全 文 ：第 4 期
收稿日期：2008－12－07
基金项目：国家科技支撑计划项目（2006BAD01A19－7）；教育部基金项目（106140）；重庆市自然科学基金项目（CSTX2006BA1008）；
重庆市牧草与草食家畜重点实验室开放基金项目（2007031315）
作者简介：刘卢生（1979－），男，四川仁寿人，讲师，主要从事固氮微生物、饲料加工与贮藏的相关研究，（电话）13512331743
（电子信箱）liulusheng1＠163．com。
第 48 卷第 4期
2009 年 4月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 48 No.4
Apr．，2009
苜蓿在我国的传统种植区域为北方， 近年来，
南方苜蓿种植正逐步兴起［1，2］。但南方地区气候湿热，
酸性土壤 pH值低，含较多的活性铝，因此要使苜蓿
真正在广大南方地区“安营扎寨”，必须解决两个关
键问题： 一是苜蓿对南方地区气候土壤的适应性；
二是筛选适宜南方地区土壤条件的苜蓿根瘤菌。 在
酸性条件接种耐酸苜蓿根瘤菌可以增加苜蓿对酸
性环境的耐受能力，提高产量和品质，延长苜蓿的
利用年限，国外已有接种耐酸性苜蓿根瘤菌在酸性
土壤上成功建植苜蓿草地的报道，但多数紫花苜蓿
根瘤菌对酸性条件敏感， 在低 pH 值条件下不能存
活或仅能微弱生长，因此要在我国广大南方酸性土
地区引种苜蓿，筛选或培育耐酸性的苜蓿根瘤菌是
关键［3－8］。虽然已有成功筛选获得耐酸性苜蓿根瘤菌
的报道［3］，但这些研究中所选用的根瘤菌来源单一，
宿主植株也局限在紫花苜蓿上，故其实际应用受到
限制，为获得在南方具有实际应用意义的耐酸性根
瘤菌，本研究扩大了筛选范围，其根瘤菌来源较广，
且将宿主植株扩大到了南方常见的南苜蓿和天蓝
苜蓿。 此外， 因南方酸性土壤中存在大量的游离
Al3＋，本研究还考查了酸性条件下游离 Al3＋对根瘤菌
生长的影响。
1 材料与方法
1．1 材料
供试根瘤菌菌株共 22 株（表 1），其中 16 株为
紫花苜蓿根瘤菌，编号 S0701～S0703 菌株从中国农
业大学微生物实验室获得，编号 S0704～S0706 菌株
从陕西杨陵的栽培紫花苜蓿分离获得，编号 S0707～
S0710 菌株分离自重庆西南大学农场紫花苜蓿，编
耐酸耐铝毒苜蓿根瘤菌的筛选
刘卢生，江 杨，肖书磊
（西南大学动物科技学院/重庆市牧草与草食家畜重点实验室，重庆 400716）
摘要：从紫花苜蓿、天蓝苜蓿和南苜蓿植株上分离获得的 22 株根瘤菌菌株中筛选出 5 株耐酸较好的苜
蓿根瘤菌菌株，分别为 S0710、S0713、L0701、L0702 和 P0701，这 5 株菌株在 pH 值 5 的酸性条件下仍能
正常生长，菌株 S0713 和 P0701 甚至能在 pH 值 4 的酸性条件下生长。 酸性条件下菌株 L0701 和 P0701
对 Al3＋有较好的耐受性，而菌株 S0710 则对 Al3＋极为敏感。
关键词：苜蓿根瘤菌；耐酸耐铝毒；筛选
中图分类号：S154．38＋1 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）04－0827-03
Selection of Sinorhizobium meliloti with Acid and Aluminum Tolerance
LIU Lu－sheng，JIANG Yang，XIAO Shu－lei
（College of Amimal Sciences，Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Forage ＆ Herbivore， Chongqing 400716，China）
Abstract： 5 rhizobium strains （S0710，S0713，L0701，L0702 and P0701） were selected from 22 strains which were separated
from Medicago sativa L．， Medicago lupulina L． and Medicago polymorpha L． The 5 strains all grew normally at pH5， S0713
