全 文 ：70 4中国药理 学通报 Ch i、 e s。 P h ar mc o al o gi c al B u l le t in 2 0 0 3J un ; 19 (6) :0 7 4一 7
黄蜀葵总黄酮对 M CA O大鼠脑细胞凋亡的影响 `
高 杉 ` 范 丽 董六一 赵维中 陈志武
(安徽 医科大学药理 学教研室 , 合肥 2 3 0 0 3 2)
中国图书 分类 号 R 一 3 3 2 ; R 2 8 4 . 1 ; R 3 2 2 . 8 1 ; R 3 2 9 . 2 5 ;
R 7 4 3
.
3 1 0
.
2 ; R 7 4 3
.
3 1 0
.
5
文献标识码 A 文章编号 1 0 0 1 一 1 9 7 8 ( 2 0 0 3 ) 0 6 一 0 7 0 4一 0 4
摘要 目的 观察黄蜀葵总黄酮 ( T F A )对 M C A O 大鼠脑细
胞凋亡的影响 。 方法 透射电镜观察 T F A 对脑细胞超微结
构的影 响 , T U N EI J 法对 T F A 脑细胞凋 亡的影 响进 行半定
量观察 。 结果 透射电镜观察发现 T F A 50 、 10 m g · k-g `
能改善脑细胞超微结构 的 变化 , T U N E I 法 观察发现 T F A
2 5
、
50
、
10 m g
·
k g 一 `能剂量依赖性地减少凋亡细胞 的数目 。
结论 T F A 能通过抗脑细胞凋亡发挥脑缺血 损伤保护作
用 。
关键词 黄蜀葵总黄酮 ; 大脑中动脉结扎 ; 凋亡
脑缺血是严重危害人类健康的疾病 , 国内外对
脑缺血病理机制的研究和寻找开发有效治疗药物非
常重视 。 黄酮类化合物 ( fl a v o on id) 近年来研究得较
为深人 , 取得了丰硕的成果 ,其 中有些黄酮类化合物
如银杏总黄酮 、 沙棘总黄酮 、 灯盏花素 、 棚皮素 、 芸香
昔等 , 已被证实对缺血 一再灌注性脑损伤有 明确的
保护作用 ,提示黄酮类化合物是开发研制抗脑缺血
新药的一个很好的可利用资源 。
黄蜀葵 ( a b e l m o s e h u : m a n i h o t L m e d i c , A )为锦
葵秋葵属植物 , 其主要药用部分为黄蜀 葵花 , 性甘
寒 , 具 有 清 热 解 毒 , 润 燥 滑 肠 之 功 效 。 文 献 报
道 【` · 2〕 , 黄蜀葵花制剂对急慢性 肾炎 、 肾病综合征均
有明显疗效 , 可减轻肾小管病变 、 肾纤维化 , 降低蛋
白尿 。 此外 , 黄蜀葵花对人 和实验动物 口腔溃疡亦
有明显疗效川 。 我室曾就黄蜀葵花提取物黄蜀葵总
黄酮 ( t o t a l f l a v o n e s o f A , T F A )对心脑缺氧损伤的
保护作用作 了初步研究川 。 本文在大鼠大脑中动脉
20 0 2 一 1 1 一 0 8 收稿 , 2 0 0 3 一 0 1 一 1 8 修 回
’ 安徽省自然科学基金资助课题 , N o 9 9 0 44 43 3 ; 安徽 省教育厅 自然
科研基金资助 , N o 20 0 3 K J2 2 4
, 《中国药理学通报 》编辑部 ,合肥 2 3 。。3 2
作者简 介 : 高 杉 , 男 , 29 岁 , 硕 士 生 , 助 理 研究 员 。 T el : 0 5 5 1 -
5 1 6 1 2 2 1
,
E
一
m a i l
: g a o s s @
s o h u
.
e o m ;
陈志武 ,男 , 39 岁 ,教授 ,博 士生导师 。 研究 方向 : 心脑血
管药理学
结扎 ( m id d l e e e r e b r a l a r t e r y o e e l u s i o n , M C A O )模
型上 ,对 T F A 对脑细胞凋亡 的影响进行 了观察和
研究 , 现将结果报道如下 。
1 材料和方法
1
.
