全 文 ：天然产物研究与开发 Nat Prod Ｒes Dev 2015，27:1448-1452，1384
文章编号:1001-6880(2015)8-1448-06
收稿日期:2014-12-03 接受日期:2015-04-13
基金项目:国家自然科学基金(31360078);新疆“天山英才工程”
项目(Y0382026);新疆医科大学博士科研启动基金
(80-91071801)
* 通讯作者 Tel:86-991-3835679;E-mail:haji@ ms． xjb． ac． cn
榅桲总多酚的纯化工艺及 PTP1B抑制作用研究
哈及尼沙1，阿力木江·阿布力孜2，阿米娜1，阿吉艾克拜尔·艾萨2*
1新疆医科大学药学院;2 中国科学院干旱区植物资源化学重点实验室 中国科学院新疆理化技术研究所，乌鲁木齐 830011
摘 要:通过采用 11 种大孔吸附树脂对榅桲多酚粗提物的静态吸附和解吸试验，筛选出适合分离纯化榅桲总多
酚的最优树脂，并对其动态吸附特性和影响因素进行研究。结果表明:最佳纯化工艺条件为:AB-8 大孔吸附树
脂做吸附填料，上样液质量浓度 0． 04 g /mL，以 2 BV /h的吸附速率进行吸附，上样量为 11 BV，用 3 BV蒸馏水除
杂后，以 50%乙醇溶液为洗脱剂，洗脱液用量为 4 BV，洗脱流速控制在 2 BV /h。经 AB-8 树脂吸附富集后，样品
总多酚质量浓度达到了 30． 11 mg /g，是粗提物(9． 55 mg /g)的 3 倍。对纯化前后的榅桲总多酚进行 PTP1B的抑
制作用研究，结果显示，榅桲总多酚对 PTP1B有较强的抑制作用，即榅桲总多酚纯化前的 IC50为 78． 14 μg /mL，
用 AB-8 树脂纯化后所得总多酚的 IC50为 16． 12 μg /mL。
关键词:榅桲;AB-8 大孔吸附树脂;总多酚;纯化;PTP1B抑制作用
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标识码:A DOI:10． 16333 / j． 1001-6880． 2015． 08． 025
Purification and PTP1B Inhibition Activity of Total
Polyphenols from Cydonia oblonga Mill．
Hajinisa 1，ALIMJAN Abuliz2，Amina1，HAJI AKBEＲ Aisa2*
1College of Pharmacy，Xinjiang Medical University;2The Key Laboratory of Plant Ｒesources
and Chemistry of Arid Zone，Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Urumqi 830011，China
Abstract:In this study，11 types of macroporous resins were screened for the purification of Cydonia oblonga Mill． poly-
phenols． The optimal resin was selected through static absorption and desorption experiments． Furthermore，its dynamic
absorption features and influencing factors were analyzed． The results showed that the optimal conditions for purification
were as follows:macroporous resin AB-8 had the best separation efficiency when the concentration of sample solution was
0． 04 g /mL，the adsorption flow rate was 2 BV /h，the loading weight was 11 BV，removing impurities by 3 BV of distilled
