全 文 ：基金项目:国家自然科学基金(81260668) ;新疆医科大学“天山英才工程”专项基金(Y0382002)
作者简介:田玉娥(1973－) ，女，本科，主治医师，研究方向:中西医结合皮肤病研究。
通信作者:田 莉，博士，教授，硕士生导师，研究方向:中药民族药新制剂研究与开发，E-mail:tianli109@ 126． com。
新疆酸石榴皮提取物的体外抑菌实验研究
田玉娥1，刘江杰1，王东东2，3，田 莉2，3
(1武警兵团指挥部医院，乌鲁木齐 830063;2新疆医科大学中医学院;3新疆名医名方与特色方剂学重点实验室，乌鲁木齐 830011)
摘要:目的 研究石榴皮不同极性提取物的体外抑菌活性，寻找抗菌活性成分。方法 采用微孔板法和稀
释法研究石榴皮不同极性提取物对变异链球菌和大肠杆菌生长及其生物膜形成的影响。结果 石榴皮的不同极
性提取物对变异链球菌和大肠杆菌的生长无明显抑制作用，而对其生物膜形成有明显抑制作用，石榴皮正丁醇、乙
醇和水提取物对变异链球菌生物膜形成有明显抑制作用，氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物对大肠杆菌生物膜的形
成有不同程度的抑制作用。结论 石榴皮提取物对变异链球菌生长和大肠杆菌生物膜形成具有较好的抑制作
用，值得进一步研究开发。
关键词:石榴皮;提取物;体外抗菌活性;生物膜;稀释法
中图分类号:Ｒ963 文献标识码:A 文章编号:1009-5551(2016)02-0142-04
doi:10． 3969 / j． issn． 1009-5551． 2016． 02． 004
Study on the antibacterial test of pomegranate peel extracts in vitro
TIAN Yue1，LIU Jiangjie1，WANG Dongdong2，3，TIAN Li2，3
(1Hospital of the Armed Police Corps Hedquarter，Urumqi 830063，China;2College of TCM，
Xinjiang Medical University;3Xinjiang Key Laboratory of Famous Prescription and
Science of Formula，Urumqi 830011，China)
Abstract:Objective To study the antibacterial activities of the different solvent extracts from pomegranate peel and
find antibacterial active components． Methods Microwell plate method and double dilution method were used to
determine the influence of growth and biofilm formation about the different solvent extracts of pomegranate peel a-
gainst streptococcus mutans and Escherichia col． Ｒesults The extracts with different solvnts of pomegranate peel
have no inhibition on the growth of stretopcoccus mutans and Escherichia col，，but have obvious inhibitory effect on
biofilm formation． ． N-butanol extract，ethanol extract and water extract of pomegranate peel showed the obvious an-
tibacterial activity on the biofilm formation of stretopcoccus mutans． Chloroform extract，ethyl acetate extract and n-