1 动物 W i s t a r 大鼠 , 早舍兼用 , 体重 2 1 0 ~ 2 50
g
,动物合格证号 : 皖医实动准第 01 号 , 由安徽 医科
大学实验动物中心提供 。
1
.
2 药品及试剂 T F A : 安徽省医学研究所提供 ,
棕黄色粉末 , 用前用生理盐水 ( N )S 溶解 至所需 浓
度 ,批号 : 2 0 0 10 52 6 ; T d T 介导 的原 位末端 标记 法
( T d T
一
m e d i a t e d d U T P
一
d ig o x ig e n i n n i e k e n d
一
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-
h n g
,
T U N E L )法检测细胞凋亡试剂盒 : 南京建成生
物工程研究所提供 ; J E M 一 1 0 S X 透射 电子显微镜
( t r a n s m i s s i o n e l e e t r o n m i e r o s e o p y
,
T E M )旧 本 电
子株式会社 。
1
.
3 大鼠 M C A O 模型 的制备 大 鼠随机分为 5
组 , 假手术组 ( S h a m ) 、 N S 对照组 、 T F A 2 5 、 5 0 、 10 0
m g
·
k g
一 ` 3 个剂量组 , 每组 8 只 , 早含各半 。 大鼠
乙醚轻度麻醉后 , 分离并结扎右侧颈总动脉 ( c o m -
m o n c a r o t id a r t e r y
,
e C A )
,缝合肌 肉皮肤后 , 右侧
位 固定 。 在右耳和右眼外毗连线中点切开皮肤 , 钝
性分离颖肌 ,暴露颧 突及颖骨 , 在颧突的头端 1一 2
m m 处 ,用牙科钻钻开一 3 m m 汉 3 m m 义 3 m m 的三
角形骨窗 ,暴露大脑中动脉 ( m id d l e 。 e r e b r a l a r t e r y ,
M C A )
, 将 M C A 灼断 , 缝合切 口 ; S h a m 组 仅暴露
C C A 和 M C A , 不结 扎 , 不 灼 断 , 各 给药 组 于大 鼠
M C A O 前 4 5 m i n 19 给药 。 M C A 灼断 2 4 h 后断头
处死大鼠 ,取右侧大脑半球 , 在固定 的部位剪取一
1 m m
3的脑组织块 ,迅速放人预冷的 4 ℃的 2 . 5%的
戊二醛中固定 24 h , 待透射电镜检 测 , 其余部分置
体积分数为 10 %福尔马林液中固定 , 用于 T U N E L
法检测细胞凋亡数 。
1
.
4 细胞凋亡的检测
1
、
4
.
1 透射 电镜法 将固定后的 1 m m 3 脑组织块
取出 ,常规电镜样 品制备程序漂洗 、 脱水 、 浸透及环
氧树脂包埋 ;超薄切片后 , 将切片捞至载网上 , 干燥
后行铅铀双染 ;透射电镜下观察网孔 中细胞形态及
其超微结构的改变 。
1
.
4
.
2 T U N E L 法 大鼠脑组织常规固定 、 包埋 、
中国药理 学通报 Ch i n s e。 Ph a r 阴 a o elo g i ca l B u l l et i n 2 0 0 3 Ju n ;1 9 ( 6 ) 70 5
F ig 1 E e f
ct o fF TA o n u l t r a s t r u et u r a l m o r Ph o l o gy o fb r a i n e el l i川u r ed b y i s ch em i a i n r a t s ( 只 5 0 0 0 )
1 : S h
a
m ;2
:
N S ;3
:
F A 5 T0 m g
·
k g 一 1 ;4 : F A T1 00 m g
.
k g -
切片 、 脱腊及水合 ;切片组织在 20 m g · L 一 `蛋 白酶 变化 ,表现为染色质浓集 、 边聚 、 胞质浓缩 , 细胞器结
K ( p H 7
.
