全 文 ：中国药房 2011年第22卷第7期 China Pharmacy 2011 Vol. 22 No. 7
3 讨论
赤芍总苷原料中赤芍总苷含量是通过测定苯甲酸的含量
来换算成总苷含量的，其原理为赤芍总苷中均含有苯甲酸酯
结构单元，将赤芍总苷水解可得到苯甲酸，故以水解后产生的
苯甲酸的含量可换算出赤芍总苷的含量。赤芍中含有约
0.1％～0.8％的游离苯甲酸[9，10]，但经过大孔吸附树脂处理后苯
甲酸基本被除去[11]，本试验所用赤芍总苷原料系采用大孔树脂
纯化而得，故在测定赤芍总苷含量时未扣除游离苯甲酸的
量。检测波长均采用对照品溶液在 190～910 nm波长范围内
扫描所得最大吸收波长。
本试验结果表明，采用RP-HPLC法测定赤芍总苷原料中
芍药苷和赤芍总苷的含量，方法简便，易行，精密度、重复性、
稳定性好，适用于赤芍总苷原料的分析测定。
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（收稿日期：2010- 03- 29 修回日期：2010- 11- 16）
印楝叶HPLC指纹图谱及其化学成分与遗传变异的关系研究Δ
范 刚＊，杜 娟，尹鸿翔，张 艺#（成都中医药大学民族医药学院，成都市 611137）
中图分类号 R284.1；R927 文献标识码 A 文章编号 1001-0408（2011）07-0625-03
摘 要 目的：建立印楝叶的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱，并分析其化学成分与遗传变异的关系。方法：采用HPLC法进行指
纹图谱研究，运用简单序列重复间扩增多态性（ISSR）技术分析遗传多样性，利用聚类分析研究二者的关系。结果：建立了印楝叶
药材的HPLC指纹图谱，共标定了11个共有指纹峰。分别根据Nei’s遗传距离和化学成分进行聚类分析，13个种源分为两大类：
来自缅甸的11个种源聚成一类；来自澳大利亚和印度的种源聚成另外一类。结论：所建立的指纹图谱稳定、可靠、重复性好；不同
种源印楝叶药材化学成分与遗传变异之间具有一定的相关性。
关键词 印楝叶；指纹图谱；高效液相色谱法；遗传变异；相关性
Study on the HPLC Fingerprint of the Leaf of Azdirachta indica and Relationship of Its Chemical Constituen-
ts with Genetic Variation
FAN Gang，DU Juan，YIN Hong-xiang，ZHANG Yi（College of Ethnic Medicine，Chengdu University of TCM，
Chengdu 611137，China）
ABSTRACT OBJECTIVE：To establish the HPLC fingerprint of the Azadirachta indica leaf and to analyze the relationship between
its chemical constituents and genetic variation. METHODS：HPLC fingerprint was studied. ISSR technique was used to analyze the ge-
netic diversity. The relationship between chemical constituents and genetic variation was analyzed by cluster analysis. RESULTS：The
HPLC fingerprint of the leaf of A. idica was established，there were 11 common peaks. According to Nei’s genetic distances and chemi-
cal constituents，cluster analysis was conducted. 13 provenances were divided into 2 clusters：one was consisted of 11 provenances of
Burma，and the other was Australia and India provenances. CONCLUSION：Established HPLC fingerprint is stable and reliable with
good reproducibility. There are certain correlations between the genetic variation and chemical constituents.
KEY WORDS Leaf Azadirachta indica；Fingerprint；HPLC；Genetic variation；Correlation
Δ攀枝花市重点科技项目（2008CY-S-1）
＊博士研究生。研究方向：中药药效物质基础与质量标准化。
E-mail：fangang1111@yahoo.com.cn
#通讯作者：研究员，博士研究生导师，博士。研究方向：中药及民
族药的药效物质基础。电话：028-61800274。E-mail：9006zmy@sina.
