全 文 ：应用与环境生物学报　1999 ,5(3):305～ 309 　 　
Chin.J.Appl.Environ.Biol. 　 1999-06-25
　
收稿日期:1998-04-01　　修回日期:1998-09-07　　接受日期:1998-09-21
＊本课题为欧盟(EU)RTD-4合作研究计划 ,编号为ERBIC18CT960103
紫云英根瘤分离菌株质粒多样性的研究＊
郭先武　张学贤　张忠明　王　平　曹燕珍　李阜棣
(华中农业大学农业部农业微生物重点实验室　武汉　430070)
摘　要　从广东 、广西 、湖南 、湖北 、江西 、浙江 、江苏 7省紫云英(Astragalus sinicus L.)主要分布区 46个采集点
的紫云英根瘤中分离到 101个菌株.检测发现有 16种不同质粒类型 ,所含质粒 1～ 4个不等 ,含两个质粒的菌株
占绝大部分 ,质粒 Mr为 36×106 ～ 364×106.用克隆 M.huakuii 7653R的 nodDBC 4.2 kb片段为探针(α-32p-dCTP)
进行的分子杂交结果表明 ,所有这些菌株均含有共生质粒 ,通常为第一大质粒 ,但 C 、L、M、N 和O 型为第二大质
粒 ,共生质粒 Mr在 131×106～ 364×106 之间.比较质粒类型与 16S-23S rDNA IGS(pHr , p23SR01)PCR-RFLP 分析结
果表明 , IGS类型不同 ,即使在同一植株分离所得的根瘤其质粒类型常不同 ,但在同一植株上分离菌株的质粒类
型相同 ,则其 IGS常表现相同.表明质粒的类型是细菌染色体背景和细菌外环境(如共生条件等)共同作用的结
果.
关键词　华癸根瘤菌;质粒型;多样性;共生固氮
中图法分类号　Q939.113 ∶ Q933
PLASMID DIVERSITY OF THE ISOLATES FROM
ASTRAGALUS SINICUS L.IN SOUTHERN CHINA
GUO Xianwu , ZHANG Xuexian , ZHANG Zhongming , WANG Ping , CAO Yanzhen &LI Fudi
(Key Lab Agr Microbiol , Huazhong Agri Univ , Minsistry of Agriculture , Wuhan　430070)
Abstract　101 strains were isolated from Astragalus sinicus L.at 46 sites in southern China , including the
provinces Guangdong , Guangxi , Hunan , Hubei , Zhejiang , Jiangshu and Jiangxi.Through plasmid profile anal-
yses 16 plasmid types were found.They contain 1～ 4 plasmids , which range in size between 36×106 ～ 364×
106(Mr).All the strains carry a symbiotic plasmid(131×106～ 364×106 in size)that was determined by the
hybridization with nodDBC probe.Usually , the symbiotic plasmid is the largest and C , L ,M , N and O plasmid
types are the second largest.On the other hand , the plasmid types were compared with the results of 16S-23S
rDNA IGS PCR-RFLP as chromosomal background.They are not closely related.Different IGS-types of strains
usually carry different types of plasmids even though they come from the same plant.But the plasmid type of
rhizobia is resulted from the reaction between the chromosomal background and the living surrounding(eg.sym-
biosis)of rhizobia.
Keywords　Mesorhizobium huakuii;plasmid profile;diversity;symbiotic nitrogen fixation
根瘤菌中除少数种类外均含有质粒 ,且常参与共生关系的形成.根瘤菌质粒的数量和大小在特定菌株中
是稳定的 ,是菌株的特征之一.根瘤菌具有非常丰富的质粒多样性.华癸根瘤菌是我国独特的固氮菌资源.从
紫云英上分离华癸根瘤菌的质粒 ,邹向宏曾做了较为系统的工作[ 1] ,但其样本仅限于一块稻田.王常霖也分析
了来自各地的 22 个菌株的质粒类型[ 2] .本研究分析了直接从我国南方 7 省 46 个采集地分离的华癸根瘤菌
101 个菌株的质粒型 , 并对其进行 16S-23S rDNA间隔区(IGS)PCR-RFLP分析 , 期望了解我国华癸根瘤菌自然群
体的质粒分布 ,并探讨在不同染色体背景下质粒存在的状况.
