全 文 ：药学研究
收稿日期:2008-01-18
作者简介:陈洪涛(1973—),男 ,学士 ,主管药师 ,主要从事中药化学及中药制剂质量控制的研究
大孔吸附树脂分离纯化榕树叶总黄酮的实验研究
陈洪涛1 ,蔡丹昭2 ,林立波1
(1.广西中医学院制药厂 ,广西 南宁　530023;2.广西医科大学 ,广西 南宁　530021)
　　摘　要:[ 目的] 研究大孔吸附树脂分离纯化榕树叶总黄酮的工艺条件及参数。[ 方法] 以静态饱和吸附量 、静态洗脱率 、动
态饱和吸附量 、动态洗脱率为考察指标 , 筛选最佳大孔吸附树脂用于分离纯化榕树叶总黄酮;以总黄酮回收率为指标 ,对最佳
树脂吸附工艺参数进行了研究 。[ 结果] 3 种树脂中 , AB-8 型树脂最佳 , 其工艺条件为:5 倍树脂体积的 70%乙醇洗脱 , 速度
2ml/ min。总黄酮收率为 89.61%,纯度为 65.02%。[结论] AB-8 型树脂综合性能较好 , 适用于榕树叶总黄酮的分离纯化。
　　关键词:榕树叶总黄酮;大孔吸附树脂;分离纯化
　　中图分类号:R284.1　文献标识码:A　文章编号:1008-7486(2008)02-0043-04
Separation and Purification of Total Flavones from Banyan Leaves
by Macroreticular Resin
CHEN Hong-tao1 , CAI Dan-zhao2 , LIN Li-bo1
(1.The Aff iliated Pharmaceutical Facto ry of Guangxi University of TCM , Nanning 530023 , China;
2.Department of biochemist ry , Guangxi medical Universi ty , Nanning 530021 , China)
　　Abstract:[ Objective] To investiga te the technological parameters of the purification process of to tal flavones from Banyan Leaves
w ith macroreticular resins.[ Methods] The static capacity abso rption , static elution ratio , dynamic absorption ratio , dynamic eluation
ratio of three types of macroreticular resins w ere studied respectively and compared in order to find the optimum macroreticular resin.
The technical process for purification of total flavones with the optimum macroreticular resin w as screened by purity and yield of to tal
flavones product.[ Results] AB-8 type macro reticular resin owned best abso rption and eluation parameters.The dynamic absorption ra-
tio was 105.88 mg/ g.After eluted with distilled w ater and 5BV of 70 % ethanol by the speed o f 2 ml/min , the yield of total flavones
w as 89.61 % and product purity w as 65.02%.[ Conclusions] The AB-8 type macro reticular resin showed better comprehensive ab-
so rption property.I t can be used to purify the total flavones from Banyan Leaves.
　　Key words:to tal flavones of Banyan Leaves;macroreticular absorbent resin;separation and purification
　　榕树叶为桑科榕属植物榕树(Ficus microcarpa L.f.)的