butanol extract showed the different levels of antibacterial activity on the biofilm formation of Escherichia col． Con-
clusion The extracts of pomegranate peel have obvious antibacterial activity on the growth of streptococcus mutans
and biofilm formation of Escherichia col． which is worth researching and developing． ．
Keywords:pomegranate peel;extracts;antibacterial test in vitro;biofilm;dilution method
石榴皮为石榴科 (Punicaceceae)植物石榴
(Punica granatum L．)的干燥果皮。该药材收载于
《中国药典》和《维吾尔药志》，具收具有涩肠、止血、
杀虫功效，用于治疗各类痢疾、小儿消化不良、烧伤、
炎症等疗效显著［1－2］。现代研究发现，石榴皮具有
抗菌、抗病毒、抗癌、降糖、免疫调节、改善心血管系
统等作用［3］。新疆石榴品种好，栽培面积广，资源
丰富，利用石榴自然脱落的花瓣进行药学研究，极具
第 39 卷 第 2 期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Vol． 39 No． 2
2016 年 2 月 Journal of Xinjiang Medical University Feb． 2016
实用价值。本研究采用微孔板法和稀释法进行石榴
皮不同极性部位提取物体外抗菌实验的初步研究，
为石榴皮有效成分的成药性研究提供实验依据。
1 仪器与材料
SPECTＲAMAX 190 酶标仪(美国 Molecu1ar De-
vices公司) ，YJ-875A 医用净化工作台(苏州金燕净
化设备厂) ，DNP-9162 型电热恒温培养箱(上海精
宏实验设备有限公司) ，3110 系列 CO2 培养箱
(Thermo Scientific Water Jacketed Incubator，USA) ，
YXQ-LS-SI全自动立式电热压力蒸汽灭菌器(上海
博迅实业医疗设备厂) ，XS105 型电子天平(梅特勒-
托利多仪器有限公司)。石榴皮(Flos granati)购于
新疆维吾尔自治区维吾尔医院，经新疆医科大学中
医学院乌莉娅·沙衣提教授鉴定为石榴 (Punica
granatum L．)的干燥果皮。变异链球菌(ATCC
700610)、大肠杆菌(ATCC 35218)均购自中国药品
生物制品检定所，BHI 培养基(Brain Heart Infusion
Broth，Dickinson and company，USA) ，NB 培养基
(Nutrient Broth，Dickinson and company，USA) ，结晶
紫(上海研晶生物科技有限公司，CAS548-62-9) ，去
氧胆酸钠(Sodium deoxycholate，SD ，Sigma-Aldrich
公司) ，所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2． 1 石榴皮提取物的制备 精密称取石榴皮粗粉
200 g，用石油醚 1． 5 L 回流提取 1． 5 h 后，滤过，滤
渣依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水 1． 5 L
回流提取 2 h后滤过，均重复提取 3 次，滤液分别置
于旋转蒸发仪中浓缩减压后得稠浸膏，再经冷冻干
燥成粉末，均密封冷藏备用。
2． 2 石榴皮提取物化学成分鉴别 分别取石榴皮
不同极性提取物适量，加入蒸馏水溶解，采用试管法
进行化学成分的理化鉴别。结果石榴皮不同极性提
取物中含有糖、苷类、酚类鞣质、黄酮类、有机酸、氨
基酸和蛋白质等成分，见表 1。
2． 3 抑菌实验
2． 3． 1 菌种复苏与培养 将变异链球菌(ATCC
25923)、大肠杆菌(ATCC 25922)标准菌种置于装有
