全 文 ：袁竹连． 番木瓜叶叶绿素的提取及叶绿素铜钠的制备［J］． 江苏农业科学，2013，41(4) :244 － 247．
番木瓜叶叶绿素的提取及叶绿素铜钠的制备
袁竹连
(广西民族师范学院化学与生物工程系，广西崇左 532200)
摘要:研究了番木瓜叶叶绿素的提取和叶绿素铜钠的制备工艺及其稳定性。结果表明，叶绿素的最佳提取工艺条
件为:以 V(丙酮)∶ V(95%乙醇)=1 ∶ 3作提取溶剂，浸提温度 60 ℃，浸提时间 3 h，料液比 1 g ∶ 35 mL。正交验证试验，
RSD为 0． 544%;经过皂化、酸化、铜代、成盐等工序制成叶绿素铜钠产品，RSD为 1． 26%，平均产率为 3． 29%，主要技术
指标符合国家 GB 26406—2011标准，紫外、红外光谱分析符合标准，水溶性好，具有一定的耐热和耐酸碱性，宜避光保存。
关键词:番木瓜;叶;叶绿素;提取;叶绿素铜钠;制备
中图分类号:O652． 4 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)04 － 0244 － 04
收稿日期:2012 － 11 － 19
基金项目:广西教育厅科研项目(编号:201106LX659)。
作者简介:袁竹连(1982—) ，女，湖南邵阳人，硕士，讲师，研究方向为
食品分析与检测。E － mail:332075601@ qq． com。
随着人们对安全意识的提高，开发天然的食用色素成为了
研究的热点。西方的一些发达国家在食品中使用天然色素的
比例已高达 85%，并有取代合成色素的趋势［1］。叶绿素是一
种安全的天然脂溶性色素，但是天然叶绿素遇热、光、酸、碱等
易分解，且不溶于水，难以广泛应用，在实际应用中往往制成叶
绿素铜钠，以提高其稳定性。叶绿素铜钠是叶绿素的一种衍生
物，是 FAO、WHO和我国食品添加剂标准委员会批准使用的一
种安全无毒的水溶性天然食用色素［2］。研究表明，叶绿素和叶
绿素铜钠具有抗突变、抗辐射、解热、止血、脱臭、改善便秘、降
解胆固醇、促进肝功能恢复等多种生理功能［3 －4］。
番木瓜为蔷薇科木瓜属植物，在我国分布广泛。中医认
为木瓜具有舒经活络、健脾开胃、舒肝止痛、祛风除湿的功效。
木瓜叶提取物能杀死癌细胞［5］，但从番木瓜叶中提取叶绿素
并制备叶绿素铜钠国内外未见报道。目前，番木瓜叶没有被
直接利用，最终因枯萎而浪费。为充分利用植物资源，变废为
宝，本研究以番木瓜叶为原料，探讨了番木瓜叶叶绿素提取工
艺和叶绿素铜钠的制备工艺以及产品的稳定性，为番木瓜资
源的进一步开发利用提供科学依据。
1 材料与方法
1． 1 仪器与试剂
旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂) ;电子天平(上海奥
豪斯仪器有限公司) ;烘箱(上海福玛仪器设备有限公司) ;
HH －6 数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司) ;DF －
101S集热式恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限公
司) ;722 可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司，
测定用) ;UV －6100S型紫外可见分光光度计(上海元析仪器
有限公司，波长扫描用) ;pHS － 3C型实验室 pH计(上海今近
仪器仪表公司) ;SPECTRUM 65 型傅里叶变换红外光谱仪
(美国 Perkin Elmer公司)。
番木瓜叶采自广西崇左。供试试剂 95%乙醇、丙酮、石