叶 ,为广西壮族民间常用药 , 有清热 、解表 、化湿 、活血散瘀的
功效 ,常用于治疗流行性感冒 、疟疾 、急性肠炎 、跌打损伤等
疾病。榕树叶中主要含黄酮苷 、香豆精等化学成分[ 1] 。近年
来对黄酮类化合物的药理作用有较多研究 ,发现其具有抗心
脑血管病 、抗氧化 、镇痛 、抗病毒 、抗肿瘤 、免疫调节等作
用[ 2-3] 。大孔吸附树脂是由聚合单体和交联剂 、致孔剂 、分
散剂等添加剂经聚合反应制备而成的一类有机高聚物吸附
剂。目前已被广泛应用于多种植物黄酮类化合物的分离提
纯中[ 4] 。由于现阶段对榕树叶黄酮类化合物的研究不多 , 尚
未能确定其分子结构 ,因此本实验筛选了三种不同极性的大
孔吸附树脂:D101(非极性)、AB-8(弱极性)、HPD-450(中极
性), 以确定最适于分离纯化榕树叶总黄酮的大孔吸附树脂 ,
并对最佳大孔吸附树脂分离纯化榕树叶总黄酮的工艺参数
进行了研究。
1　仪器与试药
1.1　仪器　SG3300H 超声波清洗器(上海冠特超声仪器有
限公司);UV-2500 分光光度计(日本岛津);SHBⅢ循环水式
多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);ZFQ85A 旋转蒸发
仪(上海医械专机厂)。
1.2　试剂　芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);榕树
叶(采自广西药用植物园);大孔吸附树脂 D101(天津骨胶
厂);AB-8(南开大学);HPD-450(河北沧州宝恩化工有限公
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司);95%乙醇 、亚硝酸钠 、硝酸铝 、氢氧化钠等皆为分析纯。
2　实验方法与结果
2.1　总黄酮含量测定[ 5]
2.1.1　标准曲线绘制　精密称取干燥芦丁对照品 20mg , 置
100ml容量瓶中 , 加 70%乙醇溶液适量溶解 , 定容 , 得标准对
照液(含无水芦丁 0.2000g/ L)。分别精密吸取芦丁对照液
0 、1.5、2.5 、3.5、4.5 、5.5ml置 25ml容量瓶中 , 补 70%乙醇
至 6ml;分别精密加入 50g/ L 亚硝酸钠溶液 0.75ml , 摇匀 , 静
置 6min;再分别精密加入 100g/ L 硝酸铝溶液 0.75ml , 摇匀 ,
静置 6min;最后分别精密加入 40g/ L氢氧化钠溶液 10ml , 以
70%乙醇稀释至刻度 , 摇匀 , 静置 15min;以第一瓶溶液为空
白对照调零 ,于 510nm 处测各瓶溶液吸光度。以浓度(C)和
吸光度(A)进行线性回归 ,得方程为:A=5.8251C+0.0168;r
=0.9999。
2.1.2　样品测定　收集各洗脱液并定容至适当体积 , 精密
量取液体样品 0.2ml , 置 25ml量瓶中 ,补 70%乙醇至 6ml , 按
2.1.1 项下“分别精密加入 50g/ L 亚硝酸钠溶液…”起操作 ,
于 510nm 处测定吸光度 , 根据回归方程计算各样品总黄酮浓
度 ,并计算样品总黄酮量及总黄酮回收率。
总黄酮量(mg)=样品总黄酮浓度×样品体积
总黄酮回收率(%)=洗脱液总黄酮量 ÷供试液总黄酮
量×100%
2.2　榕树叶供试液的制备　取新鲜榕树叶 , 烘干 , 粉碎 , 准
确称取榕树叶粉 10g , 置于 250ml锥形瓶中 , 加 16 倍量 70%
乙醇超声提取 3 次 ,每次 40min , 滤过 ,合并滤液 , 减压回收溶
剂 ,滤过 , 滤液置 25ml容量瓶中 , 蒸馏水定容备用。按 2.1.2
项下操作测得供试液总黄酮浓度为 8.60mg/ ml。
2.3　大孔吸附树脂的预处理　分别取三种大孔吸附树脂 ,
以 95%乙醇浸泡 24h ,湿法装柱 , 95%乙醇清洗 ,至流出液与
水混合(1∶5)无白色混浊为止 , 再以大量蒸馏水清洗柱子至
流出液无醇味。
2.4　树脂筛选
2.4.1　静态吸附-洗脱研究
2.4.1.1　静态饱和吸附试验　精密称取三种经预处理的湿
树脂各 3g ,置 100ml 具塞锥形瓶中 , 加榕树叶供试液 20ml ,
每隔 10min 振摇 30s ,持续 3h ,分别于静置 19、21 、23 、25h 时 ,
各取上清液 0.2ml , 按 2.1.2 项下操作 ,测定各种吸附树脂对
榕树叶总黄酮的静态吸附情况。结果发现静置 21h 后 ,各上
清液中榕树叶总黄酮含量变化不大 , 说明静置 21h 后 , 各类
树脂对榕树叶总黄酮已达最大静态吸附。
2.4.1.2　静态吸附-洗脱试验　精密称取三种经预处理的
湿树脂各 3g(另取湿树脂各 3g 干燥至恒重 ,计算干湿树脂重