1　材料与方法
1.1　材 料
本实验的 101个菌株来自广东 、广西 、湖南 、湖北 、江西 、浙江 、江苏 7 个紫云英(Astragalus sinicus L.)分布
的主要省份的不同地区(表 2).菌株表示方法为前两个字母是取样地省份名称拼音的第一个字母 , 紧接的阿
拉伯数字代表采集地 ,英文字母 A代表根瘤来自同植株 , B 代表来自同一采集地的不同植株 ,最后两个阿接伯
数码用小横线分开 ,前者代表第几个根瘤 , 后者代表同一根瘤的不同菌落.如:ZJ8A16-1 即指菌株来自浙江省
诸暨市次坞镇一个植株上第 16个根瘤的 1号单菌落.
1.2　方 法
1.2.1　根瘤菌的分离　　按参考文献[ 3]
1.2.2　根瘤菌质粒的快速检测及质粒 Mr 的确定　　使用修改的 Eckchadt方法[ 4] .对全部供试菌株进行检
测 ,用 R.fredii USDA205 的 4个已知 M r(相对分子质量)的内源质粒作标准 , 根据相对迁移率来确定供试菌株
质粒 M r[ 3] .
1.2.3　Southem 转移　　按文献[ 5] 方法进行.
1.2.4　分子杂交　　探针 DNA为克隆的华癸根瘤菌 7653R菌株含 nodDBC及部分 nodⅠ的 4.2 kb EcoRⅠ片
段.随机引物标记(α-32p-CTP)操作按试验盒说明进行.杂交温度(θ)为64℃,洗膜 θ为 62℃.
1.2.5　总 DNA 提取　　提取全部菌株的总 DNA ,依文献[ 6]进行.
1.2.6　PCR扩增　　用稀释 50 倍的总 DNA 1 μL为模板 , PCR扩增 16S-23S rDNA 间隔区(IGS),使用的引物为
pHr(5/TGC GGC TGG ATC ACC TCC TT3 )和 p23SR01(5 GGC TGC TTC TAA GCC AAC3 ), 其扩增产物包括 23S
rDNA约 1 kb ,总反应体积为 80 μL ,各种反应条件参见文献[ 7] .Taq 聚合酶购自上海申工公司.
1.2.7　PCR产物的 RFLP 分析　　将 PCR扩增的产物直接用 4 种识别 4 个碱基的限制性内切酶 HinfⅠ 、Hae
Ⅲ 、MspⅠ 、TaqⅠ(均购自华美公司)酶切 , 比较其不同酶切图谱并将之分型.
2　结 果
2.1　供试菌株的质粒类型
对 101个分离菌株进行质粒检测 ,依菌株所含质粒的大小及数目可分成 16 种不同质粒类型 , 它们分别含
有1 ～ 4个质粒 , 以 USDA205 的 4 个质粒的 M r/106分别为 83 , 137 , 226 和 600 作对照 , 运用凝胶测距法测得质
粒 M r/106(表 1)在36～ 360之间.类型 A和 D为 4条质粒带 , 其最大的质粒为 364 , 相当于550 kb , 类型 B、C 、E、
F、J和M 有 3条质粒带 , 质粒型G、H 、I、K、L、N 和O为 2 条质粒带.类型 P只有一条质粒带.小质粒的大小变化
较大 ,如 G型和 J 型的最小质粒相当 , 分别为 43 和 36×106 ,而 N 型和 M 型分别为 160×106 和 167×106.自同
一植株上分离菌株表现出质粒类型差异为普遍现象 , 但常有一种类型占优势(表 2), 如 JS3A 的 7 个菌株包括
4 种质粒类型 ,不仅质粒的 M r有变化 , 其数目也不同 , 但N 型占优势.来自同一土壤的菌株如 GX11 也有类似
情况.