com
􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘􀤘
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China Pharmacy 2011 Vol. 22 No. 7 中国药房 2011年第22卷第7期
印楝（Azadirachta indica A. Juss）为一种多用途的传统药
用植物，在印度阿育吠陀医学和尤那尼医学中有广泛的应用，
有“乡村药房”、“天然药库”之美称。现代研究表明，印楝具有
抗菌、抗生育、免疫调节、抗氧化、保肝和降血糖等多种生物活
性[1～3]，被认为是一种极具开发价值的药用植物资源。
影响药材化学成分种类和含量的内部因素主要体现在遗
传信息方面，特定的基因产生特定的酶，进而能够调控药材次
生代谢产物（化学成分）的产生，可以说特定的遗传信息是药
材品质形成的关键 [4，5]。本研究首次利用高效液相色谱
（HPLC）及简单序列重复间扩增多态性（ISSR）技术对印楝叶
化学指纹图谱和遗传多样性进行研究，并分析其遗传变异与化
学成分之间的关系，以期为印楝资源的开发利用提供科学依据。
1 仪器与试药
LC-10A型HPLC仪系统（日本岛津公司）；W201恒温水浴
锅（上海申顺生物科技有限公司）；DYY-10C型电泳仪（北京六
一仪器厂）；PTC-200 PCR扩增仪（美国BIO-RAD公司）；Gene
Genius凝胶成像仪（英国Syngene公司）。
芦丁（批号：100080-200707）、槲皮素（批号：100081-
200406）、槲皮苷（批号：111538-200504）、金丝桃苷（批号：
111521-20030）对照品均购自中国药品生物制品检定所；
MgCl2、琼脂粉、Taq酶、dNTP mixture均购自大连Takara公司；
乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。印楝叶采自四川攀枝
花市拉 村印楝种源试验林基地（种质资源圃），共收集了 13
个种源，其中 P11、P10、P12、P1、P2、P3、D6、1014、1015、GM、
ML来自缅甸，ADLY来自澳大利亚，YD来自印度，经攀枝花
市干热河谷应用生态研究中心解培惠教授鉴定均为印楝 A.
indica A. Juss的叶子，阴干，备用；另外，在每个种源的群体中
随机选取5株以上成熟植株，采集幼叶，用硅胶快速干燥，用于
ISSR分析。
2 方法与结果
2.1 印楝叶HPLC化学指纹图谱研究
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Welchrom C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；
柱温：30 ℃；流动相：0.2％乙酸溶液-乙腈，梯度洗脱（0～8
min，5％～10％乙腈；8～20 min，10％～20％乙腈；20～27
min，20％～20％乙腈；27～40 min，20％～27％乙腈；40～55
min，27％～75％乙腈；55～60 min，75％～100％乙腈）；流速：
1.0 mL·min- 1；检测波长：260 nm；进样量：10 μL。
2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取芦丁、金丝桃苷、槲
皮苷、槲皮素对照品适量，分别置于不同的50 mL量瓶中，加甲
醇溶解并稀释至刻度，制成各对照品贮备液。再分别精密吸
取各对照品贮备液适量，置于同一25 mL量瓶中，加甲醇稀释
至刻度，得混合对照品溶液（芦丁浓度为0.12 mg·mL- 1、金丝桃
苷浓度为0.018 mg·mL- 1、槲皮苷浓度为0.02 mg·mL- 1、槲皮素
浓度为0.016 mg·mL- 1）。
2.1.3 供试品溶液的制备 取印楝叶药材粉末 1.0 g，精密称
定，置圆底烧瓶中，加入石油醚30 mL，回流提取30 min，滤过，
弃去石油醚液，药渣加甲醇溶液 30 mL，水浴回流提取 1 h，放
冷，滤过，滤液浓缩，转移至25 mL量瓶中，以甲醇稀释至刻度，
摇匀，即得。
2.1.4 精密度试验 取同一批样品，按“2.1.3”项下方法制备
供试品溶液，在上述色谱条件下连续测定 5次，记录各共有色
谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，RSD均＜3％，表
明方法精密度良好。
2.1.5 重复性试验 取同一批样品6份，分别按“2.1.3”项下方
法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，记录各共有
色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，RSD均＜3％，
