsG2511 (GenBank 登录号: DQ199644)和 AsⅡC259
(GenBank登录号: DQ199642).
2.3 目的基因的序列分析
序列分析表明, AsⅡC259编码的多肽含 134个氨
基酸, N-端包含一个由 24个氨基酸组成的信号肽. 除







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表 1 紫云英差异表达 cDNA克隆的序列分析
名称 数量 长度/bp Blast搜索到的第一个同源序列 GenBank登录号 E值
B9241-6 6 348~419 蚕豆豆血红蛋白 K mRNA Z54158 6×10−45
F124 1 229 紫花苜蓿豆血红蛋白 mRNA X13375 3×10−15
G724 1 229 紫花苜蓿(依洛魁栽培种)豆血红蛋白(MsLb3)基因 M91077 6×10−16
B10251-8 8 185~938 紫花苜蓿豆血红蛋白(pNL549) mRNA X14311 2×10−43
C724 1 374 大豆 2-on-2 血红蛋白(GLB3) mRNA AY547292 3×10−25
A2241-2 2 396 紫云英天冬酰胺合成酶 AsAS2 mRNA AB035248 0.0
B1224 1 474 紫云英天冬酰胺合成酶 AsAS1 mRNA AB035247 0.0
E824 1 394 豌豆早期结瘤素蛋白(ENOD2) mRNA X51987 1×10−5
G1024 1 577 大豆结瘤素-26 mRNA X04782 3×10−66
C924 1 658 田菁磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pepc) AJ286750 0.0
D324 1 444 推测的辣椒 Cys蛋白酶 mRNA AF242733 2×10−4
IA725 1 620 羽扇豆二磷酸核苷酸磷酸酶 1基因(ppd1) AJ421009 2×10−86
D724 1 925 推测的拟南芥 RNA解旋酶 mRNA (At2g47250) NM_130293 2×10−43
IIB1025 1 322 苜蓿 mth2-10i23克隆序列 AC140032 2×10−41
A424 1 321 无显著匹配序列
C1124 1 376 无显著匹配序列
G1124 1 332 无显著匹配序列
A725 1 340 无显著匹配序列
D525 1 634 无显著匹配序列
E624 1 375 无显著匹配序列
F925 1 290 无显著匹配序列
G7251-2 2 245~265 无显著匹配序列
G10251-4 4 458~466 无显著匹配序列
G1125 1 291 无显著匹配序列
IB925 1 395 无显著匹配序列
IC825 1 311 无显著匹配序列
IE4251-4 4 534~939 无显著匹配序列
IIA5251-2 2 309 无显著匹配序列
IIC9251-2 2 210~603 无显著匹配序列
IIC12251-6 6 258~352 无显著匹配序列


图 1 AsG2511和 AsⅡC259的 Virtual Northern blot分析
1, 接种后 21~26 d的根; 2, 播种后 27~32 d的未接种根. Ubiquitin为
阳性对照

去信号肽后的多肽分子量为 12 kD, 等电点 (pI)为
4.67. PROSITE分析结果显示, AsⅡC259多肽链包含
了 2个N-糖基化位点(51~54: NITS; 113~116: NLSN)、
一个依赖于 cAMP 和 cGMP 的蛋白激酶磷酸化位点
(108~110: KKTS)以及一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点
(54~57: SDVD). BlastP 同源搜索表明, AsⅡC259与
LlDD4A9 仅在 N-端的 74 个氨基酸中表现出 35%的
同源性 , 后者是一个自羽扇豆的根瘤中分离到的未
知功能的结瘤素, LlDD4A9在接种后 13 d左右表达,
类似于豆血红蛋白基因[17]. InteroProScan 和 Pfam 数
据库查询结果揭示, AsⅡC259 的 N-端有一个跨膜结
构域, 而 C-端则和富含甘氨酸的蛋白质家族在结构
上可能存在一定的匹配(E 值在 cutoff 之上). 这个蛋
白质家族包括了晚期结瘤素 16和 24以及那些因不同







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的压力诱导而产生的蛋白质.
AsG2511 编码一个含 58 个氨基酸的短肽, 其信
号肽部分包含 23 个氨基酸. 成熟的多肽分子量为 4
kD, 等电点为 5.16. AsG2511 的二级结构预测显示,
在两段 α-螺旋之间分布着一段β-折叠(数据未展示).
数据库查询没有发现任何相似序列 , 也没有找到任
何结构域特征.
2.4 基因表达分析
为了分析基因的表达情况, 从一套与 SSH 同样
生长条件下新培养的接种和未接种植物中提取 RNA,
在完成基因组 DNA 的去除与检测后进行半定量
RT-PCR. AsG2511和 AsⅡC259在植物不同生长时期、
不同器官中 RNA 的相对积累如图 2 和 3 所示. 由图
可见 , 所有能检测到目的基因的样品中均只扩增出
了一条大小一致、符合预期大小的带. 为了弄清基因
的诱导是由于共生侵染引起, 还是植物幼根本身的
生长发育所致, 我们还分别提取了 4及 6天龄未接种
根的 RNA, 并做了同样的 RT-PCR 分析. 结果显示,
这两个基因在未接种根中没有得到扩增产物 , 表明
这些基因是侵染特异性诱导(图 2). 紫云英豆血红蛋
白基因 AsB2510(GenBank登录号: DQ199647)作为有
效根瘤的一个共生标记物也被同时分析. 由图 2(b)可
以看出, AsB2510在接种后 5 d左右开始表达. AsG2511
在接种后 9 d左右开始转录, AsⅡC259在接种后 7 d
左右即可检测到它的表达, 接种后 9 d其转录水平显
著上升(P<0.05, 图 2). AsG2511 和 AsⅡC259 在根瘤
中的表达水平都非常高 , 在除去根瘤的接种根中也
有表达, 但表达水平明显下降(P<0.05, 图 3). 叶片


