全 文 ：第 36 卷 第 2期
2 003 年 4 月
实 验 生 物 学 报 Vo l. 3 6 , N o . 2
cA
t a B IOI 馆 ia e E x P e ir me n t a lis iS n l ca A p ir l 200 3
草木棵状黄茂抗甲硫氨酸变异系的离体筛选及鉴定 `
陈 刚 贾敬芬 “ 都建国
(西北大学生物技术省级重点实验室 , 西安 7 10 06 9)
摘要 通过组织培养体 系进行了草木裤状黄茂 ( A st ar ga lu 、 。 iel ol ot i故节 aP n . )抗 甲硫氨酸 变异
系的筛选 。 无菌苗幼茎切段诱导的愈伤组织 经 N aN 3 诱变后 , 经过筛选获得 了杭 14 ~
l几 甲硫
氨酸的变异细胞系 , 并分化出大量植株 。 再生植株已经在大田中开花结实 。 经分析表明 : 杭性细胞
系脱离选择压 6 个月后 ,放在含 15 mmo l几 甲硫氨酸的培养基上培养 25 天后 , 其相对增长率是对
照的 10 . 2 倍 。 杭性 系再生植株游离甲硫氨酸是对照的 2 . 12 倍 , 并且天冬族氨基酸都有明显增加 。
DS S P A G E 及过氧化物酶 同工酶分析表明 : 在蛋 白质及同工酶酶谱上杭性 系再生植株均 出现与对
照不 同的差异 。
关键词 : 草木梅状黄蔑 甲硫氨酸 变异系 鉴定
在豆科植物中第一限制性氨基酸是甲硫氨酸
(M e t ) 〔` , 2」,动物机体利用这些蛋白质时以含量最少
的一种必需氨基酸为基点 ,按比例吸收其它各种氨基
酸来组成机体蛋白质 , 因此只要有一种限制性必需氨
基酸含量不足 ,就会限制对总氨基酸的吸收 3j[ 。 因而
培育能够较多积累甲硫氨酸的豆科牧草可 以大大改
良牧草营养品质 。 有关豆科牧草甲硫氨酸抗性系离
体筛选曾有报道获得红豆草 [’」和首蓓闭抗性细胞系 。
用甲硫氨酸的类似物 一 乙硫氨酸为筛选剂也曾获得
沙打旺图 、首楷困抗性系。 这些研究都表明所获得变
异系在愈伤组织水平或再生植株水平均可过量合成
甲硫 氨酸。 草木探状黄 蔑 ( Z此艺八 2召双 lus m e l i及龙诚龙 ,
凡 U. )是豆科黄蔑属的多年生牧草 ,具有植株高大 ,根
深耐旱的特点 , 可以作为饲料使用 ,也是较好的水土
保持 、土壤改良及绿肥植物 ,但其不足之处在于 甲硫
氨酸含量低 。 因此 ,改 良草木挥状黄茂植物体内的甲
硫氨酸含量 ,培育出优质的牧草是育种 的一个 目标 。
植物体细胞抗甲硫氨酸突变体的筛选为提高甲硫氨
酸含量提供了一条可行的技术途径 。 我们已经建立
了该种植物的高频离体再生体系川 ,并且发现草木择
状黄茂具有离体培养再生能力极强 , 出苗率高的特
点。 这就为离体筛选突变体打下 了实验基础 。 关于
草木挥状黄茂抗甲硫氨酸及其类似物的变异体筛选
研究至今尚未见报道 。
草木挥状黄蔑 ( A s t ar 邵 z u ; 。 Ze zi zot o i汰孔, p a l l . )
的种子来 自中国科学院宁夏沙坡头沙漠植物试验
站 。 种子经常规方法灭菌后 , 接种在不加激素的
M s 培养基圈上 ,萌发无菌苗。 选取 10 一 15 天龄 的
无菌籽苗 , 去掉叶 ,把茎切成 3 一 5~ 的切段
,放在
附加 50 0 m g L/ 水解酪蛋 白 ( C H ) , Zm g几一 2 , 4一D 和
0
.
s gm 八
J
6 B A 的 M S 培养基上 ,在 25 土 2℃ 条件下
进行暗培养 ,诱导愈伤组织 。 并在同样培养基上进
行继代培养 ,每两周继代培养一次 。
1
.