表 1　不同质粒类型的 Mr/ 106＊
Table 1　The Mr/ 106 of plasmids with different plasmid types＊
质粒类型
Plasmid types
A B C D E F G H I J K L M N O P
质粒编号
No.of
plasmids
a 364 282 248 268 202 282 268 255 218 208 208 208 255 198 215 148
b 236 169 174 213 43 16 115 125 131 149 197 160 167
c 213 92 128 153 97 138 36 142
d 125 102
　　　＊以 USDA 205分子量(M r/106:83、137 、226 、600)为标准
　　　＊ Four standard plasmids(M r/ 106:83 , 137 , 266 ,600)from USDA 205 were used
306　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　5卷
2.2　共生质粒的鉴定
nod A、B 、C 为共同结瘤基因 ,一般用它们作探针来确定共生基因的位置 ,如果在质粒上 , 则该质粒为共生
质粒[ 8] .本研究所用的探针为从华癸根瘤菌 7653R中克隆出来的含 nodD、B、C 及部分 nod Ⅰ基因 4.2 kb EcoR
Ⅰ的片段.探针用α-32dCTP标记 , 与经过质粒快速检测 、Southern 转移的尼龙膜进行严谨条件下的分子杂交(图
1).杂交结果表明(图 1):①所有供试菌株均含有共生质粒;②共生质粒一般为第一大质粒 ,但 C , L,M , N 和 O
型的共生质粒为第二大质粒;③共生质粒的 M r/106 大小在 130 ～ 360 之间.④由于 M.huakuii 7653R大质粒上
有阳性信号 ,而 7653R-1 包括点样孔无阳性信号(图 1B), 再表明 4.2 kb片段来自 210×106的共生质粒.
A B
图 1　不同质粒用 nodDBC(4.2 kb)探针的分子杂交(A , B)
Fig.1　All the plasmids in various types hybridized with the nodDC(4.2 kb)probe(A , B)
A:1～ 13泳道依次为A-M质粒型图谱(左)及其对应杂交图(右);B:N-P 质粒型及其杂交图;1.Ⅰ型;　2.K 型;　3.L 型;
　4.N 型;　5.O型;　6.P 型;　7.7653R;　8.7653R-1
A:A-M types of plasmid prof ilesing on the 1～ 13 lanes(left)and hybridizedwith the nodDBC probe(right);B:N-P types of plasmid pro-
files(top)and their hybridzation map with the nodDBC probe(bottom);Lanes:1.I types;　2.K type;　3.L type;　4.N type;　5.
O type;　6.P type;　7.7653R;　8.7653R-1
2.3　质粒类型与染色体基因型的比较
16S-23S rDNA IGS PCR-RFLP 分析将这些菌株分成 14 种不同基因类型.比较菌株的 IGS 类型和质粒类
型发现(表 2), IGS 类型相同其菌株的质粒在数目和大小可以完全不同 ,即使在同一地点甚至同一植株也是如
此 ,在不同地区之间比较 , IGS类型相同 ,其主要质粒类型完全不同常见.来自同一土壤中但 IGS 类型不同的菌
株同一土壤中质粒类型多表现不同 ,但在 ZJ9 、10 、11 却表现一致.反之 , 质粒类型相同的菌株 , 在同一地点和
同一株上多表现出相同的 IGS 基因类型.