油醚、盐酸、氢氧化钠、五水硫酸铜等均为分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 原料预处理 新鲜番木瓜叶，去掉黄叶和杂质，采用
蒸馏水清洗干净，切碎，放入烘箱内于 60 ℃烘干，粉碎，过
0. 5 mm 筛，于干燥器内保存备用。
1． 2． 2 叶绿素提取与测定 单因素和正交试验均准确称取
1． 000 0 g预处理好的番木瓜叶样品，在不同条件下浸提后，
抽滤，收集滤液，定容至 50 mL，取出 1 mL再定溶至 10 mL，进
行叶绿素含量测定。选择波长 652 nm处测吸光度［6］，以吸光
值为考查指标，筛选出最佳提取条件。
1． 2． 2． 1 溶剂的选择 分别设置 95%乙醇、80%丙酮以及
V(丙酮)∶ V(95%乙醇)分别为 1 ∶ 1、2 ∶ 1、3 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3
的共 7 种提取溶剂，以料液比 1 g ∶ 15 mL，于 50 ℃下分别浸
提 2 h，筛选出最佳提取溶剂。
1． 2． 2． 2 料液比的选择 以筛选出的最佳溶剂为提取溶剂，
料液比(g ∶ mL)分别设置为 1 ∶ 10、1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、
1 ∶ 30、1 ∶ 35，在 50 ℃恒温水浴中浸提 2 h，筛选出最适料
液比。
1． 2． 2． 3 浸提时间的选择 以筛选的最佳溶剂为提取溶剂，
选择最适料液比，在 50 ℃恒温水浴中分别浸提 0． 5、1． 0、
1. 5、2． 0、3. 0、4． 0 h，筛选出最佳提取时间。
1． 2． 2． 4 浸提温度的选择 在最佳溶剂、最佳料液比和最佳
浸提时间的条件下，分别在 30、40、50、60、65 ℃的恒温水浴中
浸提，筛选出最佳提取温度。
1． 2． 2． 5 正交试验 根据单因素试验考查结果，以最佳溶剂
为提取溶剂，选取料液比、浸提时间和浸提温度 3 个因素为主
要影响因素，设计 L9(3
4)正交试验，以确定番木瓜叶叶绿素
提取的最佳工艺条件。
1． 2． 2． 6 验证试验 选用最佳溶剂为提取溶剂，并按照正交
优化得到的最佳工艺，称取番木瓜叶预处理样 3 份，进行叶绿
素提取，并计算平均吸光值和相对标准偏差。
1． 2． 3 叶绿素铜钠的制备 先按正交试验最佳工艺条件制
备叶绿素。叶绿素铜钠制备有 2 种途径:一是先皂化后铜代;
二是先铜代后皂化。本试验采取第一种方法。试验工艺流程
为:叶绿素→烧碱皂化→浓缩→石油醚萃取→盐酸酸化→铜
代→过滤→溶解成盐→抽滤→干燥→叶绿素铜钠。
—442— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 4 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.04.012
1． 2． 3． 1 皂化 65 ℃恒温水浴中，接通冷凝管在磁力搅拌
器下加热回流进行皂化。以筛选最佳皂化时间(10、20、30、
40 min)以及最佳 V(叶绿素)∶ m(NaOH)的体积质量比为
400 ∶ 0． 1、200 ∶ 0． 1、100 ∶ 0． 1、50 ∶ 0． 1 (mL ∶ g)。
1． 2． 3． 2 萃取 为了降低成本，减少萃取时石油醚的用量，
在萃取前进行减压浓缩至原体积的 1 /4 ～ 1 /5 左右，此时，依
次加入分别为萃取液体积 1、0． 8、0． 5 倍的石油醚于浓缩液
中，分步萃取，除去脂溶杂质，反复萃取至醚层呈淡黄色为止。
