全 文 ：收稿日期:2008-08-12
作者简介:姜艳华(1982-),女(满族), 辽宁葫芦岛人 , 在读硕士研究生 ,研究方向:微生物学。
通讯作者:樊晓晖(1963-),男(壮族), 广西忻城人 , 教授 ,博士生导师 , 主要从事微生物学与免疫学研究。
紫藤活性成分的提取与抑菌作用初探
姜艳华1 ,樊晓晖1＊ ,姜　华2
(1.广西医科大学 微生物学与免疫学教研室 ,广西 南宁 530021;
2.辽宁师范大学 生命科学学院 ,辽宁 大连 116029)
摘要:为了测定紫藤活性成分对香瓜枯萎病菌和白菜软腐病菌的抑制作用 ,以不同浓度(0.1g/mL ,
0.05 g/mL ,0.02 g/mL ,0.01 g/mL ,0.005 g/mL)的紫藤叶片丙酮溶剂提取物为原料 ,采用牛津杯
法 、平板菌丝生长速率法 、菌丝干重法等测定香瓜枯萎病菌和白菜软腐病菌最低抑菌浓度 ,以及香
瓜枯萎病菌菌丝生长速率 、孢子生长 、菌丝干重等几项指标 。结果表明 ,提取物浓度为 0.1 g/mL
时 ,菌丝生长最为缓慢 ,孢子萌发率最低 ,菌丝干重最小;提取物浓度为 0.005 g/mL 时 ,抑菌作用
最小 ,为试验的最低抑菌浓度 。
关键词:紫藤;活性成分;抑菌作用
中图分类号:S482.2+92　　文献标识码:A 　　文章编号:1004-3268(2009)03-0060-04
Ex traction of Wisteria sinensis Active Constituent and
Its Inhibitory Effect on Fungi and Bacteria
JIANG Yan-hua1 ,FAN Xiao-hui1＊ , JIANG Hua2
(1.Depa rtment of M ic robio log y and Immunology , Guangxi Medical Univ ersity , Nanning 530021 , China;
2.Co llege o f Life Sciences , Liaoning No rmal Univer sity , Dalian 530021 , China)
Abstract:The act ive constituent w as ex t ract wi th acetone f rom the leaves of Wisteria sinensis and
i ts ef fect on the w ithers germ o f the muskmelon and the sof t ro t o f cabbage fungus w as detected.
After 72 hours of ex t ractions ,dif fe rent densi ty (0.1g/mL , 0.05g/mL ,0.02g/mL , 0.01g/mL and
0.005g/mL)was tested for Fusarium oxy sporum f.sp.cubense and Erwinia carotorora and
measured w ith the methods of ox ford cup , flat g row th o f mycelia and dry w eight of the mycelia.
The results show ed that w hen di luted 10 times (0.1g/mL), the g row th of the mycelia is slow ly
and the spo re germination rate is lowe st , dry w eight of the mycelia is minimally.However ,
0.005g/mL is the M IC in the concentrations of our experiments.TheWisteria sinensis leaves ace-
to ne ex t ract has certain inhibi to ry action to the fungus and bacterium g row th ,which has takes the
new ag ricultural chemicals research and the development po tential.It is hopefully to develop one
kind of new plant source biology ag ricultural chemicals.
