全 文 ：第 33 卷 第 6 期
2014 年 12 月
大 豆 科 学
SOYBEAN SCIENCE
Vol． 33 No． 6
Dec． 2014
铝胁迫下不同耐铝性黑大豆硝态氮吸收机理研究
陈东杰，王 平，庞晓璐，陈丽梅，李昆志
(昆明理工大学 生物工程技术研究中心，云南 昆明 650500)
摘 要:通过分析改良的 Hoagland营养液中添加 50 ～ 400 μmol·L －1 AlCl3处理铝耐受型黑大豆 ＲB和铝敏感型黑大豆
SB对 NO －3 吸收量与根中 H2O2含量、质膜 H
+ -ATP 酶磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白的互作、质膜 H + -ATP 酶活性及
H +泵活性的相关性来阐明铝胁迫下黑大豆根吸收 NO －3 的机理。结果表明:铝胁迫显著降低 ＲB和 SB对硝态氮吸收
量，在无铝胁迫和铝胁迫第一天，SB的硝态氮吸收量约为 ＲB 的 4 倍，但随着铝胁迫浓度的增加和铝胁迫时间的延
长，在每个处理中 ＲB的硝态氮吸收量反超 SB一倍以上。在正常情况下，ＲB 根中 H2O2含量比 SB 高，100 μmol·L
－1
铝胁迫使 SB根中 H2O2含量比 ＲB高约 4 倍，使 ＲB根中的质膜 H
+ -ATPase 活性和 H +泵活性分别比 SB 高约 7 倍和
10 倍。Co-IP分析证明 100 μmol·L －1铝胁迫诱导 ＲB根中质膜 H + -ATPase磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白相互作用，
但在 SB根中起抑制作用。铝胁迫可能通过改变根中积累的 H2O2来影响 ＲB和 SB的质膜 H
+ -ATPase的磷酸化水平，
从而改变磷酸化质膜 H + -ATP酶与 14-3-3 蛋白的相互作用，进而影响 ＲB和 SB根的质膜 H + -ATP酶活性和 H +泵活
性，最终表现为 ＲB和 SB硝态氮吸收量的不同。
关键词:黑大豆;铝毒;质膜 ATPase;14-3-3 蛋白;硝态氮吸收
中图分类号:S565． 1 文献标识码:A DOI:10． 11861 / j． issn． 1000-9841． 2014． 06． 0870
收稿日期:2014-03-13
基金项目:国家自然科学基金(31060258，31260063);滇池大河流域地下水污染机制及生态修复技术研究项目(KKK0201126044);云南省
中青年学术技术后备人才培养基金(2006PY01-10)。
第一作者简介:陈东杰(1990-)，男，硕士，主要从事植物营养基因工程研究。E-mail:495379298@ qq． com。
通讯作者:李昆志(1963-)，男，教授，博导，主要从事植物生理及生物学研究。E-mail:likunzhi63@ 126． com。
Study on the Mechanism of NO －3 Uptake by Different Al-tolerance Black Soy-
bean under Al Stress
CHEN Dong-jie，WANG Ping，Pang Xiao-lu，CHEN Li-mei，LI Kun-zhi
(Biological Engineering Technology Ｒesearch Center，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)
Abstract:The mechanism of Al stress on NO －3 uptake in the two types of black soybean would be clarified by studying the
correlation among the NO －3 uptake，H2O2 content，and phosphorylation level of PM H
+ -ATPase as well as its interaction with
14-3-3 proteins and the PM H + -ATPase activity and H + pump activity in the root tips of ＲB and SB in improved Hoagland so-