量比例),置 100ml具塞锥形瓶中 , 加榕树叶供试液 20ml , 每
隔 10min 振摇 30s , 持续 3h ,静置 21h , 使其达到饱和吸附 , 过
滤 ,滤液定容至 25ml , 按 2.1.2 项下操作测定 ,计算滤液总黄
酮量及树脂静态饱和吸附量。过滤所得树脂另置 100ml具
塞锥形瓶中 , 加 95%乙醇 20ml , 每隔 10min 振摇 30s , 持续
3h ,然后静置 21h , 使所吸附总黄酮完全洗脱 ,过滤 , 所得洗脱
液定容至 25ml ,按 2.1.2 项下操作测定 , 计算洗脱液总黄酮
量及静态洗脱率。实验平行进行 3 次 , 取平均值为结果 , 见
表 1。
静态饱和吸附量(mg/ g 干树脂)=(供试液总黄酮量-
吸附后滤液总黄酮量)÷干树脂量
静态洗脱率(%)=洗脱液总黄酮量÷(供试液总黄酮量
-吸附后滤液总黄酮量)×100%
　　　　　　　　　　　　　　　　　　表 1　静态吸附-洗脱工艺试验结果 (n =3)　　　　　
树脂类型 样品总黄酮量(mg) 干湿树脂重量比 静态饱和吸附量(mg/ g) 静态洗脱率(%)
D101 172 0.33 87.87 66.35
AB-8 172 0.32 110.91 79.69
HPD-450 172 0.35 102.93 63.11
　　结果说明 ,在静态吸附-洗脱试验中 , AB-8 型树脂吸附
的榕树叶总黄酮量较大 , 且较易洗脱 , 表现出最佳的综合性
能。
2.4.2　动态吸附-洗脱研究　分别精密称取经预处理的三
种吸附树脂 3g(湿重), 湿法装入 1.5cm ×20cm 的色谱柱中;
精密吸取 20ml榕树叶供试液分别上柱 , 用蒸馏水洗至无色
后 , 95%乙醇洗脱 , 收集过柱流出液(包括水洗液)及洗脱液 ,
回收溶剂 ,分别定容至 25ml ,按 2.1.2 项下操作测定吸光度 ,
计算榕树叶总黄酮动态饱和吸附量及总黄酮洗脱率 , 实验平
行进行 3 次 ,取平均值 , 见表 2。
总黄酮动态饱和吸附量(mg)=上柱总黄酮量-过柱流
出液总黄酮量
总黄酮洗脱率(%)=洗脱液总黄酮量 ÷总黄酮动态饱
和吸附量×100%
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　表 2　动态吸附-洗脱试验结果 (n =3)　　
树脂类型 上柱总黄酮量(mg) 过柱流出液总黄酮量(mg) 总黄酮动态饱和吸附量(mg) 洗脱液总黄酮量(mg) 总黄酮洗脱率(%)
D101 172 76.80 95.20 81.09 86.03
AB-8 172 70.36 101.64 96.11 94.56
HPD-450 172 62.31 109.69 84.31 76.86
·44· Journal of Guangx i T raditional Chinese Medical University　　　　　　　　2008 , Vol.11 No.2
　　结果显示 ,在筛选的 3 种树脂中 , 用 AB-8树脂纯化分离
榕树叶总黄酮时 , 洗脱液中总黄酮量和总黄酮洗脱率均最
高 ,故确定 AB-8 树脂为分离纯化榕树叶总黄酮的最佳树脂。
且根据干湿树脂重量比换算 , 每克 AB-8 干树脂对榕树叶总
黄酮的饱和吸附量为 105.88mg , 因此上柱总黄酮量与所用
干树脂的比例应<1∶10。
2.5　AB-8 树脂纯化分离榕树叶总黄酮的工艺参数考察
2.5.1　乙醇浓度的确定　精密称取 5 份 AB-8 树脂 , 每份 3g
(湿重),湿法装柱(1.5cm×20cm);精密吸取 5ml榕树叶供试
液分别上柱 ,以蒸馏水洗至无色 , 再分别用 20%、30%、50%、
70%、95%乙醇(V∶V)洗脱至洗脱液无色 ,分别收集洗脱液 ,
回收溶剂 ,定容于 25ml量瓶中 ,按 2.1.2 项下操作测定吸光
度 ,计算洗脱液总黄酮量及总黄酮回收率 , 实验平行进行 3
次 ,取平均值为结果 , 见表 3。
总黄酮回收率(%)=(洗脱液总黄酮量 ÷ 上柱总黄酮
量)×100%
表 3　乙醇浓度对 AB-8树脂分离纯化榕树叶总黄酮的影响
(n =3)　　
乙醇浓度(V∶V)(%)
上柱总黄酮量(mg)
洗脱液总黄酮量(mg)
总黄酮回收率(%)
20 43 2.45 5.70
30 43 21.76 50.60
50 43 35.45 82.44
70 43 39.73 92.40
95 43 38.13 88.67
　　从表 3 结果可见 , 用 70%的乙醇洗脱 , 洗脱液中榕树叶
总黄酮量及总黄酮回收率均最高 , 因此 , 最佳洗脱剂浓度确
定为 70%乙醇。
2.5.2　洗脱速度的确定　分别吸取榕树叶供试液 5ml上 4