Key words:Wisteria sinensis;Active const ituent;Bacterio static act ivity
　　香瓜枯萎病是瓜类的主要病害之一 ,在全国各
地都有发生。枯萎病菌主要以菌丝体和厚壁孢子在
病残体和土壤中越冬 ,病菌在土壤中有顽强的生命
力 ,可存活 6 ～ 7 年 ,是一种危害严重的真菌性病
害[ 1] 。白菜软腐病是一种细菌性病害 ,从白菜莲座
期至包心期发生。该病病原菌随病株残余遗留在土
·60·
2009年第 3期
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2009.03.008
壤中越冬 ,第 2年靠雨水及昆虫传播 ,由伤口侵入发
病。此病不仅在田间危害严重 ,贮运及销售过程中
也可造成腐烂 ,危害极大 。除危害十字花科蔬菜外 ,
还可侵染番茄 、辣椒 、洋葱 、胡萝卜和马铃薯等多种
蔬菜[ 2] 。
对以上 2 种病害 ,传统的化学防治方法易引起
病菌变异和环境污染严重等问题。因此 ,亟待研发
出新一代有效的防治药物 。作为生物农药的重要组
成部分———植物源抑菌剂越来越受到人们的关注 ,
是当前新型农药的研发热点[ 3 , 4] 。紫藤是豆科的一
种攀缘木质藤本植物 ,主要分布在辽宁省的大连 、丹
东 、沈阳 ,曾是我国民间使用的土农药 ,种子或叶片
研制成粉末后泡水喷洒 ,能防治多种害虫。但是有
关紫藤抑菌活性的研究尚未见报道。鉴此 ,以紫藤
叶片丙酮提取物为对象 ,采用不同稀释浓度 ,比较其
对香瓜枯萎病菌和白菜软腐病菌的抑制活性 ,旨在
为开发和利用该资源提供理论依据 。
1　材料和方法
1.1　材料
紫藤叶片采摘于辽宁师范大学院内 ,洗净自然
阴干 ,粉碎机粉碎后经孔径约为 1.58mm 的筛网过
滤。香瓜枯萎病菌 、白菜软腐病菌由辽宁师范大学
生命科学学院微生物实验室分离获得。丙酮购于大
连宝生物工程有限公司。
1.2　紫藤活性成分提取
准确称取紫藤叶片干样 50 g ,置于 500mL 容量
瓶中 ,采用浸泡法[ 5]提取 ,加入 250mL 丙酮 , 30℃浸
泡 24 h ,抽滤 ,残渣用相同体积的丙酮按同样方法再
进行 2 次浸泡 、提取 、抽滤。合并 3次的提取液 ,旋
转蒸发器中减压浓缩至每毫升含有 1g 干粉 ,-20℃
冰箱保存 ,供试验用 。
1.3　紫藤提取液抑菌作用的测定
1.3.1　牛津杯法测定最低抑菌浓度[ 6] 　选择香瓜
枯萎病 、白菜软腐病病原菌进行抑菌试验。活化后
的香瓜枯萎病和白菜软腐病病原菌指示菌株各取一
接种环 , 用 1mL 无菌生理盐水稀释摇匀后 , 吸
0.1mL至培养基上 ,接种棒刮匀 ,安放牛津杯 ,牛津
杯直径为 8mm ,每皿 6个 ,等间隔排开 ,将制备好的
不同浓度(0.1 g/mL 、0.05 g/mL 、0.02 g/mL 、0.01
g/mL 、0.005 g/mL)紫藤提取物稀释液加入其中 ,加
入量为 0.2mL/杯 , 以灭菌蒸馏水作为阴性对照 。
28℃培养 24 h ,量取抑菌圈直径。
1.3.2　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌菌丝生长
速度的影响　采用菌丝生长速率法[ 7] 。称取一定量
的紫藤提取物 ,用定量的灭菌蒸馏水稀释成一系列
浓度梯度(稀释浓度分别为 0.1 g/mL 、0.05 g/mL 、
0.02 g/mL 、0.01 g/mL 、0.005 g/mL),各取 1mL 分
别放入直径 9 cm 的培养皿内 ,与 9mL 溶化好的
PDA培养基混合均匀制成平板 ,接入培养好的直径
5mm 香瓜枯萎病菌菌块 ,置于 28℃条件下恒温培
养 72 h后测定菌落半径的增加值 ,以不加紫藤提取
物的灭菌蒸馏水为阴性对照组 ,计算紫藤提取液对
菌丝生长的抑制率 。采用十字交叉法测量菌落扩展
直径 ,取其平均值 ,求算抑制百分率 。另外 , 每隔
24 h观察测定菌落直径 ,直至培养 120 h 。
抑制率 =(
对照组菌落
扩展直径 -
紫藤提取物处理组
菌落扩展直径
对照组菌落扩展直径 )×100%
1.3.3　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌孢子产生
的影响　将 1.3.2中培养 72 h的菌落用 8mm 打孔