1． 2． 3． 3 酸化 考查影响酸化效果的 2 个最主要条件，即酸
化时间和 pH值。在叶绿素皂化液中滴加浓 HCl，pH 值分别
调为 1、2、3、4，于 65 ℃恒温水浴中，接通冷凝管，在磁力搅拌
器下加热，分别回流 20、30、40 min进行酸化。
1． 2． 3． 4 铜代 脱镁叶绿酸转入烧瓶中，按照脱镁叶绿酸与
15%硫酸铜体积比 10 ∶ 1 加入 15%硫酸铜水溶液，此时溶液
颜色由黄绿色变成墨绿色。为了转化彻底，本试验再依次多
加入 2、1 mL 硫酸铜溶液，边加边搅拌。然后将烧瓶置于
65 ℃ 恒温水浴中，磁力搅拌器下加热回流 1 h。在加热过程
中铜与脱镁叶绿素酸反应生成难溶于水的叶绿素铜酸，烧瓶
中很快出现膏状沉淀。加入 1 倍体积的蒸馏水进行稀释，叶
绿素铜酸会很快浮起，抽滤，滤饼用 60 ℃蒸馏水洗涤至滤液
呈无色，滤干，得到叶绿素铜酸，呈墨绿色细小疏松的颗粒。
1． 2． 3． 5 成盐 过滤后所得叶绿素铜酸沉淀连同滤纸溶于
丙酮，至丙酮洗液无色为止，合并洗液。滴加 5% 氢氧化
钠 －乙醇溶液调整 pH值至约 12，结晶 1 h。抽滤，丙酮洗涤，
60 ℃干燥至恒重，粉碎得墨绿色有金属光泽的叶绿素铜钠
粉末。
此外，本试验还对制备的叶绿素铜钠进行了质量、光谱性
质及稳定性等方面的综合分析。
2 结果与分析
2． 1 叶绿素提取与测定
2． 1． 1 溶剂的选择 由表 1 可知，V(丙酮)∶ V(95%乙醇)
为 1 ∶ 1 和 1 ∶ 3 的溶剂均有较好且相近的浸提效果，但乙醇
成本低且毒性小，所以选择 V(丙酮)∶ V(95%乙醇)为 1 ∶ 3
的溶液作为本试验的提取溶剂。
表 1 番木瓜叶叶绿素提取溶剂的选择
溶剂
95%
乙醇
80%
丙酮
V(丙酮)∶ V(95%乙醇)
1 ∶ 1 2 ∶ 1 3 ∶ 1 1 ∶ 2 1 ∶ 3
吸光度 D 0． 270 0． 199 0． 316 0． 281 0． 255 0． 284 0． 315
2． 1． 2 料液比的选择 在料液比为 1 g ∶ 10 mL ～
1 g ∶ 30 mL 之间，叶绿素提取量随料液比增大而增大，当达
到 1 g ∶ 30 mL 时为最大值，然后随料液比增大反而减少(图
1)。可见适当的料液比有利于提高叶绿素的溶出率，料液比
过小，则溶剂量过少，溶解不完全，造成提取体系渗透压过高，
阻碍叶绿素的进一步溶出。料液比过大，会增加处理量及能
量吸收，造成溶剂大量浪费，同时伴随其他杂质的溶解，在一
定条件下反而干扰了叶绿素的提取而导致结果偏低，所以料
液比宜选择 1 g ∶ 30 mL。
2． 1． 3 浸提时间的选择 浸提时间在 0． 5 ～ 2． 0 h，叶绿素提
取量随时间增加而增大，浸提2h达到最大值;浸提时间在
2． 0 ～ 4． 0 h，随时间增加叶绿素提取量反而减少(图2)。随
着浸提时间的延长，叶绿素能逐渐地被溶解出来，浸提到一定
时间后叶绿素基本被完全溶解，再继续延长浸提时间，叶绿素
在热的条件下发生不同程度的分解，分解的速度大于溶出速
度，且时间越长，分解越多，从而导致提取量反而降低。所以
浸提时间不能太长，宜选择 2 h为提取时间。
2． 1． 4 浸提温度的选择 随着浸提温度的升高，叶绿素的提
取量增大，但当提取温度达到 50 ℃以后，则提取效果开始下
降(图 3)。可能的原因是高温引起叶绿素脱镁反应所致，且
高温难以控制，耗能大，成本也高，所以浸提温度要合适，本试
验宜选择 50 ℃为最佳提取温度。
2． 1． 5 正交试验结果 由表 2 可知，影响番木瓜叶叶绿素提
取效果的因素主次顺序为:A ＞ C ＞ B，即浸提温度 ＞料液比 ＞