2 正常愈伤组织对 甲硫氨酸的敏感性试验
未经诱变处理的正常愈伤组织分别转人含有
O
、
2
、
4
、
6
、
8
、
1 0
、
12
、
14
、
2 0 n , m o lL/ 甲硫氨酸 (M e t )
的上述 M S 培养基上 , 在 25 士 2℃条件下 培养 。 25
天后统计存活率 , 以确定筛选的全致死剂量 。
1
.
3 叠氮化钠诱变剂量的确定及诱变处理
用 N 匆 H p仇 一 柠檬酸缓 冲液配制 O 、 0 . 02 % 、
0
.
04 %
、
0
.
06 % 的 pH 4 . 2 的叠氮化钠 ( N aN 3 )溶液 ,
将旺盛生长的草木棵状黄蔑松软愈伤组织分别浸泡
在上述溶液中。 2 . 5 h 后取 出 。 用无菌水冲洗 5 次 ,
每次间隔 s m in 。 接种在上述愈伤组织培养基上 , 生
长 25 天后测定生长量 ,以确定半致死剂量 。 然后用
半致死剂量 N aNL : 溶液处理大量的旺盛生长 的愈伤
组织 。 操作方法同上 。 用经诱变后的愈伤组织作为
1 材料与方法
1
.
1 愈伤组织的诱导
本文 20 02 年 9 月 2 日收到 。 20 ()2 年 12 月 3 日接受 。
` 国家自然科学基金 ( N o . 30( ) 7 036 6) 和陕西省教育厅重
点科研项目 ( N o . 02) 以拓 )资助 。
` 通讯联系人
2期 草木择状黄茂抗甲硫氨酸变异系的离体筛选及鉴定
筛选的起始材料 。 诱变后的愈伤组织在正常培养基
上恢复生长 0 3天后 ,再转人全致死剂量甲硫氨酸培
养基上进行筛选培养 。
1
.
4 抗性细胞系的筛选和植株再生
将诱变后生长 旺盛的愈伤组织 ,分割成大小均
匀的 3~ 左右的小块
,接种到附加 14
~
1几 M et
的上述 M S 培养基上 。 60 天后挑选存活的愈伤组
织转人不含甲硫氨酸的培养基上 ,继代培养 3 个月 。
再转人含有全致死剂量甲硫氨酸的培养基上 , 继代
培养 3 个月 ,每月转接一次 。 变异系在无选择压力
下连续继代培养 3 个月后诱导植株再生并进行生理
生化分析 。 苗分 化培 养基为 M S + 3 % 蔗糖 +
5 0Om g几 C H + 0 . Z n l g L/ K T + l m g L/ 6 B A + 0 . 7 %
琼脂 ;生根培养基为 : 大量元素减半的不加生长调节
物的 M S 培养基 。 植株分化 的培养条件为 25 士
2℃ ,每日光照 12 h ,光强度为 2 00 L ux 。 当再生苗
形成发达的根系后进行移栽 。
1
.
5 抗性系对甲硫氨酸的抗性测定
将筛选得到的抗甲硫氨酸变异细胞系以及变异
系再生植株茎切段诱导的次级愈伤组织 (其方法同
一 )转人含有 0 、 5 、 10 、 1 5 、 2 0
morn
l几 甲硫氨酸的 M S
培养基上 , 25 天后测定相对增长率 。 每个处理设 3
个重复 。 对照愈伤组织做同样处理 。 愈伤组织相对
增长率的计算方法如下 :
电泳参照何忠效等的方法〔’ `〕。 过氧化物酶同
工酶电泳分离胶为 7 % ,浓缩胶为 3 % 。 醋酶电泳分
离胶为 10 % ,浓缩胶为 3 % 。 染色后用 sC 一 930 薄层
扫描仪进行扫描 。
2
.
1
结果和讨论
正常愈伤组织对不同浓度 甲硫氨酸的敏感性
.一U一8一4
、一几`ó一0
气孟
8
卜`八O
L气山
4
nU八08ǎ匕通二,“
ǎ求à并妈炸矫暇半倾
甲硫氨酸浓度 ( m m ol / )L
相对增长率 = 处理条件下愈伤组织增长圣对照愈伤组织增长率 X 10 0 %
1
.