water and eluting the total polyphenols with 4 BV of 50% ethanol-water at flow rate of 2 BV /h． The concentration of total
polyphenols of the product after the adsorption concentrating on AB-8 resin achieved 30． 11 mg /g，which was 3 times of
crude extract (9． 55 mg /g)． The PTP1B inhibition effect of polyphenol extracts before and after the purification process
was also discussed． The results indicated that，the total polyphenols of C． oblonga had strong inhibition effect on PTP1B
with IC50 value of 16． 12 μg /mL after purification by AB-8 resin and the IC50 value was 78． 14 μg /mL before purifica-
tion．
Key words:Cydonia oblonga Mill．;macroporous resin;total polyphenols;purification;PTP1B
榅桲(Cydonia oblonga Mill．)是蔷薇科(Ｒosace-
ae)榅桲属(Cydonia)植物榅桲的成熟果实［1］。榅桲
有浓郁香味，酸甜，性温无毒。榅桲在新疆民间被当
作水果、药品及调料品使用，具有补身益心、增益精
神力、助胃利水、止渴止咳、止血止泻、开胃等作用，
相传已有数百年应用历史［2］。据典籍记载及现代
研究表明，榅桲具有较高的食用和药用价值，是维吾
尔医常用药材［3，4］。榅桲中主要有效成分是多酚类
化合物［5-7］，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗病毒等活
性［8-12］。目前对榅桲中多酚类物质的提取、纯化方
面没有发现相关文献报道。
大孔树脂为一种有机高聚物吸附剂，具有吸附、
富集、分离不同母核结构化合物的功能［13］。该方法
具有设备简单、操作方便、节省能源、成本低、产品纯
度高、不吸潮等优点，应用于多酚类成分的富集、纯
化有较好的效果［14］。
本研究从 11 种大孔吸附树脂中筛选出对榅桲
总多酚具有良好吸附和解吸性能的树脂，探索适宜
的纯化条件;同时对榅桲总多酚进行 PTP1B 抑制作
用的研究，为合理开发利用榅桲资源提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 材料与仪器
榅桲采自新疆克州上阿图什乡，经中科院新疆
生态与地理研究所植物分类研究室沈观冕研究员鉴
定为蔷薇科榅桲属植物榅桲 (Cydonia oblonga
Mill．)的果实;HPD-100、HPD-300、HPD-450、HPD-
750 型大孔吸附树脂，上海五维化工科技有限公司;
D101 型大孔吸附树脂，上海摩速科学器材有限公
司;D140、NKA-9、AB-8、X-5、DM130 型大孔吸附树
脂，南开大学化工厂;ADS-17 型大孔吸附树脂，山东
鲁抗医药股份有限公司;没食子酸对照品(批号:
110831-20120)，中国食品药品检定研究院;其他试
剂均为国产分析纯。
UV-2550 型紫外分光光度仪，日本岛津;Buchi
Ｒ-210 型旋转蒸发仪，瑞士 Buchi公司;YP5120 型电
子分析天平，上海光正医疗仪器有限公司;HH-4 型
智能数显恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公
司;HZQ-F160 型全温震荡培养箱，金坛市万华实验
仪器厂;SpectraMax MD5 型酶标仪，美谷分子仪器有
限公司;DZF-6020 型真空干燥箱，上海一恒科学仪
器有限公司。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 没食子酸标准曲线的绘制
精密称取没食子酸对照品 6． 1 mg，加水溶解并
定容至 100 mL，摇匀，制成浓度为 61 μg /mL的对照
品溶液。准确吸取没食子酸对照品溶液 0、0． 5、