浸提时间。最佳提取工艺参数为:A3B3C3，即:反应温度
60 ℃，浸提时间 3 h，料液比 1 g ∶ 35 mL。
2． 1． 6 验证试验 准确称取 1． 000 0 g预处理好的番木瓜叶
样品，在最佳条件组合 A3B3C3 下，进行了 3 次平行验证性试
验，以考察最佳条件的合理性和可靠性。3 次测得吸光值分
别为 0． 463、0． 460、0． 465，平均值为 0． 463，均高于正交表中
的试验结果，RSD为 0． 544%，表明优化得到的提取条件好，
重复性好，数据可靠。
2． 2 叶绿素铜钠的制备
2． 2． 1 皂化条件 按“1． 2． 3． 1”节的方法，通过加入石油醚
观察，醚层颜色呈黄色，分界面清晰，表明皂化完全。表3表
—542—袁竹连:番木瓜叶叶绿素的提取及叶绿素铜钠的制备
表 2 番木瓜叶叶绿素提取的正交试验结果
序号
A:温度
(℃)
B:时间
(h)
C:料液比
(g ∶ mL) 空列 吸光值 D
1 1(40) 1(1． 5) 1(1 ∶ 25) 1 0． 328
2 1 2(2． 0) 2(1 ∶ 30) 2 0． 373
3 1 3(3． 0) 3(1 ∶ 35) 3 0． 401
4 2(50) 1 2 3 0． 379
5 2 2 3 1 0． 417
6 2 3 1 2 0． 394
7 3(60) 1 3 2 0． 412
8 3 2 1 3 0． 386
9 3 3 2 1 0． 443
K1 1． 102 1． 119 1． 108 1． 188 A ＞ C ＞ B
K2 1． 190 1． 176 1． 195 1． 179
K3 1． 241 1． 240 1． 230 1． 166
k1 0． 367 0． 373 0． 369 0． 396
k2 0． 396 0． 392 0． 398 0． 393
k3 0． 413 0． 413 0． 410 0． 389
R 0． 046 0． 040 0． 041 0． 799
明，从节约成本和时间的角度出发，选择叶绿素与 NaOH的体
积质量比为 100 mL ∶ 0． 1 g、皂化时间 10 min即可皂化完全。
2． 2． 2 酸化条件 按照“1． 2． 3． 3”的方法进行酸化。叶绿
素充分酸化后变成褐色的脱镁叶绿酸，通过观察溶液颜色变
化确定最佳的酸化时间和 pH 值。表 4 表明，从节约成本和
时间的角度出发，选择 pH值为 1 ～ 2、酸化时间 20 min即可酸
化完全。
2． 3 叶绿素铜钠分析
2． 3． 1 质量分析 最终产品为墨绿色粉末，带有金属光泽，
易溶于水，水溶液无沉淀，为透明蓝绿色，在空气中容易吸潮，
微溶于甲醇、乙醇、氯仿，不溶于石油醚、丙酮、正己烷。经测
定其主要技术指标符合国家 GB 26406—2011 标准，见表 5。
2． 3． 2 紫外光谱分析 将叶绿素铜钠用蒸馏水配成质量分
数为 0． 002%的溶液，用 UV － 6100S 紫外可见分光光度计于
波长 350 ～ 750 nm下扫描。扫描参数:扫描方式 Abs，扫描速
度中速，波长间隔 0． 2 nm。由图 4 可知，在 406． 2 nm 和
627. 0 nm 处有最大吸收峰，与叶绿素铜钠标准图谱基本
一致［7 － 9］。
表 3 皂化条件对叶绿素铜钠的影响
皂化时间
(min)
V(叶绿素) (mL)∶ m(NaOH) (mg)
400 ∶ 0． 1 200 ∶ 0． 1 100 ∶ 0． 1 50 ∶ 0． 1
10 醚层浅绿色，界面模糊 醚层浅绿色，界面清晰 醚层黄色，界面清晰 醚层黄色，界面清晰
20 醚层浅绿色，界面模糊 醚层浅绿色，界面清晰 醚层黄色，界面清晰 醚层黄色，界面清晰
