全 文 ：第３５卷　第３期
２０１３年９月 　 　　　　　
延　边　大　学　农　学　学　报
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　　　　　
Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．３
　Ｓｅｐ．２０１３
收稿日期：２０１３－０４－１８基金项目：国家自然科学基金项目（３１２６０１８２）
作者简介：金美玉（１９８５—），女（朝鲜族），黑龙江鸡西人，延边大学农学院助理实验师。朴炫春为通讯作者，
　　　　 Ｔｅｌ：０４３３－２４３５５８８，Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｙｙｐｘｃ＠ｙｂｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
满天星试管苗与玻璃化苗ＲＡＰＤ标记向ＳＣＡＲ标记的转化
金美玉１，　曹天旭２，　邵春绘１，　廉美兰１，　朴炫春１＊
（１．延边大学农学院，吉林 延吉１３３００２；２．黑龙江农业经济职业学院，黑龙江 牡丹江１５７０４１）
摘要：以满天星组培所获得的正常苗和玻璃苗为试验材料，将ＲＡＰＤ标记转换为ＳＣＡＲ标记。结果表明，将
随机引物在满天星试管苗与玻璃化苗的ＤＮＡ中扩增得到的特异性片段ＯＰＧ１７－１４５５，经过回收、克隆、测序、
重新设计１对引物将ＲＡＰＤ标记转化为ＳＣＡＲ标记，该ＳＣＡＲ标记只有在玻璃苗个体中出现。
关键词：满天星；玻璃苗；ＲＡＰＤ标记；ＳＣＡＲ标记
中图分类号：Ｑ９４３．１　　　文献标识码：Ａ　　　文章编号：１００４－７９９９（２０１３）０３－０１８５－０５
满天星（Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ　ｐａｎｉｃｕｌａｔａ　Ｌ．），别名霞草，石竹科丝石竹属植物［１］。属多年生宿根草本花卉，是重
要的鲜切花之一，可作为插花中的衬托花材。近年来，对满天星试管苗的研究已有了大量的报道［２－５］。在大
规模生产中，满天星组培快繁相对于其它花卉比较容易获得成功，但普遍存在玻璃化现象，且是比较突出和
严重的问题。玻璃化苗极容易死亡，移栽不能成活，对植株离体快繁的成活率造成负面影响，故引起了人们
的广泛关注［１］。玻璃化苗形态畸型，生理功能异常，难以增殖生根，更难移栽成活，已成为目前组织培养中亟
待解决的问题之一。试管玻璃化植株的解剖学特点、生理生化变化、形成原因和控制方法上的研究多有报
道，但对玻璃化发生的规律和机制尚无定论，尤其在分子水平上的研究更少。
ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＤＮＡ）技术是由 Ｗｉｌｉａｍｓ和 Ｗｅｌｓｈ等［６－７］（１９９０）创立的一种
ＤＮＡ分子标记技术，是建立在ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）基础上的一种新型ＤＮＡ分子水平上的
遗传标记；ＳＣＡＲ（特征性片段扩增区域，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　Ｒｅｇｉｏｎ）标记是ＲＡＰＤ标记的进
一步发展。与ＲＡＰＤ标记相比，ＳＣＡＲ标记的特异性和稳定性更高。因而，在实际应用中ＳＣＡＲ标记具有
快速、简便、低成本的优越性，非常适合于材料样品的大量分析。本研究在满天星试管苗和玻璃化苗ＲＡＰＤ
分子标记基础上，建立具有满天星特异性的ＳＣＡＲ标记，以便在分子水平上快速、准确地分析满天星试管苗
与玻璃化苗，为进一步探讨满天星玻璃化发生机理奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材料
将组培获得的满天星试管苗接种于２ＭＳ＋６－苄氨基腺嘌呤（ＢＡ）０．５ｍｇ／Ｌ＋萘乙酸（ＮＡＡ）
０．１ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂７ｇ／Ｌ培养基中获得正常苗，将其接种于２ＭＳ＋ＢＡ　５ｍｇ／Ｌ ＋ ＮＡＡ
０．１ｍｇ／Ｌ＋蔗糖３０ｇ／Ｌ＋琼脂７ｇ／Ｌ的培养基中获得玻璃苗。培养温度为（２５±２）℃，湿度７５％，光照强
度为３２μｍｏｌ／（ｍ
２·ｓ），每天光照１６ｈ，培养３０ｄ后取生长一致的正常苗和玻璃苗作为试验材料。
１．２　方法
１）ＤＮＡ的提取　基因组ＤＮＡ的提取采用ＣＴＡＢ法［８］，提取的ＤＮＡ用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时
电压５０Ｖ，时间２ｈ。电泳结束后在凝胶成像仪下照相，并记录结果。应用 Ｍｉｃｈｅｍｏｒ等［９］的分离群体分组
分析法（Ｂｕｌｋｅｄ　Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，即ＢＳＡ法）。分别将７株正常苗和７株玻璃苗的ＤＮＡ样品等量混
合，组成满天星正常苗和玻璃苗的基因池。