4 ) 3 7℃ 中保温 20 m in ; P B S 冲洗 3 次 ; 滤纸 构基本完好 , 部分表现为核染色质断裂 ,甚至有膜包
吸干 样 品周 围 P B S 溶 液 , 加 人 新 配 的 T d T 和 被核碎 片的出现 。 T F A 50 、 1 0 m g · k-g ` 则能减
d U T P
一
iD g 的 T d 缓冲液 50 川 ,置 37 ` C湿盒 中保温 轻缺血后脑细胞超微结构的上述变化 。
6 0 m i n ; p B S 洗片 2 次 ,加封闭液 1 0 0 拼l ,室温下 3 0 2 . 2 T U N E L 法 T U N E L 法 中正常细胞核被染成
m in ; P B S 再次洗片 2 次 ,加人抗 iD g 抗体 一 碱性磷 蓝色 ,凋亡细胞核被染成棕黄色 。 正常细胞被染成
酸酶的复合溶液 50 川 , 37 `C 湿盒再 保温 60 m i n ; 蓝色 ,假手术组仅有零星凋亡细胞 ,对照组中凋亡细
p B S 洗片 3 次 ,加人 N B T / B C T p 显色液 1 0 0 拼 l , 室
温下 Z h ; P B S 洗片 2 次 ,苏木精衬染胞质 , 干燥 、 封
片后 ,倒置显微镜下观察 分析被染成棕黄色的凋亡
细胞 ,记数 10 个高倍镜视野 中的凋亡细胞数 。
1
.
5 统计学方法 数据均以 王士 、 表示 , 组间比较
采用 t 检验 。
2 结果
2
.
1 电镜法 结果见 iF g l 。 从图中可看 出 , S ha m
组脑细胞染色质分 布均 匀 , 核膜完整 , 核孔清晰可
见 ,细胞器结构完好 。 对 照组脑细胞呈典型的凋亡
胞数量明显增多 , 25 、 50 、 10 0 m g · k g 一 ` 可呈剂量依
aT b 1 E fe
e t s o f T F A o n th e n u m be r s o f a P o p t o s i s e e l l s
in b r a i n i川u r e d by M e A o (牙士 : , 。 = 6 )
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/ 1 1 19
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N u m b e r o f a p o p t o t i e I n h ib
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5 0士 1 . 0 5 件 备
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1 7士 6 . 4 3
58
.
17士 6 . 5 3 书 苦
2 9
.
3 3士 4 7 6 苦 任
4
.
7 6士 1 . 7 5 书 蕊
1 7
.
1 0
5 8
.
2 0
9 3
.
20
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.
0 1 v s N S g r o u P
7 06中国药理学通报 C h in es 。 P ha : m a c o log ia c l B u lle t in 2 0 0 3J un ;1 9( 6)
赖性抑制凋亡细胞的产生 (尸 < 0. 01 ,见 T ab l ) 。
3 讨论
自 M a e M a n u S 等 1 9 9 3 年首次报道大 鼠全脑缺
血与细胞凋亡的关系后 , 细胞凋亡在缺血性脑损伤
中的作用 日益受到关注 。 以往认为缺血性脑梗死急
性期梗死区脑组织死亡完全是坏死 ( en cr os i s ) ,几十
年来的研究表明缺血性脑损伤引起 的细胞死亡可能
通过凋亡 ( a p o p t os is )和坏死两条途径川 。 目前 比较
一致的观点认为在脑缺血后神经元急性期死亡 中以
坏死为主 ,凋亡为辅 ,坏死一般位于缺血核心 区 , 半
影区的脑 细胞 由于仍 保 留 了正 常供 氧 的 20 % 一
5 0 %川 , 损伤相对较轻 , 可继续维持数小 时 , 如能
及时恢复血流或采用药物治疗 ,则可能被挽救 , 否则
转变为不可逆性损伤 , 使梗死灶扩大 , 因此 , 治疗脑
梗死的重点在于挽救 缺血性半影 区 内的神经元 , 减
少死亡 (包 括坏死和凋亡 ) , 抑制凋亡过程比 8】。 半
影区细胞主要 的死亡方式是凋亡 s[, 9〕 , 这是 由于这
些细胞仍保持了部分蛋白合成能力并表达某些凋亡
相关基因 l0[ 一 2」。
神经元发生凋亡的机制很复杂 , 有多种 因素 (如