2 mL培养基的有盖试管中，置于 37℃、5% CO2 培
养箱内培养 16 h 后，经比浊法判断试管变浑浊，表
明菌种已复苏。把灭菌培养皿和培养基倒平板，冷
却凝固后，用接种针挑取少许复苏后的标准菌种划
线接种，37℃恒温培养箱中培养 24 h 后进行活化，
使菌种有较强的活力。经复苏转种培养后，取新传
代大肠杆菌、变异链球菌置于已灭菌的装有 2 mL培
养基的有盖试管中，加入适量 40% 葡萄糖，置于
37℃、5%CO2 培养箱内培养 24 h 后，培养液用肉汤
培养基稀释，充分震荡后并用麦氏比浊管法调整菌
液浓度为 109 CFU /mL。
表 1 石榴皮化学成分鉴别
成分类型 /试验方法
结果(阴性“－”、阳性“+”)
石油醚 氯仿 乙酸乙酯 正丁醇 乙醇 水
氨基酸，蛋白质
茚三酮试验 + + － + + +
双缩脲反应 + + － + + +
糖及其苷类
碱性硫酸铜试验 + + + + + +
a-萘酚反应 + + + + + +
类鞣质
1%三氯化铁试液 + + + + + +
明胶试验 + + + + + +
有机酸
溴酚蓝试剂 + － + + + +
皂苷
泡沫试验 － － － － － +
醋酐-浓硫酸试验 － － － － － +
黄酮类
盐酸镁粉试验 + + + + + +
三氯化铝试验 + + + + + +
蒽醌类
乙酸镁反应 － － － － － －
碱液试验 － － － － － －
内酯 香豆素
异羟戊酸铁试验 － － － － － －
荧光试验 － － － － － －
强心苷
碱性苦味酸试验 － － － － － －
3，5-二硝基苯甲酸试验 － － － － － －
生物碱
鞣酸试验 － － － － － －
苦味酸试验 － － － － － －
硅钨酸试验 － － － － － －
甾体三萜
醋酸-浓硫酸试验 － － － － － －
挥发油
油斑检查 － － + － － －
2． 3． 2 微孔板法筛选抑菌活性 采用 96 孔微孔板
进行抑菌活性的快速筛选［4］。分别取变异链球菌、
大肠杆菌悬液用培养液 50 倍稀释，混匀。把石榴皮
不同极性提取物分别溶解在适宜溶剂中制成 2 000
μg /mL的溶液，经微孔滤膜除菌后，在 96 孔板上用
肉汤培养基与大肠杆菌、变异链球菌作连续对倍稀
释，使含药浓度分别为 1 000、500、250、125、62． 5
μg /mL。相同条件下，以纯二甲亚砜作为溶剂对照，
仅含菌液作为空白对照，以阿莫西林作为阳性对照，
同一板重复 3 次，共置于 37℃、5% CO2 培养箱内培
养 18 h，以培养液透明为无菌生长的最低抑菌浓度
341第 2 期 马燕萍，等:新疆酸石榴皮提取物的体外抑菌实验研究
(MIC值)。
2． 3． 3 抑菌效果的测定 用酶标仪于 450 nm波长
处测定细菌的 OD(Optical Density)值，将 96 孔板用
蒸馏水清洗数遍，再用 1%结晶紫染色 15 min，用蒸
馏水冲洗至透明后，加入 2%的 SD 洗脱生物膜，再
用酶标仪于 605 nm波长处测试生物膜的 OD值。
抑菌率的计算方法:抑菌率(%)=(溶剂 OD值
－样品 OD值)/溶剂 OD值。
2． 3． 4 石榴皮不同极性提取物对变异链球菌的抑
菌率 石榴皮不同极性提取部位对变异链球菌的生
长无明显抑制作用;正丁醇、乙醇和水提取物对变异
链球菌生物膜形成有明显抑制作用，正丁醇、乙醇提
取物浓度为 250 μg /mL时，抑制率＞50%，见表 1、2。
表 1 石榴皮不同极性提取部位抑制变异链球菌
生长的抑制率 /%
稀释度 浓度 /(μg /mL) 氯仿 乙酸乙酯 正丁醇 乙醇 水
1 ∶ 2 1 000 －122． 21 －17． 97 －15． 97 －35． 70 －117． 79
1 ∶ 4 500 －25． 19 －7． 52 －9． 30 －14． 79 －50． 58
1 ∶ 8 250 －13． 41 8． 69 41． 49 －4． 41 －33． 11
1 ∶ 16 125 －5． 38 4． 91 38． 87 －6． 93 －10． 12
1 ∶ 32 62． 5 －4． 33 1． 72 20． 29 0． 46 －2． 43
表 2 石榴皮不同极性提取部位抑制变异链球菌
生物膜形成的抑制率 /%
稀释度 浓度 /(μg /mL) 氯仿 乙酸乙酯 正丁醇 乙醇 水