and P0701 even grew in the acid medium with pH4． In acid medium， the Al3＋ tolerances of L0701 and P0701 were better，
but S0710 was sensitive to Al3＋．
Key words：Sinorhizobium meliloti； acid and aluminum-tolerance； selection
DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2009.04.031
湖 北 农 业 科 学 2009 年
号 S0711～S0716 菌株分别从进口苜蓿种子（来源地
为美国）中分离获得，编号 L0701～L0703 菌株分离
自重庆本地的天蓝苜蓿，编号 P0701～P0703 菌株分
离自安徽凤阳地区的南苜蓿。 所有菌株在结瘤试验
中都能在紫花苜蓿上结瘤。根瘤菌的分离采用 YMA
固体培养基。
1．2 方法
1．2．1 根瘤菌的分离、纯化与回接 采用划线平板
法进行根瘤菌的分离， 待菌落长满后选取乳白色、
边缘光滑的单个菌落进一步纯化。 纯化后的根瘤菌
保存于 YMA 斜面培养基上。 纯化后的根瘤菌经扩
繁后接种于无菌苜蓿植株，光照培养 30 d 后与对照
植株比较，以其是否结瘤来确定是否为根瘤菌。
1．2．2 根瘤菌的耐酸性试验 将保存于冰箱的根
瘤菌取出，挑取一环在 pH 值 7 的 YMA 液体培养基
中培养活化，4 d 后调节各根瘤菌培养液 OD 值为
0．8，随后取 0．5 mL 接种于含 YMA 培养基（pH 值分
别为 4、5、6、7） 的 50 mL 三角瓶中， 每个三角瓶含
YMA 培养液 30 mL，每个处理两次重复。 在 28℃恒
温条件下振荡培养，培养期间每 12 h 测一次培养液
OD 值，连续培养 72 h，最后一次测定吸光度时测定
培养液 pH值。
1．2．3 酸性条件下，铝离子和低磷对根瘤菌耐酸性
及生长的影响 选择 1．2．2 中筛选出的具有较好耐
酸性的根瘤菌菌株， 在 pH 值 5 的条件下研究低磷
（15 μmol·L－1） 和 Al3＋（浓度分别为 0、25、50、75、100
μmol·L－1）对其生长的影响。根瘤菌的活化、接种、培
养与 OD值的测定同上。
2 结果与分析
2．1 不同酸性条件对苜蓿根瘤菌生长的影响
在 pH 值 7 的培养条件下， 各根瘤菌都能正常
生长，经 60h生长基本达到顶峰，72 h 的 OD 值皆在
0．6 以上，最高为 P0703，达到 1．396，最低为 S0710，
为 0．613，平均 OD值为 0．982。根瘤菌 S0708对酸性
条件极度敏感，在 pH值 6的条件下便不能生长。除
S0708外，其余根瘤菌皆能正常生长，但部分根瘤菌
（S0701、S0702、S0704、S0706、S0709、S0711、S0712、
P0702、P0703）前期生长速率低，对数期和稳定期延
迟。与 pH值 7的培养液相比，所有根瘤菌达到稳定
期时的 OD 值均偏低，最高为 0．859（P07002），最低
为 0（S0708），平均 OD 值为 0．532。 在所有根瘤菌
中 ，S0701、S0704、S0706、S0707、S0709、S0710、L0702
和 P0703 对酸性环境较为敏感， 达到稳定期的 OD
值皆在 0．4 以下。 在 pH 值 6 的条件下， 根瘤菌
S0702、S0703、S0705、S0711、S0712、S0713、S0714、
S0715、S0716、L0701、L0703、P0701 和 P0702 都 受
到不同程度的影响， 其稳定期 OD 值都有不同程度
的下降，但皆在 0．5以上。
在 pH 值 5 的酸性条件下，22 株根瘤菌中，仅
S0703 等 10 株根瘤菌能生长，S0703、S0706、S0712、
L0703 和 P0702 仅见微弱生长， 其 OD 值皆在 0．1
以下； 根瘤菌 S0710、S0713、L0701、L0702 和 P0701