3　讨 论
根瘤菌的不同种类及不同菌株 ,其质粒型式的多样性非常丰富 , 数目 1 ～ 10 个不等 , M r 在 30 至 1000 kb
以上 ,但 Azorhizobium 没有质粒[ 8] .邹向宏报道[ 1]华癸根瘤菌质粒为 1 ～ 5 个 , M r/106=35 ～ 600 , 但本实验尚未
发现 M r为 600×106及更大的质粒.含有结瘤并固氮必需基因的质粒可认为是共生质粒.Hashem(1994)[ 6]检测
了 Sinorhizobium meliloti(8株)、R.leguninosarum bv.trifolii(6 株)及 Rhizobium sp.共生质粒(nifHK 探针)均为一
个 ,且 Mr/ 106在 430～ 615之间.Lagguerre等(1993)[ 6]从同一块地的不同宿主(碗豆 、小扁豆 、菜豆及三叶草)分
离 113 个菌株 ,共生质粒在 118～ 900 kb之间.S.meliloti 的nod ABC 及 nifHDK基因位于 Mr/ 106为 400～ 100 之
间的质粒上;R.l.bv.trifolii 、R.l.bv.phaseoli和S .fredii 其共生质粒M r/106=100 ～ 300 之间.陈雯莉报道[ 3] R.
fredii其共生质粒 Mr/ 106 为 247 ～ 381.邹向宏[ 1] 对华癸根瘤菌 M.huakuii 的研究表明其共生质粒的 M r/106=
117 ～ 226之间.本研究发现 Mr=360×106 的共生质粒.迄今为止 ,尚未发现根瘤菌共生质粒小于 100 kb.许多
研究表明 ,根瘤菌的质粒在纯培养条件下非常稳定[ 10] , 而在共生条件下常会出现变异 , 且这种变异多发生在
非共生质粒上[ 11] , 可见 ,如果共生基因在低 M r质粒上则更容易丢失.当然 , 共生质粒并非都是最大的质粒 , 这
应与其来源有关.
也有的采集地菌株的质粒类型比较单纯 ,如 ZJ11 和GX1等 , 质粒型均为 1 个.4条带的 A、D型菌株极少 ,
3 条带的菌株约 28%, 2条质粒带的菌株最多且以 I、K、L 型居多 , 它们的大质粒大小相当 , 但是小质粒的 M r
不一.湖南 15 个采集地检出 12种类型时;浙江 7个采集地检出 9种类型;8 个采集地只检出 4 种类型 , 且以 3
3073期 郭先武等:紫云英根瘤分离菌株质粒多样性的研究 　　
条质粒带的类型占优.本研究结果表明 , 同一地区的质粒类型非常丰富.
表 2　受试菌株质粒型与 IGS 类型的比较
Table 2　Comparison of IGS types and plasmid types of tested strains
菌　株
Strains
质粒型
Plasmid types
IGS-型
IGS-types
菌　株
Strains
质粒型
Plasmid types
IGS-型
IGS-types
菌　株
St rains
质粒型
Plasmid types
IGS-型
IGS-types
ZJ8A16-1 P 1 ZJ8A7-2 M 1 ZJ9A3-2 P 1
ZJ9B14-5 P 1 ZJ10A16-2 L 1 ZJ10B11-2 L 2
ZJ11B5-1 K 1 ZJ11B14-1 K 3 ZJ118-3 K 2
ZJ13A9-2 L 3 ZJ14A1-3 P 1 ZJ15A25-1 H 3
ZJ13A6-2 I 3 ZJ13A4-3 B 3 ZJ13A7-1 G 3
ZJ13B16-1 B 3 ZJ15A26-3 K 8 ZJ15A11-1 K 3
ZJ15B7-1 E 1 JS3A10-3 1 2 JS3A23-1 M 1
JS3A13-2 N 1 GX11A20-3 L 3 GX11B10-4 B 3
GX11A17-1 L 3 GX11B29-3 L 3 GX11B9-3 K 1
HN1A11-1 K 1 HN1B12-1 I 2 HN2B3-1 I 1
HN2A18-2 I 1 HN3B4-1 K 1 HN4A9-2 K 2
