全 文 ：西北大学学报(自然科学版)
2006年 10月 , 第 36卷第 5期 , O c.t , 2006, Vo.l 36, No. 5
Journal o fNo rthwe st University (Na tural Science Edition)
　　收稿日期:2004-01-10
　　基金项目:国家自然科学基金资助项目(30370697)
　　作者简介:王瑛华(1979— ), 女 ,陕西商洛人 , 西北大学硕士生 ,从事植物细胞工程研究。
生命科学与医药学
鹰嘴紫云英抗甲硫氨酸变异系离体筛选及鉴定
王瑛华 1, 3 , 侯岁稳2 , 贾敬芬 1
(1. 西北大学 生命科学学院 ,陕西 西安　710069;2.兰州大学 生命科学学院 , 甘肃 兰州　730000;3.肇庆学院 生物学系 ,
广东 肇庆　526061)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　　　
摘要:目的　离体筛选鹰嘴紫云英(Astraga lus cicer L. )抗甲硫氨酸变异系。方法　通过 N aN 3诱变
处理鹰嘴紫云英 (Astragalus cicer L. )的愈伤组织来筛选获得抗甲硫氨酸变异细胞系。结果　获得
了抗 100 mmo l /L甲硫氨酸变异细胞系 ,并分化成再生植株。结论　该变异系对甲硫氨酸具有一定
的抗性 ,并对乙硫氨酸具有交叉抗性 。
关　键　词:鹰嘴紫云英;甲硫氨酸;变异系
中图分类号:Q944. 6　　文献标识码:A　　文章编号:1000-274Ⅹ (2006)05-0773-04
　　鹰嘴紫云英 (Astraga lus cicer L. )是豆科黄芪属
的多年生牧草 ,具有较强的耐旱能力。由于其具有
横走的根茎 ,利用寿命长 ,且耐牧[ 1] ,粗蛋白含量也
较高[ 2] ,是一种营养丰富 、草质和适口性都极好的
饲料作物[ 3] 。然而 ,尽管鹰嘴紫云英蛋白质含量丰
富 ,但与其他豆科植物一样缺乏必需的含硫氨基酸 ,
限制了动物对总氨基酸的吸收 [ 4] 。因此 ,培育出能
过量积累甲硫氨酸的鹰嘴紫云英品种可以大大改良
牧草的营养品质 ,对农牧业的发展具有重要价值 。
植物细胞抗氨基酸及其类似物突变体的离体筛选为
此提供了一条可行的技术路线 。在以提高植物甲硫
氨酸含量为目的的突变体筛选工作中 ,以甲硫氨酸
为筛选剂已在红豆草 [ 4] 、苜蓿[ 5] 、草木樨状黄芪 [ 6]
等植物中得到抗性细胞系 。用甲硫氨酸的类似物乙
硫氨酸为筛选剂也曾获得沙打旺[ 7] 、苜蓿 [ 8] 抗性
系 。迄今 ,未见到有关鹰嘴紫云英抗性突变体筛选
的报道 。本文即以鹰嘴紫云英为材料 ,以甲硫氨酸
为筛选剂 ,从经诱变的愈伤组织中筛选到了能过量
积累甲硫氨酸的变异细胞系 ,并分化成再生植株。
1　材料与方法
1. 1　植物材料和愈伤组织的诱导
供试植物鹰嘴紫云英 (Astragalus cicer L. )种子
来自中国科学院宁夏沙坡头沙漠植物实验站 。
将种子用常规方法灭菌后接种在不加外源生长
调节物的 MS培养基 [ 9]上 ,在 25℃左右散射光下诱
发无菌苗 。取 15 d龄无菌苗的下胚轴切成 3mm大
小的切段 ,放在附加 200mg /L水解酪蛋白 (CH)、2
mg /L 2, 4-二氯苯氧乙酸 (2 , 4-D), 0.5 mg /L 6-苄氨
基嘌呤 (6-BA), 0.5 mg /L 6-糠基氨基嘌呤 (KT) ,
0.7%琼脂的 MS固体培养基上 ,在 25 ±2℃的暗培
养条件下诱导愈伤组织。在同样培养基上继代培
养 ,每 3周转代一次 。
1. 2　诱变处理与抗甲硫氨酸变异系的筛选
取继代培养 3代并处于旺盛增殖期的愈伤组
织 ,分成大小相近的小块 ,在含 1. 5 mmo l /L叠氮化
钠(N aN3)的液体继代培养基中诱变处理 2 h。用无
菌水洗净后 ,转入正常继代培养基上恢复培养 4周。
将经 NaN3处理并恢复生长的愈伤组织转移到
含 100 mmo l /L甲硫氨酸(对正常愈伤组织为致死剂
量)的 MS+3%蔗糖 +500mg /L CH +2 mg /L 2, 4-D
+0.5mg /L 6-BA +0.5mg /L KT +0.7%琼脂的固体
培养基 (pH6.0 ～ 6.2)上 ,在 25℃左右弱光条件下进