图 2 AsG2511和 AsⅡC259在植物不同生长天数时的表达分析
图中数字表示总 RNA来自: 4, 4天龄的未接种根; 6, 6天龄的未接种根(刚好于接种前收获); 33, 33天龄的未接种根; 1, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 21分别代
表接种后 1, 3, 5, 7, 9, 12, 15, 21 d的根. 18S rRNA为阳性对照. (a) 半定量 RT-PCR结果统计分析. 数据为平均值±标准误差, n = 4. mRNA水平以其
电泳条带的强度表示, 纵坐标上的数字为 1000的倍数. 柱形图上的小写字母表示不同的显著性(P < 0.05). (b) AsG2511和 AsⅡC259的 RT-PCR
分析. 紫云英豆血红蛋白基因 AsB2510作为有效根瘤的一个共生标记物也被同时分析







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图3 AsG2511和AsⅡC259在植物不同器官中的表达分析
用于RT-PCR的总RNA来自: UR, 33天龄的未接种根; P, 接种后27 d的叶柄; L, 接种后27 d的叶; IR, 接种后27 d去掉根瘤的根; N, 接种后27 d的
根瘤. 18S rRNA为阳性对照. 数据为平均值±标准误差, n = 3. mRNA水平以其电泳条带的强度表示纵坐标上的数字为1000的倍数. 柱形图上的小
写字母表示不同的显著性(P < 0.05)

和叶柄中没有扩增出产物. 18S rRNA 被作为阳性对
照, 以便确定所有受检样品在反转录及 PCR 过程中
是否等量(图 2和 3).
3 讨论
通过抑制差减杂交 , 我们比较了紫云英接种根
与未接种根在转录水平上的差异, 得到了 57 个在接
种根中表达增强或特异的 cDNA克隆. 其中, AsⅡC259
和 AsG2511 的全长 cDNA 序列已利用 RACE 的方法
获得. Virtual Northern blot分析表明, 这两个基因均
为结瘤特异性表达. 另外, RT-PCR结果显示, AsⅡC259
和 AsG2511的表达比紫云英豆血红蛋白基因晚 2~4 d,
根据 Nap和 Bisseling[3]的定义, 它们可被归为晚期结
瘤素基因.
与 LlDD4A9相似, AsⅡC259多肽链的 N-端也含
有疏水性的信号肽. PROSITE 数据库查询结果揭示,
AsⅡC259编码的蛋白质序列上具有 2个 N-糖基化位
点、一个依赖于 PKA 和 PKG 磷酸化位点以及一个
CK2 磷酸化位点. N-糖基化通常是一个共翻译过程,
发生在新生蛋白向内质网(ER)的转移过程中 . 当新
生肽进入 ER 并被识别后, 多萜醇酯携带着的寡聚糖
前体 Glc3Man9GlcNAc2 即转移到新生蛋白上, 受体
基团是位于 Asn-Xaa-Ser/Thr (Xaa是除 Pro以外的任
何氨基酸)序列上的Asn残基[18]. 在植物中, N-联聚糖
对于糖蛋白的构象、稳定性及生物活性都有着重要的
影响. 甚至, N-连接寡糖还可能包含着靶向作用信息,
直接影响着蛋白质识别或细胞间黏着过程 [19]. 在巨
噬细胞吞噬小体的蛋白质组学研究中 , 检测到了许
多 ER和高尔基体蛋白[20]. 与植物体系共生体的形成
类似 , 这些动物细胞中的细胞器也是通过内摄作用
形成的. 已在大豆[21]、豌豆[22]、百脉根[23]和苜蓿[24]
的共生体膜(PBM)中发现了来自内膜系统的蛋白质.
因此, AsⅡC259可能是从 ER中分泌, 参与了共生体
的形成.
在真核细胞中 , 蛋白质的可逆磷酸化是实现细
胞基本功能的一个主要调控机制 . 作为蛋白质磷酸
化酶之一的 CK2 影响着众多的生命过程, 如有丝分
裂、细胞生长、转录、翻译、DNA 复制和信号传导
等[25~27]. PKA, PKG和蛋白激酶 C (PKC)统称为 AGC
激酶, 在动物细胞中它们是 PDK1 的主要作用对象[28].
PKA磷酸化产物控制着细胞的多种功能, 包括运动、
代谢、分化、突触传递、离子通道活性、生长和等位
基因转录等. 实际上, 许多植物蛋白可以被哺乳动物
的 PKA 磷酸化, 并进一步影响它们的功能, 如植物
色素[29]、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶[30]、磷酸蔗糖合成
酶[31]. 综上所述, 我们推测, 在根瘤形成和发育过程
中, AsⅡC259 可能参与了根瘤的器官发生或信号传
导. 另外, AsⅡC259 和 AsG2511 编码的多肽链没有
表现出与任何已知序列具有显著同源性的事实表明,
它们可能是结瘤特异性蛋白. 在以后的研究中, 我们
将对 AsⅡC259 的蛋白激酶磷酸化位点加以证实, 并
对 AsⅡC259和 AsG2511这两个新的结瘤素基因在根
瘤形成过程中的真正功能进行深入研究.
参 考 文 献
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