lution containing 50，100，200，400 μmol·L －1 Al． The results indicated that Al stress significantly reduced the amount of NO －3
uptake by ＲB and SB． On the first day of non-and Al-stress conditions，the NO －3 uptake by SB was approximately four times
than that of ＲB． However，with the increase of stress concentration and time，the amount of NO －3 uptake by ＲB in each treat-
ment was almost 2-fold greater than that by SB． Under normal conditions，the H2O2 content in the ＲB root tips was greater than
SB． Under 100 μmol·L －1 Al stress，the H2 O2 content in the SB root tips was approximately four times greater than ＲB root
tips． The PM H + -ATPase and H + pump activities in the ＲB root tips were approximately 7-fold and 10-fold greater than those
in SB root tips，respectively． Co-IP analysis confirmed that 100 μmol·L －1 Al stress induced the phosphorylation of PM H + -AT-
Pase and the interaction between PM H + -ATPase and 14-3-3 proteins in ＲB root tips，but the opposite results appeared in the
SB root tips． In conclusion，Al stress might affect the phosphorylation level of PM H + -ATPase by altering the H2O2 accumula-
tion in the ＲB and SB root tips，further affect the interaction between PM H + -ATPase phosphorylation and 14-3-3 proteins，and
change the PM H + -ATP and H + pump activities． Consequently，the NO －3 uptake by ＲB and SB become different．
Key words:Black soybean;Al toxicity;Plasma membrane H + -ATPase;14-3-3 protein;NO －3 uptake
土壤酸度是全世界影响农业生产的主要环境
问题之一，全球土地面积约 30%为酸性土壤［1-3］，我
国土壤的酸化问题也较为严重［4］。铝毒是公认的
酸性土壤上作物生长的主要限制因子之一［5-6］。铝
对植物的毒害最明显的特征是抑制根尖细胞生长
和细胞分裂，主根伸长受到抑制，根尖、侧根粗短而
脆，根毛减少，影响根对水分和养分的吸收，限制植
物的生长［2，5］。铝对植物生长发育的影响不仅使根
系的生长受阻，铝对植物地上部分如光合作用［7-8］、
光保护系统、水分利用率、碳水化合物含量、矿质营
养和氮代谢都有影响，造成叶片数少并且变小，叶
片卷曲变黄，植物的生物量减少。
有机酸的分泌是植物抗铝的一种重要的生理
机制［9-10］。植物的有机酸分泌由有机酸通道蛋白
6 期 陈东杰等:铝胁迫下不同耐铝性黑大豆硝态氮吸收机理研究 871