HN4A8-1 K 1 HN5B15-2 G 1 HB6A4-1 K 4
HN8A1-1 O 4 HN8A3-2 F 2 HN8B11-2 L 4
HN9B26-1 M 6 HN10A14-1 L 1 HN11A18-2 P 3
HN11B22-1 H 1 HN13A9-1 O 3 HN13A11-1 I 4
HN13A3-2 K 13 HN14A16-2 K 1 HN15A6-1 O 13
HN15B4-1 D 2 HN15B23-2 M 14 JS3A5-1 N 1
JS3A14-1 N 1 js3a13-1 N 1 JS3A21-1 K 1
JS4A8-2 I 8 JS4A3-1 C 2 JS4B2-2 I 8
JS4B3-2 I 8 JS5A27-1 N 1 JS5A16-2 O 2
JS6A11-1 C 6 JS6B3-1 L 6 JS7A9-2 J 1
JS7A26-2 I 3 GX1A5-5 L 3 GX1A21-2 L 3
GX1B19-1 L 3 GX1B18-1 L 3 GX6A1-1 H 3
GX8B13-1 B 2 GX8B23-2 A 2 GX8A7-2 A 2
HN16A13-1 E 1 HN16A6-1 J 1 HN7A16-2 E 4
JX1A10-1 O 3 JX1B4-2 F 2 JX2A1-2 K 1
JX2A12-1 K 1 JX2B5-1 K 10 JX3A4-2 N 3
JX3B2-1 K 3 JX4A6-2 O 4 JX4B6-1 F 3
JX5A14-2 P 3 JX6A19-1 M 3 JX6B8-1 L 12
JX7A7-1 N 1 JX7A15-2 K 4 JX7A10-1 C 3
HNB2B3-1 C 2 HB2B5-1 C 2 HB5A1-2 1 14
HB5A4-1 K 14 HB6A8-1 B 2 HB7A6-1 K 2
HB8B8-1 B 2 HB9A16-1 C 2 HB9B11-2 B 2
HB11A20-2 B 2 HB12A6-1 K 2
Bradyrhizobium , M.loti 及Rhizobiuum sp.的少数菌株有质粒 , 但没有共生质粒[ 8].邹向宏[ 1] 也曾发现 , 含 1
个质粒的华癸根瘤菌没有共生质粒 ,但本研究中的含 1个质粒的菌株其质粒也是共生质粒 , 可见该种根瘤菌
质粒的多样性丰富.
16S rDNA位于染色体 ,是反映物种水平差异的重要指标.16S～ 23S rDNA IGS 主要反映了物种以下水平的
差异.我们用 PCR-RFLP分析获得的不同 IGS 类型从一个侧面反映了不同菌株的染色体背景的差异.质粒在特
定菌株中是比较稳定的 ,尤其是根瘤菌这样的大质粒.因此 , 从自然种群分离的菌株其质粒的分布及组成应是
菌株的内环境与菌株外环境共同作用(即进化的作用)的结果.这样在同一地点尤其是同一植物上分离出来的
菌株 ,若其质粒类型相同则有较大的机率其 IGS 类型相同.IGS 类型不同 ,则代表其细胞内环境有别 , 即使在同
一植株上分离的菌株其质粒类型表现不同极为常见.相同的 IGS 类型 的菌株在不同采集地其质粒类型没有
对应关系 , 因为其生存环境有别 , 如 IGS-1 型在不同采集地则对应完全不同的质粒类型 , IGS-3 型在 GX1 对应
质粒 L型 ,但在其它地区则情况完全不同.说明特定的质粒型是染色体背景与细菌外环境共同作用的结果.
Young
[ 12]也发现质粒在不同染色体背景中分布远非随机 ,认为质粒的进化与染色体背景有关.因此 , 两者应存
在协同进化.两者的关系乃至质粒的起源也是人们正在不断深入研究的问题 ,目前有许多证据说明 ,根瘤菌的
质粒可能是外源的[ 12] .外源的质粒完全可以解释本实验所揭示的现象.深入的工作有待于质粒携带的基因
308　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　应 用与 环境 生物 学 报　　　　　　　　　　　　　　　　　5卷
(nod 、nif 、repC 等)与 16S rDNA等染色体携带的管家基因的群体遗传学研究.