1 ∶ 2 1 000 －119． 01 38． 75 64． 55 53． 34 48． 02
1 ∶ 4 500 －27． 44 31． 76 52． 58 54． 59 41． 73
1 ∶ 8 250 21． 46 8． 42 51． 07 49． 57 41． 04
1 ∶ 16 125 15． 44 －76． 62 46． 31 19． 18 6． 17
1 ∶ 32 62． 5 2． 44 －85． 65 14． 65 －44． 02 －72． 60
2． 3． 5 石榴皮不同极性提取物对大肠杆菌的抑菌
率 石榴皮不同极性提取部位对大肠杆菌的生长无
抑制作用;氯仿、乙酸乙酯提取物对大肠杆菌生物膜
的形成有不同程度的抑制作用，其中氯仿提取物浓
度为 250 ～ 500 μg /mL时，抑制率＞50%，见表 3、4。
2． 3． 6 石榴皮不同极性提取物对受试菌的 MIC
依据 MIC的判断标准，确定石榴皮正丁醇提取物抑
制变异链球菌生长的MIC为 125 μg /mL，乙酸乙酯、
正丁醇、乙醇、水提取物抑制变异链球菌生物膜形成
的 MIC分别为 500、125μ、250、250 μg /mL。石榴皮
氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物抑制大肠杆菌生物膜
形成的 MIC分别为 250、500、125 μg /mL。
表 3 石榴皮不同极性提取部位抑制大肠杆菌
生长的抑制率 /%
稀释度 浓度 /(μg /mL) 氯仿 乙酸乙酯 正丁醇 乙醇 水
1 ∶ 2 1 000 －70． 21 －82． 91 －220． 91 －269． 15 －196． 37
1 ∶ 4 500 －79． 71 －162． 52 －163． 24 －281． 54 －202． 25
1 ∶ 8 250 －76． 12 －102． 41 －53． 52 －161． 43 －229． 63
1 ∶ 16 125 －35． 53 －79． 24 －60． 97 －95． 71 －107． 44
1 ∶ 32 62． 5 －60． 01 －57． 55 －63． 15 －72． 58 －62． 96
表 4 石榴皮不同极性提取部位抑制大肠杆菌生物
膜形成的抑制率 /%
稀释度 浓度 /(μg /mL) 氯仿 乙酸乙酯 正丁醇 乙醇 水
1 ∶ 2 1000 －2． 97 46． 05 －39． 21 －44． 37 －33． 36
1 ∶ 4 500 74． 83 36． 87 －26． 89 －42． 64 －25． 81
1 ∶ 8 250 69． 70 28． 51 34． 44 －7． 03 15． 48
1 ∶ 16 125 3． 59 10． 11 29． 12 17． 57 16． 73
1 ∶ 32 62． 5 5． 37 19． 81 17． 78 30． 51 15． 19
3 讨论
细菌生物膜(Biofilm)是细菌被包裹在自身分
泌的多聚物中形成具高度分化结构的特殊细胞群体
结构，是细菌的一种保护性生长模式，80%的细菌性
感染与其有关［5］，主要有由革兰阳性球菌导致的龋
齿、革兰阴性厌氧性口腔细菌导致的牙菌斑、肠道细
菌引起的胆囊感染及大肠杆菌和其他革兰阴性菌引
起细菌性前列腺炎等［6］。本研究依据石榴皮对口
腔和消化道的抗菌消炎功效选取口腔主要的致龋菌
变异链球菌和肠道细菌大肠杆菌，考察石榴皮不同
极性部位对供试菌的抑菌作用，为其成药性研究提
供药效依据。
本研究经化学鉴别预试验检出石榴皮中含糖、
苷类、酚类鞣质、黄酮类、有机酸、氨基酸和蛋白质等
成分。石榴皮不同极性提取物进行抑菌筛选时，发
现有些提取物有促进细菌生长的趋势，可能其所含
糖类、蛋白质、氨基酸等成分为细菌生长提供了营养
成分。石榴皮的不同极性提取物对变异链球菌和大
肠杆菌的生长均无明显抑制作用，而对二者生物膜
的形成均有不同程度的抑制作用，石榴皮正丁醇、乙
醇和水提取物对变异链球菌生物膜形成有明显抑制
作用，氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物对大肠杆菌生
物膜的形成有明显的抑制作用。石榴皮中含有能有
效抑制供试菌生物膜形成的活性成分，石榴皮的酚
类和黄酮类成分具有明显的抗菌活性［7］。陈雪珊