30 醚层浅绿色，界面模糊 醚层浅绿色，界面清晰 醚层黄色，界面清晰 醚层黄色，界面清晰
40 醚层浅绿色，界面模糊 醚层浅绿色，界面清晰 醚层黄色，界面清晰 醚层黄色，界面清晰
表 4 酸化条件对叶绿素铜钠的影响
pH值
不同酸化时间下的效果
10 min 20 min 30 min 40 min
1 溶液红褐色，反应不完全 溶液褐色，反应完全 溶液褐色，反应完全 溶液褐色，反应完全
2 溶液红褐色，反应不完全 溶液褐色，反应完全 溶液褐色，反应完全 溶液褐色，反应完全
3 溶液红褐色，反应不完全 溶液红褐色，反应不完全 溶液褐色，反应完全 溶液褐色，反应完全
4 溶液墨绿色，反应不完全 溶液墨绿色，反应不完全 溶液墨绿色，反应不完全 溶液墨绿色，反应不完全
表 5 叶绿素铜钠产品各项质量指标
质量指标 pH值 干燥失重
(%)
吸光度
［E1%1 cm(405 ± 3 nm) ］
消光值
GB 26406—2011 9． 5 ～ 11． 0 ≤5． 0 ≥568 3． 2 ～ 4． 0
产品 9． 98 0． 32 599 3． 5
2． 3． 3 红外光谱分析 采用溴化钾压片法，波数范围为
4 000 ～ 450 cm －1，分辨率为 4 cm －1。叶绿素铜钠是 4 个吡咯
环与 Cu原子相结合形成的一类重要的卟啉配合物，如图 5。
从红外图谱可以看出 3 414 cm －1为—OH 缔合伸缩振动峰;
2 922、2 851 cm －1分别为—CH3 的反对称伸缩峰和对称伸缩
峰;1 561、1 446 cm －1为芳香烃骨架伸缩振动峰，说明分子中
存在苯环骨架结构，与文献［10］叶绿素 1 156 cm －1峰对比发
生蓝移，说明 Cu 原子已经代替了 Mg 原子;721、823、987、
1 034 cm －1 为 C C上的 C—H键弯曲振动。根据查阅的文
献和红外图谱分析可证实制备的化合物具有叶绿素铜钠的官
能团特征［11 － 13］。
—642— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 4 期
2． 3． 4 温度对叶绿素铜钠稳定性的影响 配制一系列质量
分数为 0． 002%叶绿素铜钠水溶液各 10 mL，分别置于室温
25、50、60、70、80、90 ℃的恒温水浴中 1 h，测其吸光度，结果
如图 6 所示。从图 6 中看出，温度越高，叶绿素铜钠溶液越不
稳定，在 70 ℃以下比较稳定，超过 70 ℃时，吸光度下降较快。
2． 3． 5 pH值对叶绿素铜钠稳定性的影响 配制一系列质量
分数为 0. 002% 的叶绿素铜钠水溶液各 10 mL，分别采用
0． 1 mol /L 的 HCl或者 NaOH调成一系列不同的 pH值，测其
吸光度。如图 7 所示，初始溶液 pH 值为 9． 13，吸光值为
0. 356，可见，吸光值随 pH 值的增加而增大，在酸性条件 pH
值为 2 ～ 6 范围内变化比较平稳，在微碱性条件下 pH 值为
7 ～ 9 内，叶绿素铜钠溶液稍稳定，pH 值超过 9． 13 后变化较
快。所以宜微碱性条件下保存叶绿素铜钠比较好。
2． 3． 6 叶绿素铜钠光稳定性 取 20 mL 的 0． 002%叶绿素
铜钠溶液于比色管中，然后放置于自然光下，每天定时取样于
405 nm处测量吸光值。由图 8 可知，光照后 1、2、3、4、5 d 的
吸光度分别为原样的 0． 81、0． 65、0． 32、0． 25、0． 08 倍，吸光度
随光照时间的增加而呈下降趋势，2 d 开始明显下降，所以应
避光保存。