２）ＲＡＰＤ分析　程序设置为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４ ℃变性１ｍｉｎ，３６ ℃退火１ｍｉｎ，７２ ℃延伸
DOI:10.13478/j.cnki.jasyu.2013.03.012
延　边　大　学　农　学　学　报 第３５卷　
１．５ｍｉｎ，４５个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增反应结束后，采用０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液，１．４％的琼
脂糖凝胶（含０．５μｇ／ｍＬ　ＥＢ）电泳，电泳产物在ＧＤＳ－８０００型凝胶成像仪下观察、拍照。
３）特异片段的回收、克隆和测序　将ＲＡＰＤ扩增产物在１．４％的琼脂糖凝胶上电泳，然后在紫外灯下
用手术刀切下含有特异片段的琼脂糖凝胶块，用大连宝生物工程有限公司生产的ＢｉｇｄｙｅＲＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ　３．１
Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ回收ＤＮＡ。纯化后，用ＰＭＤ－１８Ｔ载体连接。测序由大连宝生物工程有限公司完成。
４）ＳＣＡＲ分析　根据回收ＲＡＰＤ特异片段的测序结果，采用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０软件设计２２个碱基
的特异ＰＣＲ引物ＧＰ１、ＧＰ２，引物的合成由北京华美生科生物技术有限公司完成。反应体系为（２０μＬ）：
８μＬ　ｄｄＨ２Ｏ，１５０μｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ，２．０μＬ　１０×Ｂｕｆｆｅｒ，ＧＰ－１、ＧＰ－２各０．３μｍｏｌ／Ｌ，１０ｎｇＤＮＡ模板，１Ｕ
ＴａｑＤＮＡ聚合酶。反反应程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，６６℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸１．５ｍｉｎ，
３０个循环，最后７２℃延伸７ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增反应结束后，采用０．５×ＴＢＥ电泳缓冲液，１．４％琼脂糖凝胶
（含０．５μｇ／ｍＬ　ＥＢ）电泳，电泳产物在ＧＤＳ－８０００型凝胶成像仪下观察、拍照。
２　结果与分析
２．１　引物的筛选
针对本研究目的，为了选择不仅能扩增出清晰、重复性好的条带，且能扩增出玻璃苗或正常苗的特征性
条带的引物，采用分离群体分组分析法（Ｂｕｌｋｅｄ　Ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ），即ＢＳＡ法，筛选ｏｐｅｒｏｎ系类（Ｆ０１－
２０，Ｇ０１－２０，Ｈ０１－２０，Ｉ０１－２０，Ｊ０１－２０）１００条随机引物，初步获得２８条指纹条带明显的引物，但重复性好、
条带清晰稳定且有差异的引物只有７条（表１）。７个引物在２个基因池间扩增出的多态性条带在数目、位置
及强弱上存在明显差异（图１）。
表１　随机引物序号及其碱基组成
Ｔａｂｌｅ　１　Ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ａｎｄ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒｓ
碱基序列（５’→３’）
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
Ｆ０６ ＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧ
Ｆ１６ ＧＧＡＧＴＡＣＴＧＧ
Ｇ１７ ＡＣＧＡＣＣＧＡＣＡ
Ｈ１７ ＣＡＣＴＣＴＣＣＴＣ
Ｊ１０ ＡＡＧＣＣＣＧＡＧＧ
Ｊ１７ ＡＣＧＣＣＡＧＴＴＣ
Ｊ２０ ＡＡＧＣＧＧＣＣＴＣ
图１　用ＢＳＡ的方法筛选不同引物的ＲＡＰＤ产物　　
Ｆｉｇ．１　ＲＡＰＤ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｂｙ　ＢＳＡ　　
６８１
　第３期 金美玉，等：满天星试管苗与玻璃化苗ＲＡＰＤ标记向ＳＣＡＲ标记的转化
２．２　群体各单株的ＲＡＰＤ分析
利用上述７条引物分别对７株正常苗和玻璃苗个体进行ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增，结果引物Ｇ１７在正常苗和
玻璃苗中产生了差异带。由图２（１～７：正常苗；８～１４：玻璃苗，下同）可知，正常苗在２　０００、１　１００、７５０、７００、
６００、５５０、４００ｂｐ处各有１条带，而玻璃苗除了上述７条带以外，分别在１　５００ｂｐ处出现了１条特有的差异