(如 ALMT1 和 MATE)和与之相关的转录调控因子
(如 STOP1)调节［10］。植物质膜 H + -ATPase 是细胞
膜上含量最丰富的蛋白，占质膜总蛋白的 80%［11］。
14-3-3 蛋白是在真核细胞中发现的一组高保守的调
控蛋白，通过与质膜 H + -ATPase的 C 末端结合而增
加其活性［12］。在植物细胞和组织中，质膜 H + -AT-
Pase产生的电化学梯度为多种营养物质如钾、氮、
硫酸盐和氨基酸的吸收提供驱动的能量，因此质膜
H + -ATP酶在离子活动和营养运输中发挥重要的作
用［11］。硝态氮是植物根系吸收氮素的最主要形态
之一。植物吸收 NO －3 是由硝态氮转运蛋白负责的
主动运输过程，需要质膜 H + -ATPase 提供质子和能
量［13-14］。有研究表明，在水培条件下，在玉米根部
施用硝酸盐可诱导高亲和性硝酸盐转运蛋白和质
膜 H + -ATPase的表达，根部质膜 H + -ATPase活性的
变化模式和硝酸盐净吸收的模式相似［15］。此外，在
氮营养缺乏时补充 NO －3 可诱导水稻根中质膜 H
+ -
ATPase不同亚型的差异表达，从而增强质膜 H + -
ATPase的活性加强根对 NO －3 的吸收
［16］。本实验室
相关研究表明，铝胁迫下日本产丹波黑大豆(ＲB)和
云南产本地黑大豆(SB)根生长情况差异很大，ＲB
根尖质膜 H + -ATPase的活性和 H +泵活性表现上升
趋势，而 SB根尖质膜 H + -ATPase的活性和 H +泵活
性均表现下降趋势，这可能是 ＲB 耐铝能力强于 SB
的一个重要原因［17］。
对铝胁迫影响植物根的生长已有大量的报道，
但是关于铝胁迫影响植物根吸收养分机制的研究
不多。本研究以 ＲB和 SB为试验材料，研究铝胁迫
下 ＲB和 SB根对 NO －3 吸收量与根 H2O2含量、质膜
H + -ATP酶磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白的结合、
质膜 H + -ATP酶活性的相关性，旨在阐述铝胁迫影
响植物根吸收 NO －3 的机制。
1 材料与方法
1． 1 黑大豆的培养
把抗铝型和敏感型黑大豆种子置于黑暗 25℃
中发芽。把长有 1 ～ 2 cm根长的豆苗种植于塑料网
孔上，在昼夜温度为 30℃ /25℃，每天光照时间为
12 h，光照强度为 1 200 mmol·m －2·s － 1的温室中水
培。黑大豆苗培养 14 d后，选取长势良好一致的植
株作为试验材料。
1． 2 试验设计
选取长势良好一致的植株，分别在含有 50，
100，200，400 μmol·L －1 AlCl3的改良 Hoagland 营养
液中进行铝胁迫处理，以不含 AlCl3的 Hoagland 营
养液处理植株为对照(CK)，温室中处理 1，2，3，4 d。
检测两种大豆不同处理阶段的硝态氮吸收量、质膜
H + -ATPase及 H +泵活性、质膜 H + -ATPase与14-3-3
蛋白相互作用水平。同样的方法，采用 2，12，24 h
时间梯度进行 H2 O2处理，测定不同时间点大豆的
H2O2含量。
改良Hoagland营养液配方:1 mmol·L －1 KH2PO4;
5 mmol·L －1 K2NO3;5 mmol·L
－1 Ca(NO3)2;2 mmol·L
－1
K2SO4;FeSO4·7H2O 13． 90 mg·L
－1;H3BO3 6． 2 mg·L
－1;
KI 0． 83 mg·L －1; MnSO4 22． 3 mg·L
－1; ZnSO4
8． 6 mg·L －1;Na2 MoO4·2H2 O 0． 25 mg·L
－1;CuSO4
0． 025 mg·L －1;CoCl2 0． 025 mg·L
－1。
1． 3 测定项目与方法
1． 3． 1 硝态氮吸收量 取处理液 5 mL，加入 1 ～ 2
滴氢氧化铝悬浮液，静置絮凝，离心后取上清液，使
用紫外分光光度计分别测定 220 和 275 nm 波长处
吸收值(以新鲜去离子水为参比)，从标准曲线中查
得硝态氮浓度。以处理溶液起始的硝态氮含量，减
去处理液中剩余硝态氮含量，即为黑大豆吸收处理
液硝态氮的量。
1． 3． 2 H2O2含量 取根尖材料液氮研磨成粉末，
溶于 2 mL的 1 mol·L －1 Tris-HCl(pH7． 5)中。离心