氧 自由基 、 钙超载 、 兴奋性氨基酸等 )参与了这一过
程并各 自都得到了相应的实验支持 , 近年来 的研究
表明 , b e l一2 家族 , F a s / F a S L 、 c a s p a s e 家族也参与了
神经元凋亡的发生 、 发展 。 现在一般认 为凋亡 由异
源性启动期 、效应期和降解期 3 个过程构成 。 首先
脑缺血导致细胞外液 中谷氨酸 、 天 门冬氨酸等兴奋
性氨基酸浓度 明显升高 , 从 而过度激 活 N M D A 等
受体 ,使该受体调控的钙离子通道病理性开放 ,引起
大量的钙离子内流 ; 同时 ,缺血可使三磷酸肌醇 ( in -
o s i t o l
一
1
,
4
,
5
一
t r i p h o s p h a t e
,
I P 3 ) 激活 , Ip 。 作为第二
信使可引起 内质网中的钙离子释放人胞质 , 引起 内
源性的钙离子浓度升高 。 钙离子浓度升高可激活蛋
白水解酶 、 核酸内切酶 、 谷氨酞转移酶等 , 其 中核酸
内切酶可将 D N A 裂解为寡核昔 酸片段 , 在电泳时
呈现凋亡特有的 “ D N A 梯带 ( D N A la d d e r ) ” 巨` 3〕 。 现
已明确胞质中钙离子浓度升高是细胞凋亡的启动因
素〔1召: 。
本研究所用 T U N E L 法 , 其原理是采用末端脱
氧核昔酸转移酶将地 高辛 一 dU T P 聚合到凋亡细胞
D N A 碎片 3乞O H 末端 , 再通过与碱性磷酸酶复合的
地高辛半抗体产生结合标记 ,染色后细胞核呈棕黄
色变化 ,而正常细胞核着蓝色 , 少量坏死细胞也可呈
阳性反应 ,但坏死细胞呈灶状分布 ,凋亡细胞呈散在
分布 , 故镜下易于区分 。 结果表明 25 、 50 、 1 0 m g ·
k g
一 ` T F A 能明显减 少 M C A O 致脑 细胞凋亡 的数
量 。 由于目前尚无一种判定凋亡的最特异的方法 ,
因此 ,多数学者认为在研究凋亡细胞时 ,宜采用两种
以上的方法加以判定 。 由于细胞形态改变的指标与
凋亡细胞的描述更相符 , 而 电镜又是观察细胞形态
最好的方法 。 本研究采用透射电镜法研究缺血致脑
细胞凋亡 , 实验结果表明 , 50 、 1 0 m g · k g 一 ` T F A
能明显改善 M C A O 致脑细胞超微结构发生凋亡变
化 ,提示 T F A 能通过抗神经元凋亡的途径对脑 缺
血损伤发挥保护作用 。
参考文献
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健行颗粒对纹状体损毁致帕金森病模型
大鼠单胺类递质及其代谢产物含量的影响
张如意 李 林 艾厚喜 叶翠飞 楚 晋 王 辉
(首都 医科 大学宣武 医 院药理 学研究 室 , 北 京 l 。。。 5 3 )
中国图书分类号 R 一 3 3 2 ; R 2 8 2 . 7 2 ; R 3 2 2 . 8 1 ; R 3 6 3一 3 3 2 ;
R 7 4 5
.
7 0 5
文献标识码 A 文章编 号 1 0 0 1一 1 9 7 8 ( 2 0 0 3 ) 0 6一 0 7 0 7 一0 4
摘要 目的 建立 纹状体定向损毁致帕金森病大鼠模 型并
在此模型上观察中药复方健行颗粒对模型大鼠单胺类神经
递质及其代谢产物 含量 的影 响 , 探讨其可能的作用 机制 。 方
法 应用单侧黑质纹状体通路损毁的方法建立 帕金森病大
鼠模 型 , 以阿朴吗啡诱导 的大鼠旋转行为 , 大 鼠脑纹状体内
单胺类神经递质及其代谢产物的含量 , 酪胺酸经化酶 阳性 细
胞的数目等系统评价 了健行颗粒改善模型动物运 动功能 的
药效学作用及其机制 。 结 果 对 于单侧黑质纹状体通路损
毁所致帕金森病样模型大鼠 , 健行颗粒能明显减少其旋转次
数 ,提高模型 鼠脑纹状体内多 巴胺及其代谢产物 的含 量 , 增
加酪胺酸经化酶染色阳性的细胞数 。 结论 健行颗粒能够
明显改善拟帕金森病模 型动物的运 动功能 , 提升动物脑纹状
体内单胺类神经递质 及其代谢产物 含量并对黑质处神经元
具良好的保护作用 。
关键词 大 鼠 ;帕金森病 ;多 巴胺 ;中药
2 0 0 2 一 1 1 一 1 9 收稿 , 2 0 0 3 一 0 1 一 1 3 修回
作者简介 : 张如意 , 女 , 2 9 岁 , 硕士 , 实习研究员 。 研究 方向 : 神经药
理 学 。 T e i : 0 1 0一 6 3 0 13 3 5 5一 2 8 8 1 , F a x : 0 1 0一 6 30 4 2 8 0 9 , E -
m
a l l
:
b a d e h i ld
z
@ y a h o o
.