行选择培养。大约 60 d后 ,从接种的原愈伤组织上
挑取存活并增殖的小愈伤组织 ,转移到不含甲硫氨酸
的上述培养基上继代培养 2代 ,使其扩增。然后 ,再
转移到含 100mmo l /L甲硫氨酸的同样培养基上进行
DOI牶牨牥牣牨牰牨牭牪牤j牣cnki牣xdxbzr牣牪牥牥牰牣牥牭牣牥牪牨
连续 6代的继代培养和筛选 ,每 3周转代一次。获得
的甲硫氨酸抗性系转入无甲硫氨酸胁迫的培养基上
稳定培养 6代后进行抗性生长试验和生理生化分析。
对照 (野生型)为不经诱变和筛选的继代培养的愈伤
组织 。将变异系和对照系的愈伤组织分别转到 MS+
3%蔗糖 +200mg /L CH +0.5mg /L 6-BA+0.5mg /L
KT+10 ～ 30mg /L AgNO 3 +0.7%琼脂的固体培养基
上诱导苗的分化 。植株分化的培养条件为 25±2℃,
每日光照 12 h,光强度为 1 200 lx。
1. 3　抗性系对甲硫氨酸及乙硫氨酸的抗性生长试
验
　　将筛选得到的抗甲硫氨酸变异细胞系愈伤组织
及其对照分别转入含有 0, 20, 40, 60 , 80, 100, 120
mmo l /L甲硫氨酸的 MS培养基上 , 3周后测定其相
对增长率 ,每个处理设 3个重复 。
将抗甲硫氨酸变异系愈伤组织及其对照系分别
转入含有 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol /L乙硫氨
酸的 MS培养基上 , 3周后测定其相对增长率 ,每个
处理设 3个重复 。
愈伤组织相对增长率的计算方法如下:
相对增长率 =处理条件下愈伤组织增长率对照愈伤组织增长率 ×
100%。
1. 4　游离氨基酸分析
游离氨基酸按 Barnett方法[ 10] ,用 80%乙醇提取
游离氨基酸。用 121MB型氨基酸分析仪测定。氨基酸
分析在西北农林科技大学分析测试中心进行。
1. 5　抗性变异细胞系可溶性蛋白 SDS-PAGE分析
参照萨姆布鲁克 J等的方法[ 11] 。电泳浓缩胶为
3%,分离胶为 12%。考马斯亮蓝 G-250染色 [ 12] 。经
脱色后的凝胶在 C s-930薄层扫描仪上扫描。标准蛋
白为:兔磷酸化酶 B(94 000)、牛血清蛋白(66 200)、
兔肌动蛋白(43 000)、牛碳酸酐酶(31 000)、胰蛋白酶
抑制剂(20 100)、鸡蛋清溶菌酶 (14 400)。
1. 6　抗性变异细胞系同工酶酶谱分析
电泳参照何忠效等的方法[ 13] 。过氧化物酶同
工酶电泳浓缩胶为 3%,分离胶为 7%。细胞色素氧
化酶同工酶电泳浓缩胶为 3%,分离胶为 10%。染
色后用 C s-930薄层扫描仪进行扫描 。
2　结果和讨论
2. 1　抗甲硫氨酸变异系愈伤组织的筛选及苗的分化
鹰嘴紫云英下胚轴正常愈伤组织经不同浓度
N aN3 溶液处理后的生长试验确定 , 1. 5 mmo l /L
NaN 3处理 2 h ,绝大部分愈伤组织不能继续生长 ,约
有 1 /3存活下来 ,在恢复生长中增殖 ,故确定依此剂
量来作为诱变剂量 。
甲硫氨酸对正常鹰嘴紫云英愈伤组织的生长是
有不良影响的 ,在高于 20 mmo l /L时 ,对生长就显示
抑制效应 。在培养基中含 100 mmo l /L甲硫氨酸时 ,
对照系愈伤组织几乎完全停止生长 ,在二次继代培
养中逐渐变褐死亡。经 N aN 3诱变处理后的愈伤组
织在恢复生长后转到含 100 mmo l /L甲硫氨酸的胁
迫培养基上 ,经过大约 60 d培养 ,仅在极个别愈伤
组织表面出现新生的小愈伤组织 ,其色泽呈淡绿色。
而大多数愈伤组织逐渐变褐。从所接种的 100多块
愈伤组织中选择到了能耐 100 mmo l /L甲硫氨酸的
2块小愈伤组织。在继代培养和连续筛选中获得了
能耐受 100 mmo l /L甲硫氨酸的抗性系 。
抗性系愈伤组织在转入分化培养基后 ,在每日
12 h, 1 200 lx光照条件下培养 25 d后 ,分化出纤弱
的再生苗 ,分化频率较低 ,约为 13%。对照系的再
生能力明显比抗性系强 ,在分化培养基上分化成茁
壮的再生植株 ,分化频率约为 72%。当这些分化苗
在 MS培养基上形成发达的根系后 ,移栽到土壤中
很容易成活。
2. 2　甲硫氨酸及乙硫氨酸的抗性生长试验结果分
析
　　抗性变异细胞系在脱离选择压力 6个月后 ,对