取上清液，用 Gay和 Gebick 的方法［18］测定 H2O2的
含量。
1． 3． 3 质膜 H + -ATPase 及 H +泵活性 参照 Shen
等［19］的方法提取大豆根的质膜蛋白，然后参照 Guo
等［17］的方法检测质膜蛋白的纯度并测定质膜 H + -
ATPase的活性。质膜 H +泵活性的测定参照 Yang
等的方法［20］。
1． 3． 4 质膜 H + -ATPase 与 14-3-3 蛋白相互作用水
平 参照 Guo 等［17］的方法，用免疫共沉淀(Co-IP)
技术分析质膜 H + -ATPase 与 14-3-3 蛋白在根中的
相互作用。在 Co-IP 分析中，加入有磷酸化修饰的
蚕豆质膜 H + -ATPase(VHA2p)C末端多肽(N＇-ESV-
VKLKGLDIDTIQQHYT(p)V-C)制备的多克隆抗体
(兔抗)沉淀与质膜 H + -ATPase 结合的蛋白，用 4%
浓缩胶和 10%分离胶 SDS-PAGE 电泳分离沉淀下
来的蛋白。经过电转 PVDF 膜后，使用大豆 14-3-3
蛋白(兔抗)或 VHA2p 抗体作为一抗进行 Western
blot分析，加入二抗后用 ECL试剂盒显影观察结果。
用图像分析软件 Image J对Western blot的信号进行
相对定量分析。
1． 4 数据分析
所有的生理生化指标分析均进行 3 次生物学重
复。使用 Excel 2003 计算平均值及误差分析，用
DPS 9． 5． 0． 8数据处理系统对所得数据进行显著性
差异分析(P ＜ 0． 05)。
872 大 豆 科 学 6 期
2 结果与分析
2． 1 铝胁迫下 ＲB和 SB硝态氮的吸收
土壤中硝态氮是植物的直接氮素来源，直接影
响植物的生长，因此以硝态氮吸收量作为大豆营养
状况的主要指标。如图 1 所示，第 1 天，SB 的硝态
氮吸收量显著大于 ＲB(约为 ＲB的 4 倍)，且各浓度
之间 ＲB 和 SB 对硝态氮吸收量无明显差异(图
1A)。第 2 天，ＲB的硝态氮吸收量相比第 1 天提高
约 60%，而 SB则下降约 1 倍，二者吸收量接近相同
的水平。与 CK 相比，铝胁迫下对硝态氮吸收量减
少更多，但不同铝浓度之间硝态氮吸收量无明显差
异(图 1B)。与第 2 天相比，第 3 天 ＲB 的硝态氮吸
收量提高约 15%，而 SB 下降约 20%，ＲB 的硝态氮
吸收量超过 SB 约30%～45%。400 μmol·L －1铝胁
迫下影响最明显，ＲB 的硝态氮吸收量几乎是 SB 的
2 倍。与 CK相比，4 种浓度的铝胁迫处理显著降低
硝态氮吸收量，随着铝浓度的升高，对硝态氮吸收
量呈逐渐下降的趋势，且 SB 下降更为严重。ＲB 此
时表现出比 SB 更强的硝态氮吸收能力(图 1C)。
第 4 天与第 3 天相比，ＲB 的硝态氮吸收量升高约
20%～40%，SB下降约 10%～30%。在每个处理中，
ＲB的硝态氮吸收量都比 SB高 1 倍以上。与 CK相
比，4 种浓度的铝胁迫处理极大地降低了两种大豆
的硝态氮吸收量，随着铝浓度的升高，ＲB 和 SB 对
硝态氮吸收量呈显著下降的趋势，且 SB 下降更为
明显。经过 4 d处理，此时 ＲB的硝态氮吸收能力已
经远远超过了 SB(图 1D)。
A:铝胁迫第 1 天;B:铝胁迫第 2 天;C:铝胁迫第 3 天;D:铝胁迫第 4 天。
A:Al stress for 1 day;B:Al stress for 2 days;C:Al stress for 3 days;D:Al stress for 4 days．
图 1 铝胁迫对大豆根吸收硝态氮量的影响
Fig． 1 The effects of Al stress on the NO －3 uptake by black soybean
2． 2 铝胁迫下 ＲB和 SB根中 H2O2含量的变化
H2O2含量能够反映植物经胁迫后细胞内活性
氧的积累量，其含量的变化通常被用来衡量植物受
到的胁迫程度。如图 2 所示，在处理前(CK)ＲB 中
的 H2O2含量比 SB 高 40%。处理 2 h 时，两种大豆
的 H2O2含量上升约 20% ～ 30%，SB 的上升幅度比
ＲB大，但此时 ＲB 的 H2 O2含量仍比 SB 高。处理