2． 3． 6 叶绿素铜钠产率计算 准确称取 20． 000 0 g 预处理
好的番木瓜叶样品 3 份，按照以上方法制备，分别得到叶绿素
铜钠质量 0． 653 4、0． 652 1、0． 667 1，RSD 为 1． 26%，重复性
好，平均产率为 3． 29%。
3 结论与讨论
从番木瓜叶中提取叶绿素的最佳工艺条件为:以 V(丙
酮)∶ V(95%乙醇)= 1 ∶ 3 混合溶液作提取溶剂，浸提温度
60 ℃，浸提时间 3 h，料液比为 1 g ∶ 35 mL。经试验验证，RSD
为 0. 544%，表明提取的叶绿素具有较好的稳定性。对提取
的番木瓜叶叶绿素进行化学改性，按先皂化后铜代工艺法制
备叶绿素铜钠，平均产率为 3． 29%，主要质量分析、紫外光谱
和红外光谱分析基本符合标准，产品水溶性好，宜避光保存，
在 70 ℃ 以下热稳定性较好，具一定的酸、碱稳定性，但碱性
介质对其影响较大。
本研究首次从番木瓜叶中制备叶绿素铜钠，一方面丰富
了天然色素新来源，可用于配制酒、饮料、糖果、果冻、冰淇淋、
雪糕、冰棍、糕点上等食品的色彩装，还可作为各种绿色药物
牙膏和化妆品等日用化工原料，另一方面开辟了番木瓜生产
的综合利用途径，提高了经济效益。
参考文献:
［1］许友姣，刘 洋，陆利霞，等． 新天然色素的研究进展［J］． 食品
研究与开发，2009，30(1) :165 － 168．
［2］喻 薇，纪平雄． 铜氨法生产叶绿素铜钠工艺优化［J］． 食品科
学，2012，33(12) :119 － 122．
［3］刘玲玲． 仙人掌叶绿素的提取及叶绿素铜钠的制备工艺研究
［J］． 食品工业科技，2009(6) :240 － 242．
［4］张 亮，曹丛华，任荣珠，等． 大叶黄杨叶绿素的提取及稳定性研
究［J］． 安徽农业科学，2010，38(17) :8923 － 8925．
［5］周吴萍，韦 宾． 正交设计法优选木瓜叶总黄酮超声提取工艺
［J］． 广西工学院学报，2012，23(2) :92 － 94．
［6］罗祖友，袁 萍，莫开菊． 姜叶叶绿素的提取及叶绿素铜钠的制
备［J］． 食品科学，2008，29(10) :361 － 364．
［7］孔鲁裔． 果酒中叶绿素铜钠的测定 分光光度法［J］． 生命科学仪
器，2008，6(1) :48 － 53．
［8］黄晓德，钱 骅，赵伯涛． 西兰花叶叶绿素提取及叶绿素铜钠制
备工艺研究［J］． 中国野生植物资源，2007，26(3) :45 － 47．
［9］刘爱文，陈 忻，高永辉，等． 萝卜樱叶绿素铜钠的制备和性质研
究［J］． 广东化工，2004(7) :11 － 13．
［10］童晓滨，谢 好，宋卫军． 雷竹叶叶绿素铜钠的制备及其光谱研
究［J］． 化学工程师，2008，(5) :21 － 24．
［11］Castano A P，Demidova T N，Hamblin M R． Mechanisms in photody-
namic therapy:part one － photosensitizers，photochemistry and cellu-
lar localization［J］． Photodiagnosis and Photodynamic Therapy，
2004，1(4) :279 － 293．
［12］单 超，刘六军，陈素文． 杜仲全叶综合利用中叶绿素和 β 胡萝
素提取分离的研究［J］． 林产化工通讯，2005，39(4) :16 － 19．
［13］杨德全，王升文，王 俏，等． 地椒草制取叶绿素铜钠的研究
［J］． 延安大学学报:自然科学版，1998，17(4) :39 － 43．
—742—袁竹连:番木瓜叶叶绿素的提取及叶绿素铜钠的制备