1. 0、2． 0、3． 0 和 4． 0 mL于 25 mL容量瓶中，加磷钼
钨酸溶液 1． 0 mL，加蒸馏水 14 mL，再用 29%碳酸
钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置 30 min。以没加对照
品的溶液作为空白，在 500 ～ 900 nm 波长范围光谱
扫描，确定 757 nm处的最大吸收为检测波长，测定
各标准溶液的吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，浓
度(C，μg /mL)为横坐标，绘制标准曲线，其线性回
归方程为 A = 0． 1196C + 0． 0408，相关系数 r =
0. 9993。结果表明，在没食子酸质量浓度为 1． 22 ～
9． 76 μg /mL范围内吸光度和浓度保持较好的线性
关系。
1． 2． 2 榅桲总多酚粗提物的制备
称取榅桲果实粉末约 250 g，在乙醇体积浓度
60%、料液比 1∶ 40(g /mL)、提取时间 1 h、温度 80 ℃
的条件下回流提取 2 次，合并提取液减压浓缩至无
乙醇味，干燥得粗多酚浸膏，加蒸馏水超声溶解配制
榅桲总多酚提取液(药液质量浓度为 1． 630 g /mL)，
备用。
1． 2． 3 大孔吸附树脂的预处理
分别称取 AB-8、D-140、X-5、HPD-100、HPD-
450、HPD-300、HPD-750、ADS-17、D-101、DM-130、
NKA-9 型等 11 种大孔吸附树脂各 3． 0 g，分别加入
30 mL无水乙醇浸泡 24 h，使其充分溶胀，用湿法装
柱。用无水乙醇以 2 BV /h 的流速淋洗树脂至流出
液加入蒸馏水后不呈现白色浑浊为止，再用蒸馏水
以同样的流速洗至无醇味。然后用 5% HCl溶液以
2 BV /h 流速通过树脂并浸泡 3 h，用蒸馏水洗至中
性。再用 2% NaOH溶液，以 2 BV /h流速通过树脂
并浸泡 3 h，用蒸馏水洗至中性。
1． 2． 4 大孔吸附树脂的筛选
1． 2． 4． 1 大孔树脂对榅桲总多酚吸附率的测定
准确称取预处理过的大孔树脂各 2． 0 g，置于磨
口锥形瓶中，分别加入样品液 30 mL，密封，摇匀，在
室温放置 24 h，时时振摇至吸附平衡。分别精密量
取各树脂吸附后的溶液 0． 4 mL于 25 mL容量瓶中，
显色后于 757 nm处测定吸光度，计算各滤液中总多
酚的浓度，按下面的公式计算总多酚吸附量和吸附
率。
吸附量(mg /g树脂)=［(C0-C1)× V1］/W
吸附率(%)=［(C0-C1)/C0］× 100
式中:C0 为初始样品液质量浓度(mg /mL);C1
为吸附后上清液中样品液质量浓度(mg /mL);V1 为
加入样品液体积(mL);W大孔吸附树脂质量(g)。
1． 2． 4． 2 大孔树脂对榅桲总多酚解吸率的测定
将上述吸附饱和的 11 种大孔树脂过滤后，加入
60%的乙醇溶液 30 mL，密封后摇匀，在室温放置 24
h，时时振摇，使榅桲总多酚解吸附，过滤，精密量取
各树脂解吸附后的溶液 0． 4 mL，于 25 mL 容量瓶
中，显色，测定吸光度，计算各种树脂对榅桲总多酚
的解吸率。
解吸率 t (%)=［(C2 × V)/ (W × CA)］× 100
式中:CA 为吸附量(mg /g 树脂);C2 为解吸液
中多酚液质量浓度(mg /mL);V 为所加乙醇的体积
(mL);W为大孔吸附树脂质量(g)。
9441Vol. 27 哈及尼沙等:榅桲总多酚的纯化工艺及 PTP1B抑制作用研究
1． 2． 5 大孔树脂动态吸附-解吸条件的优化
由筛选实验选出一种理想大孔吸附树脂，按
1. 2． 3 方法先进行预处理，湿法装入 1． 5 × 25． 0 cm
层析柱中，分别考察上样液质量浓度、上样量、上样
流速和洗脱液浓度、洗脱液用量、洗脱流速等进行动
态吸附及解吸实验，确定最佳工艺条件。
1． 2． 6 PTP1B抑制作用的研究
将用大孔吸附树脂纯化前后的榅桲多酚按照文
献［15］方法，即样品用适量 DMSO溶解，取 1 μL加入
至 200 μL 反应体系中(pH 6． 0，1 mmol /L EDTA，
0. 1 mol /L NaCl，5 mmol /L DDT，50 mmol /L 柠檬
酸)，加入底物 pNPP 至 10 mmol /L，加人人重组