6 抗性系对 乙硫氨酸的抗性试验
将抗甲硫氨酸变异系愈伤组织及其对照分别转
人含有 0 、 0 . 6 、 0 . 8 、 l . o
morn
lL/ 乙硫氨酸 的 M S 培
养基上 , 25 天后测定其相对增长率 。 每个处理设 3
个重复 。
1
.
7 游离氨基酸分析
游离氨基酸按 &门 e t t 方法 9j[ ,用 80 % 乙醇提取
游离氨基酸 。 用 121 M 13型氨基酸分析仪测定 。 氨基
酸分析在西北农林科技大学分析测试中心进行 。
1
.
8 再生植株可溶性蛋 白 SDS 一 P A G E 分析
参照萨姆布鲁克 J 等的方法 [`“ 〕。 电泳浓缩胶
为 3% ,分离胶为 12 % 。 考马斯亮蓝 G 一 2 50 染色液
染色 。 经脱色后 的凝胶在 sC 一 9 30 薄层扫描仪上扫
描。 标准蛋白为 : 兔磷酸化酶 B ( 9 7 40 ) 、 牛血清白
蛋白 ( 66 2 0 0 ) 、 兔激 动蛋白 ( 4 3 0 0 0 ) 、 牛 磷酸配酶
( 3 100 0 )
、胰蛋 白酶抑制剂 ( 2 0 10 0 ) 、 鸡蛋清溶菌酶
( 14 4 00 、 。
1
.
9 再生植株过氧化物酶同工酶酶谱分析
图 1 不同浓度甲硫氨酸对草木择状黄蔑正常愈伤组织
生长的影响
F ig
.
1 E f n叉 t Of d i【fe er n t c o n c e n lt , tiosn fO me t h io n i n e on
s u口 i耐 f卿 u e n c y of A . 称昭王i王o ot 记 se 阅 111, 污
从图 1 中可以看出 ,随着培养基中 M et 浓度的
增加 ,草木择状黄茂愈伤组织生长受到的抑制越严
重 。 当 M e t 浓 度 为 4m m o l几 时 , 存活 率 只 有
40
.
1%
,其半致死剂量大约在 3 . 5
~
1几 。 当 M et
浓度达到 14
~
l几 时 ,愈伤组织的生长被完全抑
制 , 该浓度为全致死剂量 。
2
.
2 N a N3诱变剂且的确定
N aN
: 是一种动植物的呼吸抑制剂 , 可使复制
中的 D N A 碱基发生替换 ,从而导致突变体的发生 。
N a N 3 被认为是 目前诱变率高而安全的化学诱变
剂 [`2] 。 诱变剂量较高时 , 会产生严重 的损伤 , 失去
选择机会 ;剂量较低 ,则不会产生明显的差异 。 诱变
剂剂量的选择常用半致死以上的剂量仁’ 3〕 ,通过固定
诱变时间改变诱变剂浓度或固定一个合适浓度来改
变诱变时间可达到这一 目的 [’] 。 为了能在短时间
内用 N a N 3 均匀处理大量细胞 , 本实验采用 了固定
处理时间 ( 2 . s h ) , 用一系列浓度 N aN : 处理的方
法 。 本实验以对照 (即 N aN 3 为 O时 )的增长率作为
10 %来计算不同浓度 N aN 3 条件下的相对增长率 。
从表 1 可 以看出在所用 的系列浓度 N a N 3 作用后 ,
愈伤组织的生长均受到抑制 。 随着 N a N ; 浓度的增
加 ,抑制作用愈强 。 受 0 . 04 % N aN 3 处理的愈伤组
织相对增长率为 49 . 5 % 。 据此确定 该浓度为诱变
剂半致死剂量 。
陈 刚 贾敬芬 郝建国 36 卷
表 1 不同浓度 N酬3 处理对草木梅状黄苗愈伤组织生长的影响
T a b l e 1 E f n又 t of v ar ious N aN
3
con
忱nt ar it ons on ca l us gr 0 Wt h of A
. 川 `红切勿记此
N a N 3 浓度 ( % )
Cb n e印 t ar it on
o f N a N 飞( % )
处理愈伤组织重量 (克 )
W ie gh t of 司 l~b e fo er t r ea t n l e n t
生长后重量 (克 )
W
e
igh t Of ca l lus es
相对增长率 ( % )
R el a t i v e g r o w t h
a f t e r g
owr
in g
增长率 ( % )
G or 叭 h
ar t e ( % ) ar
t e ( % )
1069牲.l40 0 . 877 6
0
.