表明方法重复性良好。
2.1.6 稳定性试验 取同一批样品，按“2.1.3”项下方法制备
供试品溶液，在上述色谱条件下分别于 0、2、4、8、12 h进行分
析，记录各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，
RSD均＜3％，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.1.7 化学指纹图谱的建立 按“2.1.3”项下方法制备13批次
印楝叶药材的供试品溶液。精密吸取供试品溶液和对照品溶
液各 10 μL，在上述色谱条件下进行分析，记录 60 min色谱
图。详细比较各样品的色谱图，选择稳定性和重复性较好、吸
收较强、特征较明显的色谱峰为共有峰，最终标定11个特征峰
构成印楝叶药材的指纹图谱，其共有峰峰面积占总峰面积的
90％以上。通过与对照品对照，确定其中4号峰为芦丁，6号峰
为金丝桃苷，10号峰为槲皮苷，11号峰为槲皮素。印楝叶的
HPLC指纹图谱见图1。
由于4号峰分离度较好、峰面积较大，且比较稳定，经对照
品对照鉴定为芦丁的吸收峰，故确定其为内参照峰（S）。指定
其相对峰面积值为1.00，计算各批次样品指纹图谱中其他共有
特征峰的相对峰面积，见表1。
表1 印楝叶指纹图谱共有峰的相对峰面积
Tab 1 Relative peak area of common peaks of HPLC finger-
print of neem leaf
样品
P11
P10
P12
P1
P2
P3
D6
1014
1015
GM
ML
ADLY
YD
峰号
1
0.116
0.079
0.116
0.157
0.145
0.156
0.131
0.139
0.160
0.096
0.170
0.055
0.065
2
0.167
0.143
0.138
0.075
0.200
0.178
0.185
0.181
0.140
0.215
0.209
0.063
0.076
3
0.107
0.139
0.116
0.078
0.191
0.173
0.146
0.212
0.121
0.193
0.180
0.056
0.062
4（S）
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
1.000
5
0.061
0.063
0.052
0.041
0.138
0.047
0.103
0.125
0.059
0.053
0.117
0.025
0.025
6
0.069
0.097
0.063
0.067
0.148
0.142
0.085
0.089
0.088
0.133
0.123
0.026
0.035
7
0.930
0.822
0.729
1.107
1.308
1.501
1.166
1.169
0.970
1.531
1.425
0.411
0.428
8
0.214
0.245
0.230
0.284
0.397
0.209
0.232
0.232
0.235
0.297
0.236
0.163
0.174
9
0.019
0.164
0.111
0.178
0.231
0.250
0.175
0.210
0.159
0.298
0.210
0.082
0.094
10
0.200
0.256
0.166
0.232
0.367
0.323
0.330
0.443
0.316
0.376
0.481
0.125
0.162
11
0.130
0.083
0.088
0.095
0.015
0.164
0.113
0.242
0.074
0.072
0.120
0.052
0.062
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 min
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 min
A
B
图1 印楝叶的HPLC指纹图谱
A.对照品；B.样品；4.芦丁；6.金丝桃苷；10.槲皮苷；11.槲皮素
Fig 1 HPLC fingerprint of neem leaf
A. reference standard；B. sample；4. rutin；6. hyperoside；10. querci-
trin；11. quercetin
4
6 10 11
4
61 23
5
7
8 9 10 11
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中国药房 2011年第22卷第7期 China Pharmacy 2011 Vol. 22 No. 7
2.1.8 聚类分析 以 11个共有峰的相对峰面积数据为变量