12 h时，ＲB 的 H2 O2含量下降 35%，而 SB 上升
15%，此时 ＲB 的 H2 O2含量已低于 SB 30%左右。
处理时间达到 24 h 时，ＲB 的 H2O2含量继续降低，
只有之前的一半，SB反之比之前高出 30%，此时 SB
中H2O2含量已经比 ＲB 高约 4 倍(图 2)。说明，在
正常情况下 ＲB根中的 H2O2含量比 SB高，在铝胁迫
图 2 铝胁迫对黑大豆根 H2O2含量的影响
Fig． 2 Effects of 100 μmol·L － 1 Al stress on
H2O2 content of black soybean root
下 ＲB能降低其根内 H2O2含量，氧化胁迫程度逐渐
降低，而 SB的 H2O2含量随着处理时间的增长而逐
渐升高，氧化胁迫程度逐渐升高。
6 期 陈东杰等:铝胁迫下不同耐铝性黑大豆硝态氮吸收机理研究 873
2． 3 Al胁迫下 ＲB和 SB根中质膜 H + -ATPase 活
性及 H +泵活性的变化
质膜 H + -ATPase是细胞膜上最丰富的蛋白，近
来发现其在应答多种胁迫中发挥着重要作用，由图
3 可知，处理前 ＲB的质膜 H + -ATPase 活性比 SB 高
出 20%，处理 24 h后 ＲB的质膜 H + -ATPase活性大
幅上升，而 SB 的下降，此时 ＲB 的质膜 H + -ATPase
活性比 SB高约 7 倍(图 3A)。H +泵活性的变化和
质膜 H + -ATPase 的活性表现一致，处理前 ＲB 的
H +泵活性比 SB 高 20%，处理 24 h 后 ＲB 的 H +泵
活性提高约 3 倍，而 SB 则下降约 1 倍(图 3B)。证
明，正常情况下 ＲB 的质膜 H + -ATPase 活性及 H +
泵活性均比 SB 高，而铝胁迫下时，ＲB 能够应答铝
胁迫，显著增强根中的质膜 H + -ATPase 活性及 H +
泵活性，而 SB则不具备这种能力。
图 3 铝胁迫对黑大豆根质膜 ATPase活性和氢泵活性的影响
Fig． 3 Effect of Al stress on the PM H + -ATPase activity and H + pump activity of black soybean root
2． 4 铝胁迫下 ＲB 和 SB 根中质膜 H + -ATPase 蛋
白磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白的互作水平
质膜 H + -ATPase 是 14-3-3 蛋白在质膜上结合
的主要靶蛋白，质膜 H + -ATPase 倒数第二位 Thr 经
磷酸化作用后可加强它与 14-3-3 蛋白的结合。有
研究表明，这种磷酸化是调控质膜 H + -ATPase 活性
的主要方式［21］。由图 4 可知，处理前 ＲB 根中质膜
H + -ATPase的磷酸化水平约高于 SB，与磷酸化质膜
H + -ATPase结合的 14-3-3 蛋白量也高于 SB。铝胁
迫处理 24 h 后 ＲB 根中质膜 H + -ATPase 磷酸化水
平明显上升，而 SB 的则显著下降，两者的差距进一
步加大，与磷酸化质膜 H + -ATPase 结合的 14-3-3 蛋
白量的变化与质膜 H + -ATPase 磷酸化水平变化一
致。说明 100 μmol·L －1铝胁迫能够诱导 ＲB 根中质
膜 H + -ATPase的磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白的
相互作用，同时抑制 SB 根中质膜 H + -ATPase 的磷
酸化水平及其与 14-3-3 蛋白相互作用。
图 4 100 !mol·L － 1铝胁迫下根质膜 ATPase与 14-3-3 蛋白互作的免疫共沉淀分析
Fig． 4 CO-IP analysis of the interaction between PM H + -ATPase and 14-3-3 protein under 100 !mol·L －1 Al stress
3 讨 论
已有很多研究表明，铝胁迫能减少植物对硝态
氮的吸收，如 370 μmol·L －1铝胁迫减少耐铝黑小麦
对硝态氮的净吸收量，但不影响铵态氮的吸收［22］;
在高粱中的研究也发现铝胁迫刺激铵态氮的吸收