0 2 1
.
0 37 3
0
.
0 4 1
.
0 28 1
0
.
06 1
.
8 10 7
3
.
82 39
3
.
4 7 17
2
.
73 65
2
.
68 79
3 35
.
72
23 4
.
69
16 6
.
1 7
48
.
4 5
2
.
3 抗性细胞系的筛选和植株再生
经诱变的愈伤组织转到含有对正常细胞为全致
死剂量甲硫氨酸 (即 14
~
l几 )的培养基上培养 25
天后 ,绝大部分不能生长而死亡 ,仅在极少数愈伤组
织上长出小细胞团 。 在选择培养基上先后共接种了
3 7 56 块愈伤组织 ,经筛选培养后获得一个稳定的抗
性细胞系 。 在所用分化培养基上 , 抗性系愈伤组织
的分化苗的频率接近 10 % 。 抗性系平均每块愈伤
组织上有七 、八个芽 。 在生根培养基上 ,生根率均在
9 0 %左右 。 现在已经获得大量再生植株 。 经炼苗后
移栽土壤中成活 , 并且已经在田间开花结实 。 值得
提及的是经筛选获得抗性系愈伤组织可以长期保持
分化能力 。 本研究获得的抗性细胞系保存两年 , 分
化芽的能力仍然很强 。 同时 ,再生苗用切段繁殖也
极易再生新根和新苗 , 这就使变异系获得大量无性
后代成为可能 。
2
.
4 抗性系对甲硫氨酸的抗性生长试验
抗性细胞系在脱离选择压 6 个月 后对 M et 仍
有明显的抗性 (图 2 ) 。 抗性系再生植株田间生长第
二年的幼茎诱导的次级愈伤组织仍对 M et 有稳定
的抗性 。 如图 2 所示 , 随着 M et 浓度增加 , 抗性愈
伤组织及次级愈伤组织的生长均呈下降趋势 , 但抗
性系 的生长 量始终高于对照 。 如在含 5
~
l几
M et 的培养基上 ,初级愈伤组织的相对增长率是对
照的 2 . 5 3倍 , 次级愈伤组织的相对增长率是对照的
2
.
3 倍 ; 在含有 巧~
1几 M et 的培养基上 ,初级
愈伤组织的相对增长率是对照的 10 . 2 倍 , 次级愈伤
组织相对增长率是对照的 6 . 35 倍 。 在抗甲硫氨酸
细胞系中由于天冬族氨基酸生物合成途径反馈抑制
特性的改变或丧失 ,使高浓度甲硫氨酸对该途径生
物合成活性的抑制减弱或丧失 。 抗性细胞系可以利
用这个途径合成所有的天冬族氨基酸 , 其中也包括
甲硫氨酸 。 这可能是抗性细胞系能在含高浓度甲硫
氨酸的选择培养基上存活的原因〔’ , 4 〕。 正 因为这一
点 ,抗性系在甲硫氨酸浓度达致死剂量的培养基上
还能生长 。
2
.
5 抗性系对乙硫氨酸的交叉抗性
从图 3 可 以看出抗性细胞系对 M et 类似物 一乙
硫氨酸具有交叉抗性 。 随着培养基中乙硫氨酸浓度
的上升 ,无论是对照还是抗性细胞系生长均受到抑
制 。 抗性细胞系所受到的抑制明显小于对照 。 如在
0
.