甲硫氨酸仍保持较强的抗性 。如图 1所示 ,当甲硫
氨酸浓度逐渐增大时 ,抗性愈伤组织的相对增长率
呈下降趋势 ,但始终高于对照系 。如在含 50 mmo l /
L甲硫氨酸的培养基上 ,抗性系愈伤组织的相对增
长率是对照系的 2.28倍;在含有全致死剂量 (100
mmo l /L)的培养基上 ,抗性系的相对增长率是对照
系的 11.9倍。
图 1　抗性系与对照系对甲硫氨酸的抗性
F ig. 1　Effect of me th ionine on g row th of resistan t ca llus and the
contro l
抗性变异细胞系对甲硫氨酸的类似物 ,即乙硫
氨酸具有交叉抗性。从图 2可以看出 ,随着培养基
中乙硫氨酸浓度的上升 ,无论是对照系还是抗性细
—774— 西北大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　第 36卷
胞系 ,其生长均受到抑制 ,但抗性系所受到的抑制明
显小于对照系。
在抗甲硫氨酸变异细胞系中由于天冬族氨基酸
生物合成的关键反馈调节酶被抑制 ,使高浓度甲硫
氨酸对该途径生物合成酶活性的抑制减弱或丧失 。
抗性细胞可以利用该途径合成所有的天冬族氨基
酸 ,这样抗性系就能在高浓度甲硫氨酸环境中生
存 [ 4, 5] 。乙硫氨酸是甲硫氨酸的类似物 ,它可以代
替甲硫氨酸掺入蛋白质造成低活性蛋白或无活性蛋
白 ,以及掺入 SAM(S-腺苷甲硫氨酸 )中降低细胞内
SAM库水平 。在本实验中 ,抗性系由于对反馈抑制
不敏感 ,过量合成甲硫氨酸 ,过量的甲硫氨酸与乙硫
氨酸竞争掺入蛋白质和 SAM 中 ,相当于 “冲淡”了
乙硫氨酸的浓度 ,从而减低其对细胞的伤害 。因此
产生了对乙硫氨酸的交叉抗性 [ 14] 。
图 2　抗性系与对照系对乙硫氨酸的抗性
F ig. 2　Effect o f e th ionine on g row th of re sistant ca llu s and the
contro l
2. 3　抗性变异细胞系游离氨基酸分析
游离氨基酸分析表明 (见表 1),抗性系与对照
系的游离氨基酸总量没有明显差别 ,但天冬氨酸族
的几种氨基酸的含量均有显著的提高 。在抗性系
中 , 甲硫氨酸含量是对照系的 5.65倍 , 增加了
465.19%;赖氨酸 、异亮氨酸 、天冬氨酸 、谷氨酸含量
分别为对照系的 7.98倍 、6.88倍 、1.49倍和 1.41
倍 。另外 ,半胱氨酸含量也增加了 30.77倍 ,远远超
过了对照系的水平。
在植物体中 ,天冬族氨基酸 ———甲硫氨酸 、赖氨
酸 、苏氨酸 、异亮氨酸 ,都是由天冬氨酸通过共同的
分支途径合成的 ,该途径主要受最终产物的反馈调
节 [ 15] 。在本实验中通过对抗性细胞系游离氨基酸
含量分析表明 ,在鹰嘴紫云英抗甲硫氨酸变异系中 ,
可能由于代谢分支途径上的反馈调节酶二氢二甲基
吡啶(DS)、高丝氨酸脱氢酶 (HSDH)或高丝氨酸激
酶 (HSK)的结构或活性发生变化 ,使更多的天冬氨
酸进入合成途径用于赖氨酸 、甲硫氨酸 、异亮氨酸的
合成 ,导致抗性系中游离甲硫氨酸过量积累 。
表 1　游离氨基酸的含量
Tab. 1　Contents of free am ino acids /mg 100 g-1 F.W t
氨基酸 对照系愈伤组织 抗性系愈伤组织
天冬氨酸(Asp) 6. 104 9. 153
苏氨酸(Th) 0. 201 0. 277
丝氨酸(Se r) 57. 260 7. 225
谷氨酸(G lu) 7. 170 10. 110
脯氨酸(P ro) 1. 950 7. 916
甘氨酸(G ly) 0. 457 5. 162
丙氨酸(A la) 2. 391 6. 125
半胱氨酸(Cy r) 0. 260 8. 264
缬氨酸(Va l) 0. 769 8. 055
甲硫氨酸(M et) 1. 106 6. 251
异亮氨酸( Ile) 0. 922 6. 344
亮氨酸(Leu) 0. 315 -
酪氨酸(Ty r) 1. 696 11. 060
苯丙氨酸(Phe) 13. 290 10. 390
赖氨酸(Lys) 0. 315 2. 512
组氨酸(H is) 7. 730 2. 684
精氨酸(A rg) 2. 920 2. 994