（表1），13个不同种源药材为样品号，利用SPSS15.0统计软件，
采用系统聚类分析法（Hierarchical Cluster）中的组间距离法，
以欧氏距离为测度进行样品聚类，见图2。
2.2 印楝叶遗传变异的 ISSR分析[6]
2.2.1 DNA的提取及 ISSR扩增 采用改良十六烷基三甲基
溴化铵（CTAB）法[7]提取总DNA。反应体系总体积为 20 μL，
其中模板DNA 2.0 μL（20 ng），5 mmol·L- 1MgCl2 4.0 μL，10×
PCR buffer 2.0 μL，10 mmol·L- 1dNTP 2.0 μL，Taq酶（5 U·μL- 1）
0.4 μL，引物（10 μmol·L- 1）0.4 μL，其余为无菌双蒸水。扩增
程序：94 ℃预变性 5 min；然后按以下三步进行 40个循环：
94 ℃变性 30 s，48 ℃复性 45 s，72 ℃延伸 2 min；循环结束后
72℃延伸7 min，4℃保温。扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳分
离，0.5 μg·mL- 1溴乙啶（EB）染色，在凝胶成像系统上检测拍照。
2.2.2 遗传变异与遗传分化 利用POPGENE软件分析数据，
并用非加全算术平均聚类法（UPGMA）进行聚类分析，构建树
状图。结果，9条引物共扩增出81个位点，其中多态性位点有
79个，多态位点百分率（PPB）为 97.53％，Shannon指数种水平
为0.553 7，Nei’s指数种水平为0.380 3，表明印楝在物种水平
上具有丰富的遗传多样性。聚类分析将 13个种源分为两大
类：来自缅甸的11个种源聚成一类；来自澳大利亚和印度的种
源聚成另外一类，见图3。
2.3 印楝叶化学成分与遗传变异的相关性分析
综合比较分析基于Nei’s遗传距离和 11个共有峰相对峰
面积数据得到的 2个聚类图，结果表明，不同种源印楝叶药材
化学成分差异与遗传变异均呈现出一定的规律性，即 13个种
源都聚成两大类：来自缅甸的11个种源聚成一类；来自澳大利
亚和印度的种源聚成另外一类。可见，无论从遗传变异角度，
还是化学成分层次上，此结果都揭示了来自澳大利亚和印度
的种源遗传距离（亲缘关系）较近，而与其他 11个缅甸种源的
遗传距离（亲缘关系）较远，也表明了印楝叶黄酮类化学成分
与遗传信息之间具有一定的相关性。
但缅甸种源间的差异性在化学成分和遗传变异上并不一
致。从2个聚类图上可以看到，印楝叶化学成分聚类图中的缅
甸种源与遗传距离聚类图中的同一种源间并没有表现出一致
的对应关系。这提示除了遗传因子外，还有其他重要的因素
在影响印楝叶次生代谢产物（化学成分）的生成与积累。
3 讨论
根据中药指纹图谱研究的技术要求及相关实例[8，9]，本研
究考察了甲醇-水、乙腈-0.2％乙酸溶液、乙腈-0.2％磷酸溶液
等流动相系统，结果以乙腈-0.2％乙酸溶液梯度洗脱，分离效
果最佳。试验还考察了不同检测波长下样品的指纹图谱，结
果在254、320 nm波长处主要色谱峰吸收较弱，360 nm波长前
段色谱峰缺失，而在260 nm波长处色谱峰分离度较好、吸收较
强，故选择260 nm为测定波长。在上述色谱条件下分析13个
种源印楝叶药材的HPLC指纹图谱，标定 11个共有特征指纹
峰，其中 4号峰为芦丁，6号峰为金丝桃苷，10号峰为槲皮苷，
11号峰为槲皮素。经方法学验证，该指纹图谱专属性强、重复
性好，方法稳定、可靠，可为印楝叶药材的质量标准研究提供
科学依据。
药用植物的遗传多样性与植物形态表型差异、化学成分
变异息息相关，最终影响到药材的药效作用。因此，研究植物
类药材种内遗传多样性与化学成分多样性之间的关系，对于
今后选择遗传稳定的优质药材种源具有重要的意义。从 2个
聚类分析树状图可以看出，印楝叶遗传信息与化学成分之间
存在较好的相关性，说明在影响印楝叶化学成分变异的众多
因素中，遗传背景不同所造成的影响有着不可忽视的作用。
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11
12
9
8
5
3 1
2
10
7 4
6 P11
P2
1015
ML
GM
P10
P12
P1
P3
D6
1014
ADLY
YD
15.0 10.0 5.0 0.0
图2 基于Nei’s遗传距离的聚类图
Fig 2 Dendrogram of Nei’s genetic distance
0 5 10 15 20 25
YD
ADLY
P3
GM
ML
P2
P10
P12
P11
D6
1014
P1
1015
CASE
Label Num
图3 表征化学成分的聚类图
Fig 3 Dendrogram of chemical components
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