PTP1B(PＲOSPEC)0． 5 μg 开始反应，37 ℃保温 30
min，加入 10 mmol /L NaOH 20 μL终止反应，用酶标
仪在 405 nm测定吸收度(A)值，以原钒酸钠作为阳
性对照，以不加 PTP1B为空白对照，计算抑制率:
抑制率 =(OD405空白-OD405样品)/OD405空白 × 100%
应用 Origin软件计算 IC50值，以此判断榅桲总
多酚对 PTP1B的抑制能力。
2 结果与分析
2． 1 大孔树脂的筛选
如表 1 所示，11 种大孔吸附树脂对榅桲多酚的
吸附率和解吸率均有不同。其中对榅桲多酚的吸附
量较大的三种树脂依次为 HPD-300、HPD-100、AB-8
型树脂。这可能是大孔树脂的吸附原理主要为物理
吸附，比表面积越大，表面张力随之增大，吸附量就
会提高。这三种树脂的解吸率看，前两种树脂的解
吸率低，AB-8 型大孔树脂的解吸率在 11 种树脂中
最高(79． 68%)。AB-8 型大孔树脂比表面积中等，
且具有较大的孔径，吸附-解吸综合性能比较合理，
因此选择 AB-8 型大孔吸附树脂来分离纯化榅桲总
多酚。
表 1 11 种大孔树脂的性质和静态吸附与解吸数据
Table 1 Physical properties and static adsorption-desorption rate of 11 macroporous resins
树脂种类
Ｒesin types
极性
Polarity
比表面积
Surface area
(m2 /g)
平均孔径
Diameter
(nm)
吸附量
Absorbance
(mg /g)
吸附率
Adsorption
rate (%)
解吸率
Desorption
rate (%)
D-101 非极性 400 ～ 600 9 ～ 11 24． 60 75． 39 74． 73
D-140 非极性 500 ～ 600 9． 5 25． 38 77． 40 65． 48
X-5 非极性 500 ～ 600 29 ～ 30 23． 46 71． 55 74． 17
HPD-100 非极性 650 ～ 700 9 ～ 10 27． 21 82． 98 69． 46
AB-8 弱极性 480 ～ 520 13 ～ 14 25． 71 78． 41 79． 68
DM-130 弱极性 500 ～ 550 9 ～ 10 25． 23 76． 94 70． 15
HPD-300 弱极性 800 ～ 870 5 ～ 5． 5 27． 63 84． 26 69． 71
HPD-450 弱极性 500 ～ 550 9 ～ 11 25． 20 76． 85 67． 26
ADS-17 中极性 90 ～ 120 25 ～ 30 23． 61 72． 00 55． 53
HPD-750 中极性 650 ～ 700 8． 5 ～ 9 25． 50 77． 58 70． 58
NKA-9 极性 250 ～ 290 15 ～ 16． 5 20． 05 68． 45 60． 30
2． 2 大孔吸附树脂动态吸附条件的优化
2． 2． 1 上样液浓度的选择
将榅桲多酚样品液稀释成 0． 02、0． 04、0． 06、
0. 08、0． 16 g /mL 等不同浓度的上样液，以 2 BV /h
的流速上样，测定流出液中榅桲总多酚的浓度，计算
吸附量。结果如图 1 所示，当样液浓度小于 0． 04 g /
mL时，随着样液浓度的增加，吸附量增大，但高于
0． 04 g /mL后多酚吸附率又有所降低。所以，并不
是浓度越大吸附效果越好，药液的澄清度也会影响
树脂的吸附效果，上样液浓度过大时，榅桲多酚在树
脂内部扩散速度减慢，赌赛树脂空隙而影响吸附。
因此，选择上样液质量浓度为 0． 04 g /mL。
8.4
8.0
7.6
7.2
0 0.1% 0.2
吸
附
量
Ad
so
rp
tio
n%
qu
an
ity
(m
g/
g)
上样液浓度
Sample%concentration(g/mL)
图 1 上样液浓度对吸附量的影响
Fig. 1 Effect of sample concentration on adsorption capacity
0541 天然产物研究与开发 Vol. 27
2． 2． 2 上样液流速的选择
取 0． 04 g /mL榅桲提取液 9 BV，分别以 1、2、3、
4 BV /h的流速进行吸附，测定流出液中榅桲多酚的
浓度，计算出吸附量。由图 2 可知，随着上样流速的