具有较强的耐酸性， 在 pH 值 5 的条件下仍能较快
生长，稳定期的 OD 值都在 0．3 以上，其中 P0701 达
到 0．498，S0713达到 0．707（图 1）。
pH 值 4 的条件下的培养结果发现，P0701 和
S0713 具有很强的耐酸能力， 他们在 pH 值 4 的培
养条件下仍能较好生长，而其他根瘤菌要么不能生
表 1 根瘤菌菌株及其来源
编号
S0701
S0702
S0703
S0704
S0705
S0706
S0707
S0708
S0709
S0710
S0711
S0712
S0713
S0714
S0715
S0716
L0701
L0702
L0703
P0701
P0702
P0703
来源
中国农业大学
中国农业大学
中国农业大学
陕西
陕西
陕西
重庆
重庆
重庆
重庆
包衣种子 1（美国）
包衣种子 2（美国）
包衣种子 3（美国）
包衣种子 4（美国）
包衣种子 5（美国）
包衣种子 6（美国）
重庆
重庆
重庆
安徽凤阳
安徽凤阳
安徽凤阳
宿主植物
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
紫花苜蓿
天蓝苜蓿
天蓝苜蓿
天蓝苜蓿
南苜蓿
南苜蓿
南苜蓿
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第 4 期
长，要么仅见微弱生长（图 2）。
对 5 株根瘤菌菌株培养前后培养液 pH 值测定
发现（表 2），根瘤菌培养 72 h 后，培养液 pH 值皆有
不同程度的降低， 菌株 S0713 的 pH 值降低幅度较
小，其他 4 株较大（△pH 值＞0．7），即根瘤菌在生长
过程中分泌产生了酸性物质，这与代敏等人报道一
致，根瘤菌生长过程中分泌的酸性物质对其耐酸性
是否具有促进作用尚需进一步研究。
2．2 酸性条件下铝离子对苜蓿根瘤菌生长的影响
在 pH 值 5 的酸性条件下，5 株耐酸性菌株对
铝毒的耐受性呈现出较大的差异。 菌株 L0702 和
P0701 对铝毒的适应性和耐受性最强，经 72 h 培养
后，高浓度 Al3＋培养液（50～100 μmol·L－1）的 OD 值
与低浓度 Al3＋（0～25 μmol·L－1）没有大的差异，但高
浓度 Al3＋明显使菌株 L0702 和 P0701 的前期生长速
率变慢，对数生长期推迟。 根瘤菌菌株 S0710 虽然
耐酸性较强，但对 Al3＋非常敏感，即使在低浓度 Al3＋
培养液中，其生长也极其微弱，72 h 培养液 OD 值不
到0．05。Al3＋对根瘤菌菌株 L0701和 S0713的影响随
铝离子浓度的增大而增大， 培养液中 Al3＋越大，OD
值（72 h）越低，对数生长期越晚（图 3～7）。
3 小结与讨论
试验所选根瘤菌菌株来源较广泛，从其宿主来
看， 从天蓝苜蓿和南苜蓿分离得到的 6 株菌株中，
有 3 株在 pH 值 5 的条件下能正常生长， 而从紫花
苜蓿中分离出的 16 株菌株中仅有两株能在 pH 值
5的条件下正常生长。 本研究主要针对紫花苜蓿苜
蓿根瘤菌进行筛选，对天蓝苜蓿和南苜蓿根瘤菌所
表 2 根瘤菌培养前后的培养液 pH 值
根瘤菌菌株
L0701
L0702
P0701
S0710
S0713
培养前 pH 值
5
5
5
5
5
培养后 pH 值
3.85
3.83
3.98
4.26
4.76
刘卢生等：耐酸耐铝毒苜蓿根瘤菌的筛选 829
湖 北 农 业 科 学 2009 年
选样本不多，其代表性受到一定的限制。
对南方苜蓿和南方苜蓿根瘤菌而言，其生长还
受酸性土壤中的游离 Al3＋的毒害， 试验结果表明耐
酸根瘤菌不一定耐铝，所以要真正筛选出适应南方
土壤的苜蓿根瘤菌还必须考察其对 Al3＋的耐受性。
试验筛选出的 5 株较耐酸的根瘤菌中，分离自天蓝
苜蓿和南苜蓿的根瘤菌（L0701、L0702 和 P0701）也
表现出较好的耐铝性，而分离自紫花苜蓿的根瘤菌
的耐铝毒性能较差。
以上试验结果表明根瘤菌所处的生态环境对
其耐酸耐铝性能有重要影响，这一方面提示我们要
筛选适应南方土壤气候的根瘤菌菌株，最好将选择
地域固定在南方地区；另一方面，因根瘤菌也属细