根 AB-8 树脂柱(1.5cm×20cm , 3g湿树脂),蒸馏水洗至无色
后 ,以 70%乙醇分别以 1 、1.5、2 、2.5ml/min 的速度洗脱 , 收
集洗脱液 ,定容于 25ml量瓶中 ,按 2.1.2 项下操作测定吸光
度 ,计算洗脱液总黄酮量及总黄酮回收率 , 实验平行进行 3
次 ,取平均值 , 见表 4。从结果可见 , 洗脱流速 2ml/min 时 , 洗
脱液总黄酮量及总黄酮回收率均最大 , 故确定洗脱流速为
2ml/ min。
表 4　洗脱速度对 AB-8树脂分离纯化榕树叶总黄酮的影响
(n =3)　　
洗脱速度(ml/ min) 上柱总黄酮量(mg) 洗脱液总黄酮量(mg) 总黄酮回收率(%)
1.0 43 34.11 79.32
1.5 43 38.67 89.93
2.0 43 40.28 93.67
2.5 43 38.13 88.67
2.5.3　洗脱液用量的确定　吸取榕树叶供试液 15ml上 AB-
8 树脂柱(1.5cm×30cm , 10g 湿树脂), 蒸馏水洗至无色后 ,
70%乙醇洗脱 ,流速 2ml/min , 收集洗脱液 ,每 15ml为 1 个流
分 ,共收集 10 个流分 ,测定各流分中的吸光度 , 计算总黄酮
量 ,绘制洗脱曲线(图 1)。从曲线可见 ,第 5流分时大部分总
黄酮已被洗脱 ,经计算前 5 流分所洗脱总黄酮量占总洗脱量
的 99.8%。因此最佳洗脱剂用量为树脂床的 5 倍体积。
图 1　榕树叶总黄酮洗脱曲线
2.5.4　吸附-洗脱周期实验　按照筛选结果所得条件 , 准
确称取 10g湿树脂 , 湿法装柱(1.5cm×30cm), 吸取榕树叶供
试液 15ml上柱 , 蒸馏水洗至无色 , 用 5 倍体积的 70%乙醇 ,
以 2ml/ min 速度洗脱 ,收集洗脱液 ,为 1 个周期。重复实验 ,
将各次收集的洗脱液减压回收溶剂 , 定容至 25ml , 按 2.1.2
项下操作测定吸光度 , 计算总黄酮回收率。实验平行进行 3
次 ,取平均值 , 见表 5。 从结果可知 , 树脂重复使用至第 4 周
期时 , 总黄酮回收率降到 74.5%, 已不符合要求 , 需进行再
生。
表 5　AB-8 树脂分离纯化榕树叶总黄酮吸附-洗脱周期
(n =3)　　
周期数 洗脱液总黄酮量(mg) 总黄酮回收率(%)
1 122.40 94.88
2 114.89 89.06
3 109.52 84.90
4 96.11 74.50
5 85.92 66.60
6 59.63 46.22
7 53.19 41.23
8 45.68 35.41
9 37.63 29.17
2.6　验证试验　准确吸取榕树叶供试液 15ml上 AB-8 树脂
柱(1.5cm×30cm , 10g 湿树脂), 蒸馏水洗至无色后 , 予 5 倍
树脂体积的 70%乙醇洗脱 , 流速 2ml/min , 收集洗脱液 ,回收
溶剂 ,定容至 25ml , 按 2.1.2 项下操作测定吸光度 ,计算总黄
酮回收率;另取 10ml洗脱液于 60℃烘干至恒重 , 计算总黄酮
纯度。结果经 AB-8 型大孔吸附树脂分离纯化后榕树叶总黄
酮回收率达 89.61%, 总黄酮纯度可达 65.02%, RSD =
0.29%(n =3)。
3　讨　论
3.1　总黄酮为榕树叶主要有效成分 , 为了获得高纯度的榕
树叶总黄酮 ,我们对 D101 、AB-8、HPD-450三种型号大孔吸附
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树脂进行了筛选 ,经考察静态及动态吸附-洗脱情况 , 确定
AB-8 型大孔吸附树脂对榕树叶总黄酮有较好的分离纯化能
力。
3.2　AB-8 型树脂富集榕树叶总黄酮工艺条件为:上柱总黄
酮量与所用干树脂的比例应<1∶10 , 洗脱剂为 70%乙醇 , 洗
脱剂用量为 5 倍树脂体积 ,洗脱速度为 2ml/ min , 树脂可重复
使用 3 次。在此条件下 ,用 AB-8 树脂吸附分离总黄酮 ,乙醇
洗脱物中榕树叶总黄酮回收率达 89.61%, 总黄酮纯度达
65.02%。
3.3　应用 AB-8型大孔吸附树脂分离纯化榕树叶总黄酮 , 具
有收率高 、成本低 、操作简便等优点 , 可考虑用于大规模生
产。
参考文献
[ 1] 朱　华.中国壮药志[ M] .南宁:广西民族出版社 , 2003:
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[ 2] 曹纬国 , 刘志勤 , 邵　云 , 等.黄酮类化合物药理作用的
研究进展[ J] .西北植物学报 , 2003 , 23(12):2241-2247.