总游离氨基酸 104. 856 104. 522
　　注:“ -”表示痕量
2. 4　抗性系可溶性蛋白 SDS-PAGE和同工酶图谱
分析
　　从 SDS-PAGE电泳图谱 (见图 3)上可以看出 ,
抗性系及其对照系的可溶性蛋白有明显差异 ,抗性
系产生了对照系所没有的 1条新多肽 P1 ,同时比对
照系缺少了 3条多肽 ,即 P2 , P3 , P4。
图 3　愈伤组织可溶性蛋白 SDS-PAGE扫描图谱
F ig. 3　 SDS-PAGE e lectropho resis scanning cu rves of so lub le
pro teins of calluses
a对照系　b抗性系
从过氧化物酶同工酶图谱 (见图 4)上可以看
出 ,抗性系比对照系消失了一条多肽 E1。
从细胞色素氧化酶同工酶图谱(见图 5)上可以
看出 ,对照系中的一条酶带(E2)在抗性系中消失 。
—775—第 5期　　　　　　　　　　　王瑛华等:鹰嘴紫云英抗甲硫氨酸变异系离体筛选及鉴定
图 4　愈伤组织过氧化物酶同工酶电泳扫描图谱
F ig. 4　 Pe rox idase isozym e e le ctropho resis scanning curves o f
ca lluses
图 5　愈伤组织细胞色素氧化酶同工酶电泳扫描图谱
F ig. 5　Cy tochrom e ox idase isozym e elec trophore sis scanning
curves o f ca lluse s
a对照系　b抗性系
可溶性蛋白 SDS-PAGE图谱 、过氧化物酶同工
酶图谱和细胞色素氧化酶同工酶图谱的变化表明 ,
该变异系的基因或其表达调控已发生了某些变化 ,
并产生了变化的基因产物 。
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(编　辑　徐象平)
In v itro selection and physiological and b iochem ical analyses of
methionine-resistant variant inAstragalus cicer L.
WANG Y ing-hua1, 3 , HOU Sui-wen2 , JIA Jing-fen1
(1. Institu te o f Life Science, Northw est Unive rsity, X i′an 710069, China;2. Institu te of L ife Science, Lanzhou Un ive rsity, Lanzhou
730000, China;3. Depa rtm en t o f B iology, Zhaoqing U iversity, Zhaoqing 526061, Ch ina)
Abstract:Ami 　 In vitro se lecting me th ionine varian t in Astragalus cicer L. , To improve the con tent ofme th ionine
in Astraga lus cicer L.Methods　Methionine as se lectu re agen t, using one-step po sitive selection iso lated the varian t
ce ll line from the ca lluse s o fAstraga lus cicer L. treated by NaN3. Results　The variant ce ll line resistan t to 100
mmo l /L me th ionine w as se lected. P lantsw ere regenerated from i.t Conclusion　The variant ce ll line w as resistan t
tome th ionine and e th ionie.
Key words:Astragalus cicer L;methionine;resistant variant
—776— 西北大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　第 36卷