菌，容易因外界环境而发生变异，我们也可利用逆
境（如酸性铝毒条件）来处理根瘤菌，以获得我们所
需的，对实际生产有利的变异。
参考文献：
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（责任编辑 郑 威）
收稿日期：2008－12－26
基金项目：连云港市科技计划项目（SH0515）
作者简介：刘旭光（1973－），男，江苏连云港人，副教授，研究方向为生物信息学与微生物功能基因研究，（电话）13174180370
（电子信箱）lxgssq＠163．com。
第 48 卷第 4 期
2009年 4 月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 48 No.4
Apr．，2009
一株苯酚高效降解菌 2N－17的分离鉴定及其降解特性
刘旭光 1，2，邵世光 1，3
（1．连云港师范高等专科学校/连云港市应用生物技术重点实验室，江苏 连云港 222006；
2．南京大学生命科学学院，南京 210093；3．南京师范大学生命科学学院，南京 210046）
摘要：用苯酚作为惟一碳源进行驯化从化工厂废水样品中分离得到一株具有较强苯酚降解能力的菌株。
经过生理生化以及用编码苯酚羟化酶大亚基基因与 16S rDNA 序列鉴定，初步确认其为假单胞菌。 菌株
降解苯酚的特性与条件研究表明，该菌株在 35℃、pH 值 7．5、苯酚 600 mg·L－1以及添加营养物与一定通
气量的条件下能对苯酚很好地进行降解处理。
关键词：苯酚；苯酚羟化酶基因；假单胞菌；降解特性
中图分类号：Q93－331 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2009）04－0830-04
Isolation，Characterization and Degradation Properties of Pseudmonas Strain 2N－17
with Degrading Phenol
LIU Xu－guang1，2，SHAO Shi－guang1，3
（1．Lianyungang Normal Institute/Key Laboratory of Applied Biotechnology of Lianyungang，Lianyungang 222006，Jiangsu，China；2．College of
Life Science，Nanjing University，Nanjing 210093，China；3．College of Life Sciences，Nanjing Normal University， Nanjing 210046，China）
Abstract： A strain of phenol degrading bacteria was identified preliminarily as Pseudmonas sp． from the wastewater of a pes-
ticide factory according to the physiological and biochemical characteristics， and the PCR analysis of phenol hydroxylase
（LmPHs） and 16S rDNA sequence． The results showed that this strain could degrade 600 mg·L－1 phenol effectively at 35℃
and pH 7．5． The degradation rate of phenol could be stimulated with a micro amount of glucose and aeration．
Key words： phenol； phenol hydroxylase gene（LmPHs）；Pseudomonas sp．； properties of degradation
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!