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展[ J] .中国中药杂志 , 2000 , 25 (10):589-592.
[ 4] 于智峰 ,王　敏.大孔吸附树脂在黄酮类化合物分离中
的应用[ J] .中药材 , 2006 , 29 (12):1380-1384.
[ 5] 盛　萍 , 帕丽达·阿不力孜 , 刘　波 , 等.大孔树脂吸附法
富集野菊花总黄酮的工艺研究[ J] .中草药 , 2006 , 37(8):
1170-1173.
(编辑　陈明伟)
收稿日期:2008-01-07
HPLC测定喉痛灵胶囊中绿原酸含量
吴胜君1 ,谷薇薇2
(1.河池市第三人民医院 ,广西 河池　547000;2.广西中医学院 ,广西 南宁　530001)
　　摘　要:[ 目的] 建立喉痛灵胶囊中绿原酸的含量测定方法。[ 方法] 采用 HPLC 法 , ODS-C18柱为色谱柱 ,乙腈-0.1%磷酸
溶液(9∶91)为流动相;流速为 1.0ml/ min;进样量为 10μl;检测波长为 327nm。[结果] 绿原酸进样量在 0.102～ 1.024μg 范围内
线性良好;平均回收率为 98.88%, RSD为 1.09%(n =6)。[ 结论] 本文建立的 HPLC 法可作为喉痛灵胶囊中绿原酸的含量
测定方法。
　　关键词:绿原酸;喉痛灵胶囊;HPLC
　　中图分类号:R284.1　文献标识码:A　文章编号:1008-7486(2008)02-0046-03
Determination of Chlorogenic acid in Houtongling Capsule by HPLC
WU Shen-jun1 ,GU Wei-wei2
(1.the third people s hospital in hechi ,hechi , guangxi , 547000;2.Guangxi university of TCM)
　　Abstract:[ Objective] To search a method for determining chlo ro genic acid in Houtongling capsule.[ Methods] The ODS-C18 col-
umn w as used.The mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid so lution(9∶91).The flow rate was 1.0ml/ min.The detec-
tiv e w avelength was 327nm.[ Results] The sample size of chlorogenic acid w as 0.102 ～ 1.024μg , The average recovery ra te was 98.
8%, RSD w as 1.1%(n =6).[ Conclusions] The method is simple , fast and accurate.I t can be used for the quality control of Hou-
tongling capsule.
　　Key words:HPLC;Houtong ling capsule;Chlorogenic acid
　　喉痛灵胶囊是笔者根据《卫生部药品标准中药成方制
剂》第五册喉痛灵冲剂剂改品种 ,改剂型后服用体积大为减
少 ,并为患者提供更多的制剂规格予以选择。喉痛灵胶囊由
水牛角浓缩粉 、板蓝根 、野菊花 、荆芥穗组成 , 具有清热 、解
毒 、消炎 、利咽喉功效 ,临床用于治疗咽喉炎 、急性化脓性扁
桃体炎 、感冒发热 、疔疮等症[ 1] 。原剂型质量标准中无含量
测定项 , 本文对喉痛灵胶囊中绿原酸含量测定进行研
究[ 2 ～ 4] , 建立喉痛灵胶囊的含量测定质量标准。
1　仪器与试药
Agilent 1100 高效液相色谱仪;Phenomenex PRODIGY
(5μm , 4.6mm×250mm)色谱柱。
绿原酸(供含量测定用 , 中国药品生物制品检定所提供 ,
·46· Journal of Guangx i T raditional Chinese Medical University　　　　　　　　2008 , Vol.11 No.2