2mmo l几 乙硫氨酸条件下 , 抗性系的相对增长率
是对照 1 . 53 倍 , 而在 0 . 6
~
l几 乙硫氨酸条件下
时 ,抗性系的相对增长率是对照 的 3 . 65 倍 ,在 0 . 8
~
l班 _ 乙硫氨酸条件下 ,对照系不再生长 ,而抗性
系仍有 24 . 09 % 的相对增长率 。 其原因可能在于 乙
硫氨酸作为甲硫氨酸的类似物可以代替甲硫氨酸掺
人到蛋白质中 , 形成低生物活性蛋白质或无生物活
今 日O芭 -
劝卜- 对照
- 仁卜- 初级 愈伤 组织
- 山尸 - 次级 愈伤 组织
一刊卜一 对 照
- ~口~ - 抗性 系
08ǎ岁à
0642哥聊平友男
` ~ ~ ~ 一三
洁才一不芯一下不一尼了一煞厂一魂
乙 硫氨酸浓度 (m r 旧u)L
图 3 抗性系与对照对乙硫氮酸的抗性
E f价叉 t o f e t h ion i en on gl ℃wt h of 吧 is tan t ca ll us an d
t h e C o n t r o l
国4020开事契友毕
5 10 15
甲 硫氨酸 浓度 (m m O UL )
图 2
Fig
.
2
甲硫氨酸对抗性系 、 次级愈伤组织生长的影响
E f价犯 t o f 们口e t h io n ien O n
, 义 o n d a r y cal lus an d t h e
多℃ w t h o f 溉 i s t a n t ca l lus ,
C o n t r 0 I
iF g
.
3
2期 草木挥状黄蔑抗甲硫氨酸变异系的离体筛选及鉴定
图 4 再生植株可溶性蛋白 S D导 P A GE 图谱
F i g
.
4 S】X弘 E P A Ga P t tr e nof so lu l b e Pr o t ei s no f l Pa n tl es t
a :对照 , b :抗性系 。
性蛋白质 ,从而对细胞产生毒性 #[] 。 抗 甲硫氨酸细
胞系由于反馈抑制特性的改变或丧失 , 可以过量合
成甲硫氨酸 ,过量合成的甲硫氨酸与乙硫氨酸竞争
掺人蛋白质 。 这就相当于 “ 冲淡 ” 了乙硫氨酸的浓
度 ,从而降低了乙硫氨酸对细胞的伤害 。 因此产生
对乙硫氨酸的交叉抗性#l[ } 。
: C K
,
b : R es is tan t li
n e
.
I O0 g D
.
W t )增加了 5 5 . 3 2 % 。
表 2 游离氨基酸含 t (mg 1/ 0 0 9 干重 )
aT b l
e Z C冶n et n st o f f n 沈 别旧 i n o a ic ds (mg / 100 gD
.
W t )
氨基酸
九 T I一n o a e id
愈伤组织
(二1ll u s
再生植株
R
e g e n e ar t e d P la n t
对照
C o n t or l
抗性系
R es ls t a n t
又寸只食
G 〕「l tor l
抗性系
R es is t a n t
S
C曰n兮ù6勺一74ù66
J1.
QCfL
à一、é
.…,矛,ùnC,石UJ件l,了O内JùIé哎」,.八乙一、ù
图 5 再生植株过氧化物酶同工酶电泳扫描图谱
F i g
.
5 P e r o x i《 Ia ` e i so z y m e el ce t n 甲h o n 污 15 s Ca l n ign c u 尸以污
of P la n t le st
a : 对照 , b : 抗性系 。 a : CK , b : R es is t a n t lin e .
2
.
6 游离氨基酸分析
游离氨基酸分析 (表 2) 表明 : 抗性系在愈伤组
织水平上 , 其甲硫氨酸是对照 的 1 . 37 倍 , 增加了
36
.
8 % ;异亮氨酸是对照的 2 . 75 倍 ,赖氨酸 、天冬氨
酸 、谷氨酸分别是对照 的 10 . 73 , 2 . 34 和 1 . 36 倍 。
而在再生植株水平上 , 抗性系甲硫氨酸是对照 的
2
.
12 倍 , 增加了一倍多 。 天冬族的其它几种氨基酸
也比对照有明显增加 。 从表 2 还可以看出 ,抗性系
游离氨基酸总量无论在愈伤组织还是再生植株都比
对照有大幅度增加 , 特别是在再生植株水平上 ,其总
含量 ( 2 180 . 8 3m g l/ Oo g D . w t ) 比对照 ( 3 38 7 . 2 7哩 /
天冬氨酸 ( sA p )
丝氨酸 ( eS r )
谷氨酸 ( lG u)
脯氨酸 ( P r c〕)
甘氨酸 ( lG y )
丙氨酸 (川 a )
半胧氨酸 ( C ys )
撷氨酸 ( V o l )
甲硫氨酸 ( M e t )
异亮氨酸 ( I le )
亮氨酸 ( eL u)
酪氨酸 ( T yr )
苯丙氨酸 ( P h e )
赖氨酸 ( L ys )
组氨酸 (曰 s )
精氨酸 (儿 g )
总量
25
.