带，将其命名为ＯＰＣＧ１７／１４５５。说明玻璃苗的部分碱基已经发生了变化，而这可能是导致玻璃苗形态畸变、
各种生理生化水平异常的真正原因。
图２　引物Ｇ１７在满天星正常苗与玻璃苗的扩增结果　　
Ｆｉｇ．２　ＲＡＰＤ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｓｈｏｏｔｓ　ａｎｄ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｈｏｏｔｓ　ｏｆ　Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ　ｅｌｅｇａｎｓ　Ｌ．ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｒｉｍｅｒ　Ｇ１７
２．３　ＲＡＰＤ标记Ｇ１７／１５００的克隆、鉴定及测分析序
将ＲＡＰＤ标记的特异片段回收、转化后，经过ＰＣＲ鉴定，证明重组克隆所含的插入片段为所要的目的
片段。在大连宝生物工程有限公司测序后得到该片段的全长序列。结果表明，该片段ＯＰＧ１７／１４５５的实际
大小为１　４５５ｂｐ。其碱基序列如下（图３）。其中方框部分与ＰＣＲ扩增时所用随机引物序列相同，在序列两
端均有与引物ＯＰＡ１７结合位点，进一步证实了克隆片断的正确性。
图３　目的片断的碱基序列
Ｆｉｇ．３　Ｂａｓｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔａｒｇｅｔ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
７８１
延　边　大　学　农　学　学　报 第３５卷　
２．４　将ＲＡＰＤ标记转为ＳＣＡＲ标记
根据测序结果，应用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ　５．０引物设计软件，设计１对２２个碱基的引物，上游引物ＧＰ－１的
寡核苷酸序列为：５’ＴＴＣＴＧＣＴＣＡＡＡＣＧＣＣＴＧＡＴＡＣＣ　３’，下游引物ＧＰ－２的寡核苷酸序列为：５’ＴＡＣ－
ＣＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＧＣＧＴＴＣ　３’。对上述７株正常苗和７株玻璃苗进行ＰＣＲ扩增，在玻璃苗中能够成功
扩增出ＯＰＧ１７／１４５５这个特异片段，而正常苗则没有任何扩增产物，与ＲＡＰＤ的扩增结果一致（图４）。
图４　正常苗和玻璃苗的ＳＣＡＲ扩增结果
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＳＣＡＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｈｏｏｔｓ　　
为了进一步验证ＳＣＡＲ标记的转化是否成功，用ＣＴＡＢ法又重新提取玻璃苗的ＤＮＡ，应用所设计的特
异引物ＧＰ－１、ＧＰ－２进行ＰＣＲ扩增，在１５株玻璃苗上均扩增出了ＯＰＧ１７／１４５５这条特异带（图５），这进
一步说明ＳＣＡＲ标记的转化成功。
图５　玻璃苗的ＳＣＡＲ扩增结果
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＳＣＡＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｈｏｏｔｓ
３　讨论与结论
关于满天星组培苗玻璃化现象的研究已有很多报导，王纪方等［１０］认为玻璃化现象是培育过程中环境胁
迫直接或间接地引起体内自由基的增加及体内防御活性氧毒害的保护性酶失常，可能与玻璃化现象的引发
密切相关。张淑改等［１１］对满天星玻璃苗的酯酶和过氧化物酶进行了研究，认为外表形态的玻璃化现象同分
子水平上酶的变化密切相关。沈宁东等［１２］对满天星组培正常苗与玻璃苗叶片解剖结构进行了比较，认为是
某些生理生化指标的变化引起了玻璃苗的形态畸变。
本文应用ＲＡＰＤ技术从分子角度对满天星组培苗的玻璃化现象进行了分析，从正常苗和玻璃苗的指纹
图谱中可以看出（图２），玻璃苗在１　５００ｂｐ处比正常苗多出了１条特异带，可以确认其遗传物质ＤＮＡ发生
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　第３期 金美玉，等：满天星试管苗与玻璃化苗ＲＡＰＤ标记向ＳＣＡＲ标记的转化
了变化。与ＲＡＰＤ标记比较。本文顺利地将满天星组培玻璃苗ＲＡＰＤ标记转化为ＳＣＡＲ标记，通过ＳＣＡＲ
验证可知何种程度的畸形苗为玻璃苗。在满天星组培快繁大规模生产时，可以为玻璃苗的鉴定提供强有力
参考依据。
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ｎａｌｙｓｉｓ：ａ　ｒａｐｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｉｎ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｕｓｉｎｇ　ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ
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［１２］　沈宁东．满天星试管正常苗与玻璃苗叶片解剖结构的比较［Ｊ］．青海师范大学学报（自然科学版），２００３（３）：４５－４７．
ＲＡＰＤ　Ｍａｒｋｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｓｈｏｏｔｓ　ａｎｄ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｓｈｏｏｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ　ｐａｎｉｃｕｌａｔａ　Ｌ．ｃｏｎｖｅｒｔ　ｔｏ　ＳＣＡＲ　Ｍａｒｋｅｒ
ＪＩＮ　Ｍｅｉ－ｙｕ１，　ＣＡＯ　Ｔｉａｎ－ｘｕ２，　ＳＨＡＯ　Ｃｈｕｎ－ｈｕｉ　１，　ＬＩＡＮ　Ｍｅｉ－ｌａｎ１，　ＰＩＡＯ　Ｘｕａｎ－ｃｈｕｎ１＊
（１．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｙａｎｂｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｊｉ　Ｊｉｌｉｎ　１３３００２，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｃｏｎｏｍｙ　Ｖｏｃａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｍｕｄａｎｊｉａｎｇ　Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ１５７０４１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｈｏｏｔｓ　ｆｒｏｍ　ｔｉｓｓｕｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ　ｐａｎｉｃｕｌａｔａ　Ｌ．ｗｅｒｅ　ｔａｋｅｎ　ａｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ．ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒ　ｗａｓ　ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｏ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉａｌ
ｓｅｇｍｅｎｔ（ＯＰＧ１７－１４５５）ｗｉｔｈ　ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｒ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ｓｈｏｏｔｓ　ａｎｄ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｈｏｏｔｓ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｗａｓ　ｒｅ－
ｃｏｖｅｒｅｄ，ｃｌｏｎｅｄ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｏｆ　Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ　ｐａｎｉｃｕｌａｔａ　Ｌ．．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ａｐａｉｒ　ｏｆ
ｓｐｅｃｉａｌ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｗａｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｃｏｎｖｅｒｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒ．Ｔｈｅ
ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒ　ｏｎｌｙ　ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｈｏｏｔｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａ　ｐａｎｉｃｕｌａｔａ　Ｌ．；ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｈｏｏｔ；ＲＡＰＤ　ｍａｒｋｅｒ；ＳＣＡＲ　ｍａｒｋｅｒ
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