参考文献
1　Zou Xianghong , Cao Yanzhen , Li Fudi.Population diversity of rhizobia from the nodules of Astragalus sinicus.In:Li F D.et al ed.Di-
versity and Taxonomy of Rhiobia.Beijing:China Agricultural Scientech Press , 1996 , 25～ 221
2　Wang CL(王常霖), Chen JB(陈金标).The plasmids pattern and endo-antibiotic presistance of Rhigobium astiagalii strains.J
Huazhong Agri Univ(华中农业大学学报).1988, 7:15～ 21
3　ChenWL(陈雯莉), Li FD(李阜棣), Zhou JC(周俊初).Stabi lity of indigenous plasmids in Rhigobium fcedii stiains during culture and
symbiosis.Chin J Appl Envicon Biol(应用与环境生物学报).1997 , 3(1):55～ 62
4　Harrison SP , Jones DG , Schunmann PH.Variation in Rhizobium leguminosarum bv.trifolii symplasmid and the associationwith effec-
tiveness of nitrogen f ixation.J Gen Microbiol.1988, 134:2721～ 2730
5　Sambrook JF , Ritsch EF , Maniati sT.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.2nd ed.Cold Spring Harbor.NY:Cold Spring Harbor
Laboratory Press , 1989
6　Lagguerre G , Geniaux EA marger N.Conformity and diversity among field isolates of Rhizobium leguminosarum bv.vicie , bv.trifolii and
bv.phaeoli revealed by DNA hybridization using chromrosome and plasmid probes.Can J Microbiol.1993 , 39:412～ 419
7　InnisMA , Gelfand DH , Sinsky JJ , White TT.PCR protocols-A guide to methods and applications.San Diego:Academic Press , Inc.
Harcourt Brace Jovanovich , Publishers.San Diego.1990.3～ 91
8　Mercado-Blanco J , Toro N.Plasmids in Rhizobia:The role of nonsymbiotic plasmids.MPMI .1996 ,9(7):535～ 545
9　Hashem FM , Kuykendall D.Plasmid DNA content of several agrnomically important Rhizobirm species that nodulate alfalfa , berseem
clover , or l.eucaen.In:Graham PH , Sadowsky MJ&vance CP ed.Symiotic nivtrogen f ixtion.Netherlands:Kluwer Academic Publish-
ers, 1994, 181～ 188
10　Weaver RW.Stabi lity of plasmids in Rhizobium phaseoli during culture.Soil Biol Biochem.1990.22(1):165～ 169
11　Thurman NP , Lewis DM , Jones DG.The relationship of plasmid number to growth , acid tolerance and symbiotic efficiency in isolates of
Rhizobium trifolii.J Appl Bacteriol.1995 , 58:1～ 6
12　Young JP , Haukka K.Diversi ty and phylogeny of rhiobia.New Phyol.1996, 133:87～ 94
△关于以“量符修饰”代替“单位符修饰”问题
问:我是你刊的作者。为什么你刊将我论文中的单位符号“mgCu/ kg土”改为“ w(Cu)/mg kg-1”
或“ w(Cu)/10-6” ?
答:这里涉及GB 和 SI的一项基本原则:单位符号是全世界通用语言 , 不能对之加以修饰或限
定。例如 , 我们只能说某物质 X在 b 溶液条件下的最大质量浓度(ρ)为 50 g/L , 可以写成“ρb ,max(X)
=50 mg/ L” ,而不能写成“ρ=50 mgmax(X)/Lb” 。但是 ,当上述“ w(Cu)=25 mg/ kg”仍不能表达出你所
强调的关系(1 kg土壤中的 Cu 质量)时 , 可写成“m(Cu)m-1(土)=25 mg/ kg(或=25×10-6)” , 这也
是符合 SI和GB 的组合量规定的。
可以看出 , 可以通过对量符号加下标等修饰方式来解决单位符修饰问题 , 即用量符修饰代替单
位符修饰。
3093期 郭先武等:紫云英根瘤分离菌株质粒多样性的研究