874 大 豆 科 学 6 期
但抑制硝态氮的吸收;Ｒufty 等［23］的研究表明 10 ～
50 μmol·L －1铝胁迫会减少玉米对硝态氮的吸收;
Calba等［24］的研究表明 0 ～ 30 μmol·L －1铝胁迫 2 ～
5 d 能减少玉米对硝态氮的吸收但不影响铵态氮的
吸收，且对铝敏感型玉米硝态氮吸收的抑制作用大
于铝耐受型玉米;Nichol 等［25］对大麦的研究表明短
时间的铝胁迫能增加硝态氮的吸收;对普通大豆的
研究结果也说明 0 ～ 10 μmol·L －1的铝胁迫刺激铝
敏感型大豆对硝态氮的吸收，20 ～ 40 μmol·L －1铝胁
迫使铝敏感型大豆对硝态氮的吸收减少 12%;30
μmol·L －1的铝胁迫 2 h抑制硝态氮的吸收在铝耐受
型和铝敏感型品种间无差异［26］。与这些研究结果
相似，本研究中铝胁迫减少铝耐受型 ＲB 和铝敏感
型 SB黑大豆对 Hoagland营养液(无铵态氮)中硝态
氮的吸收，且随着处理浓度、处理时间的增加，对 SB
的影响更大。ＲB 对铝胁迫有一定的抗性，而 SB 则
不具备这种能力。
据诸多文献报道，质膜 H + -ATP 酶活性及氢泵
活性是硝态氮吸收能力的直接影响因子。植物对
NO －3 的吸收是个主动运输过程，在质膜 H
+ -ATPase
的作用下，ATP 供能将 H +泵出胞外形成电势梯度，
伴随 H +的同向运输 NO －3 通过通道蛋白逆浓度梯度
进入胞内［27-31］。14-3-3 蛋白是维持质膜 H + -ATP酶
的生物学活性必须的调控蛋白，磷酸化质膜 H + -
ATPase可与之结合激活自身的氢泵活性［32-33］。也
就是说，铝胁迫可通过调控质膜 H + -ATPase 磷酸化
的方式来影响大豆的硝态氮吸收，质膜 H + -ATPase
的磷酸化在其中起着关键作用。本研究结果表明，
ＲB和 SB应对铝毒有着不同的应答机制，ＲB 的质
膜 H + -ATPase磷酸化程度及其与 14-3-3 蛋白的结
合均在铝胁迫下上升，伴随氢泵活性的增加，提高
了 ＲB的硝态氮吸收量，SB反之(图 4)。
本研究还考察了 H2O2对大豆的影响。H2O2是
细胞有氧代谢的产物，是活性氧的一种。植物细胞
通过多种代谢途径产生 H2O2，如果这些扮演活性氧
角色的 H2 O2不能够被及时清除，在细胞中累积过
多，就会破坏生物大分子。本研究结果说明，在没
有铝胁迫时 ＲB根中 H2O2显著高于 SB，而在铝胁迫
下 ＲB能够做出响应，降低自身的 H2O2水平以此来
保护自身免受铝毒影响，而 SB 不具备这种能力(图
2)。这可能是由于 ＲB 和 SB 的抗氧酶系统对铝胁
迫的应答机制不同所造成的［34］。
有研究表明，添加 H2O2可减少质膜 H
+ -ATP酶
的磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白的结合，从而降低
植物的生物学活性［35-36］。而在本研究中，ＲB 根中
H2O2含量降低的同时，质膜 H
+ -ATP 酶的磷酸化水
平及其与 14-3-3 蛋白的相互作用是上升的，SB反之
(图 2 和 4)。据此推测，铝胁迫可能通过在根中积
累 H2O2的方式来影响质膜 H
+ -ATPase 的磷酸化及
其与 14-3-3 蛋白的相互作用。
综上所述，可以推测耐铝型 ＲB 的抗氧酶系统
以降低自身的 H2O2含量的方式响应铝胁迫，以起到
自我保护的作用，H2O2含量的降低促进了质膜 H
+ -
ATP酶的磷酸化水平及其与 14-3-3 蛋白的相互作
用，继而增强质膜 H + -ATPase 活性、氢泵活性，以此
来提高硝态氮吸收能力(SB 反之)，最终表现为 ＲB
和 SB在铝胁迫下不同的硝态氮吸收能力。这个推
测还需要进一步的试验来进行验证。
有趣的是，虽然在处理 24 h时，SB的 H2O2含量
就已远高于 ＲB，而这时 SB 的硝态氮吸收量也大大
高于 ＲB。我们认为，此时的 SB的 H2O2含量虽高于
ＲB，但其积累还未能到达影响质膜 H + -ATP 酶磷酸
化水平及其与 14-3-3 蛋白的结合的程度，亦或大豆
需要一定的时间来响应 H2O2积累，继而才能产生的
影响。
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