增加，吸附量整体呈下降趋势。上样液流速越慢，被
吸附物质能充分扩散到树脂的内表面，从而吸附的
越完全［16］。为了节省时间，选择上样液流速以 2
BV /h较为适宜。
1% 2% 3% 4
吸
附
量
Ad
so
rp
tio
n%
qu
an
ity
(m
g/
g)
上样流速
Sample%flow%rate(BV/h)
11.0
10.9
10.8
10.7
10.6
10.5
10.4
图 2 上样流速对吸附量的影响
Fig. 2 Effect of sample flow rate on adsorption capacity
2． 2． 3 上样量的选择
取榅桲粗提取液以 2 BV /h 的流速上柱后，分
步收集漏出液，每 20 mL(1 BV)收集 1 个流份，测定
漏出液中榅桲多酚的浓度。结果如图 3 所示，随着
上样量的增加，流出液中榅桲多酚质量浓度不断上
升，上样量从 9 BV开始，泄露速度趋于比较稳定，即
9 ～ 14 BV 达到一个动态平衡。上样量达到 15 BV
时，流出液与上样液总酚含量几乎相等。但上样量
过多，不仅会使纯化周期将延长，工作效率降低，而
且会影响多酚总收率。综合考虑，选择上样量为 11
BV。
0% 5
上样体积
Sample%volumn(BV)
6
5
4
3
2
1
0总
多
酚
浓
度
To
ta
l%p
he
no
lic
s%
co
nc
en
tra
tio
n(
m
g/
m
L)
10% 15% 20
图 3 AB-8 大孔树脂对榅桲多酚的动态吸附曲线
Fig. 3 Adsorption curve of C． oblonga polyphenols on AB-8
resin
2． 3 大孔吸附树脂动态解吸条件的优化
2． 3． 1 除杂用水量的选择
将已吸附榅桲多酚提取液饱和的 AB-8 树脂
柱，用水以 1、2、3、4、5 BV /h 流速洗脱，测定流出液
中总多酚含量。由图 4 可知，开始时有少量未被吸
附的多酚冲洗下来，当用水量到 3 BV 时，流出液接
近无色，水洗脱体积 3 BV 后开始有微量多酚被洗
脱，因此选择水洗脱体积为 3 BV。能快速淋洗树脂
柱以除去蛋白质、多糖等水溶性杂质。
除杂用水量
Volume%of%elution%water(BV)
总
多
酚
浓
度
To
ta
l%p
he
no
lic
s%
co
nc
en
tra
tio
n(
m
g/
m
L)
1% 2% 3% 4% 5
0.20
0.15
0.10
0.05
0
图 4 除杂用水量的选择
Fig. 4 Selection of the volume of elution water
2． 3． 2 洗脱剂浓度的选择
取 0． 04 g /mL 榅桲提取液 11 BV 上 AB-8 大孔
树脂柱后，首先用蒸馏水 3 BV 洗去杂质，然后依次
用 30%、40%、50%、60%、70%、80%和 90%乙醇水
溶液各 3 BV洗脱，每 1 BV 收集 1 个流份，测定榅桲
多酚的质量浓度，计算解吸率。由图 5 可知，榅桲多
酚的解吸率随着乙醇体积分数不同有差别，乙醇浓
度 50%和 60%时解吸率分别为 80%和 79%。因
此，以 50%乙醇溶液作为最佳洗脱剂。
乙醇浓度
Ethanol%concentration(%)
20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90
90
80
70
60
50
40
洗
脱
率
De
so
rp
tio
n%
ra
te
(%
)
100
图 5 不同乙醇浓度洗脱榅桲多酚曲线
Fig. 5 Elution curve of C． oblonga polyphenols with different
concentrations of ethanol
2． 3． 3 洗脱液流速的选择
取 0． 04 g /mL榅桲提取溶液 11 BV，以 2 BV /h
流量上样吸附，依次用 3 BV 体积蒸馏水洗脱，分别
用 50%的乙醇溶液以 1、2、3 BV /h 的速度洗脱，收
集洗脱液，分别测定洗脱液中榅桲多酚的浓度。如
图 6 所示，当洗脱流速小于 2 BV /h 时，榅桲多酚质
量浓度随着流速的增大而增大;洗脱流速大于 2
BV /h 时，质量浓度随着洗脱流速的增大而减小。
这是由于洗脱流速太慢时，解吸时间长、解吸的杂质
多;2 BV /h 时洗脱液中榅桲多酚达到最大质量浓