等［8］研究表明，以石榴皮的提取液、浓缩液、冻干粉
(下转 148 页)
441 新 疆 医 科 大 学 学 报 第 39 卷
表 3 25℃与 37℃时鞣花酸的表观油水分配系数(Papp) (-x±s，n=5)
pH
25℃
m /μg m0 /μg -x ± s lgPapp ＲSD%
37℃
m /μg m0 /μg -x ± s lgPapp ＲSD%
1． 2 1． 2×103 0． 76 6． 34×10－4±0． 00 －3． 2 1． 34 1． 2×103 0． 76 6． 34×10－4±0． 00 －3． 2 1． 34
2． 5 1． 3×103 5． 66 4． 37×10－3±0． 00 －2． 36 1． 66 1． 3×103 5． 66 4． 37×10－3±0． 00 －2． 36 1． 66
5 1． 4×103 4． 45 3． 19×10－3±0． 01 －2． 49 3． 16 1． 4×103 4． 45 3． 19×10－3±0． 01 －2． 49 3． 16
5． 8 1． 3×103 4． 08 3． 15×10－3±0． 00 －2． 5 2． 7 1． 3×103 4． 08 3． 15×10－3±0． 00 －2． 5 2． 7
6． 8 1． 3×103 4． 3 3． 32×10－3±0． 00 －2． 48 2． 49 1． 3×103 4． 3 3． 32×10－3±0． 00 －2． 48 2． 49
7． 4 1． 1×103 4． 68 4． 27×10－3±0． 02 －2． 37 4． 69 1． 1×103 4． 68 4． 27×10－3±0． 02 －2． 37 4． 69
7． 8－8． 0 1． 3×103 7． 86 6． 08×10－3±0． 01 －2． 22 2． 14 1． 3×103 7． 86 6． 08×10－3±0． 01 －2． 22 2． 14
鞣花酸平衡溶解度实验结果表明，室温 25℃和
体温 37℃条件下鞣花酸平衡溶解度基本无变化，说
明温度对鞣花酸的溶解度基本无影响。不同 pH 值
条件下，在酸性溶液中鞣花酸平衡溶解度随 pH值的
升高而增大，在中性及弱碱性溶液中其溶解度骤然降
低，表明在酸性溶液中随着 pH值增高鞣花酸的溶解
性增加;在中性及弱碱性条件下，鞣花酸的溶解度很
小，是因为鞣花酸作为一种难溶性药物，虽然能够在
碱性溶液中溶解，但在碱性溶液中不稳定极易析出。
药物只有透过细胞膜的类脂成分，才能被机体
吸收，故药物的亲脂性的大小会直接影响药物的吸
收程度和速度，以及影响药物的膜渗透性。而药物
的脂溶性不仅与药物的分子结构有关，也取决于其
所处的 pH条件下的分子型比例，分子型比例越大，
亲脂性越强［8］。常以 lgPapp值表示油水分配系数，
一般而言，具有较大油水分配系数的药物更容易穿
透细胞膜转运和吸收，亲脂性化合物的 lgPapp ＞0，数
值愈大亲脂性愈强;lgPapp ＜0 的化合物属亲水性，数
值愈小亲水性愈强。本实验在考察鞣花酸油水分配
系数时，对比室温 25℃和体温 37℃条件下鞣花酸表
观油水分配系数基本无差别，说明温度对鞣花酸的
表观油水分配系数无影响。在 pH 值 1． 2 ～ 8． 0 时，
鞣花酸的 Papp值均＜－2，且无明显规律。说明鞣花酸
不易透过生物膜，其在胃肠道的吸收性较差，可能与
鞣花酸本身的分子型有关，推测其在体内吸收的透
膜方式不仅是简单地被动转运，还可能有主动转运
或促进扩散，有待进一步研究。
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［收稿日期:2015-10-23］
(本文编辑 施洋
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)
(上接 144 页)
和软膏对变异链球菌和大肠杆菌乙醇有明显的抑菌
作用，但未确定有效成分类别。因此，对其抑菌成
分、机理以及对其他细菌的影响还有待于更进一步
的研究。
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［收稿日期:2015-10-23］
(本文编辑 施洋)
841 新 疆 医 科 大 学 学 报 第 39 卷