c o m ;
李 林 , 女 , 50 岁 , 教 授 , 博 士生 导 师 。 通讯 作 者 。 0 1。 -
6 3 0 1 3 3 5 5
一
2 88 6
,
F
a x : 0 1 0
一 6 30 4 28 0 9
,
E
一
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:
li n l i 97 @ h o t
-
m a i l
.
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帕金森病 ( P a r k i n s o n , P D ) 是以 进行性运动功
能障碍为主要 临床表现 的中枢 神经系统变性性疾
病 ,震颤 、 僵直及运动减少是其最主要的临床表现 。
本病的主要病变在黑质纹状体 , 病人 因黑质严重破
坏 ,而导致此通路的神经纤维发生变性 ,使居于纹状
体上的神经末梢处多 巴胺 ( d o p a m ien , D A )不足 。 6 -
轻多巴胺 ( 6一 h y d r o x y d o p a m in e , 6一 O H D A )是一种神
经毒素 ,它可以被大 鼠中脑黑质 内富含单胺氧化酶
的多巴胺能神经元 吸收 ,并在单胺氧化酶作用下转
化成 自由基而对神经元造成 伤害 。 健行颗粒 由白
芍 、 钩藤 、 天麻 、 制首乌等 n 味纯中药组成 。 具有平
肝潜 阳 、 息风止痉 的功能 。 本文研究 了健行颗粒对
单侧黑质纹状体通路损毁致 P D 样模型大鼠的运动
功能纹状体内多巴胺含量及黑质处神经元数量的影
响 。
1 材料与方法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 药物 健行颗粒由太原市迎泽开元 医药研
究所 提 供 , 批号 : 2 0 0 1 0 6 0 17 , 每 克 干 粉 含 生 药 量
7
.
37 9
。 实验时用蒸馏水溶解 。
阳性对照药美多巴 ,为一种左旋多 巴与外周脱
E f f e c t o f T F A o n e e l l a P o P t o s i s i n M C A O
r a t s
G A O S h a n
,
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Z H A O W e i
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Z h o n g
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( D e P t o f P h a r m a e o l
o g 夕 , A n h u i M e d i c a l 阶 i o e r s i t夕 , H e fe i 2 3 0 0 3 2 )
A B S T R A C T A IM T o i n v e s t i g a t e t h e e f f e e t o f
T F A o n e e l l a p o p t o s i s i n M C A O ( m i d d l e e e r e b r a l
a r t e r y o e e l u s i o n ) r a t s
.
M E T H O D S T h e t r a n o m i s
-
5 i o n e l e e t r o n m i e r o s e o p y a n d T U N E L ( T d T
一
m e d ia
-
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d i g o x i g e n i n n i e k e n d
一
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w e r e u s e d i n r a t M C A O m o d e l
.
R E SU L T S T r a n s
-
m l s s i o n e l e e t r o n m i e r o s e o p y s h o w e d t h a t T F A 5 0
,
10 0 m g
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e e r e b r a l e e l l s a n d T U N E L m e t h o d s h o w e d t h a t
T F A 2 5
,
5 0
,
1 0 0 m g
·
k g
一 ` e a n d o s e d e p e n d e n t l y
i n h ib i t e d t h e a p o p t o s is o f b r a i n e e l l s i n M C A O
r a t s
.
C O N C L U S I O N T F A p l a y a p r o t e e t i v e r o l e
o n i n e o m p l e t e e e r e b r a l i s e h e m i a i n j u r y v i a i n h i b i
-
t io n o f e e r e b r a工e e l ls a p o p t o s i s .
K E Y WO R D S t o t a l f l a v o n e s o f a b e lm o s e h u s m a n i
-
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m e d ie ; e e r e b r a l m id d l e a r t e r y o e e l u s i o n ; a p
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O P t o s l s