度，因此选择 2 BV /h为最佳洗脱液流速。
1541Vol. 27 哈及尼沙等:榅桲总多酚的纯化工艺及 PTP1B抑制作用研究
洗脱流速
Elution%rate(BV/h)
总
多
酚
浓
度
To
ta
l%p
he
no
lic
s%
co
nc
en
tra
tio
n(
m
g/
m
L)
0.5% 1.0% 1.5% 2.0% 2.5% 3.0% 3.5
7
6
5
4
3
图 6 洗脱液流速的选择
Fig. 6 Selection of elution rate
2． 3． 4 洗脱液体积的选择
按上述 2． 2 中选择的上样条件进行层析，吸附
之后，用 3 BV 蒸馏水快速洗去水溶性杂质。用
50%乙醇溶液，流速为 2 BV /h进行洗脱，每 1 BV收
集 1 个流份，分别测定各流份中榅桲多酚的质量浓
度。如图 7 所示，洗脱液用量在 2 BV 以内时，洗脱
液中多酚浓度随洗脱液用量增大而升高，用量大于
2 BV后，50%乙醇洗脱液中多酚量随洗脱体积的增
大逐渐减少，到 5 BV时，洗脱液中几乎已无多酚，考
虑到生产成本，选择洗脱液体积为 4 BV。
洗脱体积
Elution%volume(BV)
总
多
酚
浓
度
To
ta
l%p
he
no
lic
s%
co
nc
en
tra
tio
n(
m
g/
m
L)
1% 2% 3% 4% 5% 6
16
12
8
4
0
图 7 洗脱体积的选择
Fig. 7 Selection of elution volume
2． 4 验证试验
按上述所确定的纯化榅桲多酚的吸附和洗脱条
件，重复试验 3 次，收集洗脱液，浓缩干燥的纯化物
浸膏总多酚质量浓度为 30． 11 mg /g，是粗提物
(9. 55 mg /g)的 3 倍。
表 2 榅桲总多酚的 PTP1B抑制活性
Table 2 The inhibition activity of total polyphenols from C． ob-
longa on PTP1B
总多酚含量
content of
total polyphenols
(mg /g)
IC50
(μg /mL)
抑制率
Inhibition
rate (%)
纯化前
Before purification 9． 55 78． 14 89． 40
纯化后
After purification 30． 11 16． 14 92． 40
2． 5 榅桲多酚对蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B)抑
制作用的研究
将得到的榅桲总多酚提取物进行 PTP1B 抑制
作用的研究。如表 2 所示，榅桲总多酚对 PTP1B 有
较强的抑制作用，用大孔树脂纯化后活性明显提高。
阳性对照原矾酸钠的 IC50为 1． 81 μg /mL。
3 结论
通过考察 11 种大孔吸附树脂，确定 AB-8 型大
孔树脂对榅桲多酚有较好的吸附和解吸性能，适用
于榅桲总多酚的纯化。最佳纯化条件为:上样浓度
为 0． 04 g /mL，上样量为 11 BV，上样流速为 2 BV /
h，用 3 BV蒸馏水除杂后，以 50%乙醇溶液为洗脱
剂，洗脱液用量为 4 BV，流速为 2 BV /h 进行洗脱。
在此条件下，经 AB-8 树脂纯化后，榅桲总多酚质量
浓度达到了 30． 11 mg /g，是粗提物的 3 倍。而且榅
桲总多酚对 PTP1B 有较强的抑制作用，其 IC50为
16． 14 μg /mL。实验表明，经树脂纯化，去除了大量
的杂质，提高了总多酚的含量和 PTP1B 抑制作用，
对榅桲总多酚有较好的精制效果。
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建立了一种快速测定女贞子药材中特女贞苷含量的
新方法，该方法简单准确，快速无污染。相比 2010
年版《中国药典》中规定采用高效液相色谱法对女
贞子中特女贞苷进行含量测定，虽然 HPLC 的测定
结果较准确，但是其前处理繁琐复杂，且化学试剂污
染空气环境，测定过程较长。反观近红外光谱技术，
分析速度快，获得信息多，简便快捷，非破坏性分析等
优点使其成为一种“绿色”分析技术，测定过程不用化
学试剂、不污染环境，真正实现“绿色”检验，节约检测
成本，将会在中药制药行业发挥越来越大的作用。
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