0 1
27
.
1 1
9
.
80
1 1
.
54
4
.
5 5
12
.
7 7
28
.
6 8
1 9 1
,
6 9
4 4 1
.
45
1 87 5
.
4 9
18 1
.
0 2 2 1 1
.
70 2 58
.
4 8
17 1
.
8 6 1 16
.
55 175
.
62
3 14
.
6 5 4 0 7
.
15 4 3 3
.
57
75 1
.
9 0 4 12
.
8 1 72 1
.
79
14
.
8 7 15
.
11 11
.
96
30 5
.
7 3 6 8
.
6 0 130
.
0 1
0 18
.
7 5 0
54
.
5 7 110
.
6 2 9 1
.
3 0
37
.
0 8 29
.
8 2 63
.
19
2 6
.
9 3 32
.
8 0 9 5
.
8 3
2 1
.
3 4 2 7
.
8 8 2 4
.
4 8
19
.
0 6 3 0
.
46 19
.
80
16
.
27 3 3
.
77 2 1
.
49
30 7
.
82 4 1
.
45 58
.
26
22 6
.
20 136
.
79 127
.
99
12 28
.
15 4 86
.
5 8 1153
.
5 0
37 17
.
4 5 2 180
.
8 3 3 387
.
2 7
在植物体中 ,包括甲硫氨酸 、赖氨酸 、苏氨酸 、 异
亮氨酸在内的所有天冬族氨基 酸 , 都是由天冬氨酸
通过共同的分支途径合成的 , 该途径主要受最终产
物的反馈调节 〔` 3 , `5」。 在过量积累甲硫氨酸的拟南
芥中 , 由于苏氨酸合成酶基因的改变而导致磷酸高
丝氨酸 ( O P H )较多用于 甲硫氨酸 的合成 , 使游离甲
硫氨酸含量是对照的 2 倍 ,苏氨酸的含量减少 [’ “ 〕。
在本实验中通过对抗性细胞系及再生植株游离氨基
酸的分析表明 ,在草木棵状黄蔑抗甲硫氨酸变异系
中 ,所有天冬族氨基酸含量都有所增加 ,这可能是天
冬氨酸激酶 ( A K )活性的升高或对反馈抑制不敏感 ,
使较多的天冬氨酸进人合成途径用于赖氨酸 、 甲硫
12 2 陈 刚 贾敬芬 郝建国 36 卷
氨酸和异亮氨酸等的合成 , 导致抗性系中游离甲硫
氨酸的过量积累。
2
.
7 抗性系可溶性蛋白 SDS 一 1】A G E 和过氧化物
酶同功酶酶谱分析
从 5 1〕-S P A G E 电泳图谱 (图 4) 上可 以看出 , 抗
性系与对照可溶性蛋白有明显的差别 。 抗性系产生
了对照所没有的 2 条多肤 , 即 P l 、几 。
从过氧化物酶同工酶图谱 (图 5) 可以看出抗性
系与对照相比出现了 2 条新带 (E ; 和 几 ) 。 这些谱
带的变化说明变异细胞系的基因或其表达调控发生
了某些变化 , 并产生 了变化的基因产物 。 草木挥状
黄茂抗甲硫氨酸变异 系再生植株已经开花结实 , 同
时抗性系的同工酶与对照表现出一定的差异 ,再生
植株次级愈伤组织对甲硫氨酸表现出稳定的抗性 。
参 考 文 献
【l] 赵忠 、贾敬芬 , 19% ,红豆草抗 甲硫氨酸变异体的筛选 。
植物学报 , 38 (4 ) : 2 6 8 一 2 75 。
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反泛, 3 : 28 2 一 2 86 .
【3 〕刘博林 、 荆玉祥 、 匡廷云 , 19 93 , 高赖氨酸植物种的筛
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