器于距菌落边缘 3 ～ 4mm 处打取菌块 ,放入试管
内 ,加入 1 ～ 2mL 蒸馏水 ,将菌块上的孢子全部洗
下 ,用血球计数板直接计数 ,每皿取菌 2块 ,每块菌
孢子计数 4次 ,取 8个观察数据作平均值 ,整个试验
重复 3次。
1.3.4　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌菌丝干重
的影响[ 8] 　在 PD 培养液中加入紫藤提取物 ,使紫
藤提取物最终浓度分别为 0.1 g/mL 、0.05 g/mL 、
0.02 g/mL 、0.01 g/mL 、0.005g/mL ,加入病原菌孢
子悬浮液 1mL(约 10个/mL), 28℃摇床培养 72 h ,
先将定性滤纸干燥后称重 ,然后洗涤培养好的含菌
丝 PD培养液 ,用纱布滤去培养液 ,用无菌蒸馏水冲
洗 3遍后 ,将菌丝调到干燥的滤纸上 ,在 100℃恒温
烘箱中烘干到恒重 ,并准确称重 ,每一处理重复 3
次 ,以不加紫藤提取物的灭菌蒸馏水作为对照组。
分析数据 ,计算抑制率 。
2　结果与分析
2.1　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌和白菜软腐
病菌的抑制作用
由图 1可知 ,紫藤丙酮提取液浓度为 0.1 g/mL
时 ,对香瓜枯萎病菌和白菜软腐病菌的抑菌效果最
好 ,抑菌圈直径分别为 50mm 和 46mm ;随着稀释
倍数的增加 ,抑菌能力逐渐减弱 ,抑菌圈逐渐减小 ,
在 0.02 g/mL 时 ,抑菌圈实际直径分别为 34mm 和
37mm ;在 0.005g/mL 时 ,抑菌圈实际直径分别为2
mm和 7mm ,效果不明显 ,为试验的最低抑菌浓度 。
·61·
河南农业科学
　　图 1　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌和白菜软
　　　　　腐病菌的抑制作用
2.2　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌菌丝生长速
度的影响
由图 2可知 ,紫藤丙酮提取液浓度为 0.1g/mL
时 , 对香瓜枯萎病菌菌丝生长的抑菌圈直径为
35mm ,抑制率为 60%。菌丝生长较慢 ,菌丝稀疏 ,
纤细 ,呈白色 ,随着稀释倍数的增加 ,菌丝生长逐渐
增快 ,但远远低于对照组。当稀释液浓度为 0.05 、
0.02 、0.01 、0.005g/mL 时 , 抑菌圈直径分别为
30mm 、26mm 、15mm 、7mm ,抑制率分别为 52%、
45%、26%、12%。这说明紫藤丙酮提取液对菌丝生
长具有一定的抑制作用 ,浓度为 0.1 g/mL 时效果
最佳 ,随着浓度的逐渐降低 , 抑制率逐渐减小 , 到
0.005g/mL时抗菌活性已经很弱 , 抑制率仅为
12%。
图 2　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌菌丝生长的影响
2.3　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌孢子产生的
影响
由图 3可知 ,紫藤丙酮提取液对孢子产生具有
一定的影响 。浓度为 0.1 g/mL 时 ,香瓜枯萎病菌
的菌块孢子数为 0.56 ×105 个/mL , 抑制率为
84.66%,孢子生长较为缓慢 ,抑制率随着提取液浓
度的降低而降低;浓度为 0.05 g/mL 时 ,菌块孢子
数为 0.83×105 个/mL ,抑制率为 77.26%;浓度为
0.01 g/mL时 ,菌块孢子数为 2.25×105 个/mL ,抑
制率为 38.36%;浓度为0.005 g/mL时 ,菌块孢子数
为 3.15×105 个/mL ,抑制率为 13.89%,依然对香
瓜枯萎病菌的生长具有一定的抑制作用 。由此可
见 ,紫藤丙酮提取液对孢子产生影响较大 。
图 3　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌孢子产生的影响
2.4　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌菌丝干重的
影响
试验结果(表 1)表明 ,紫藤丙酮提取液对香瓜
枯萎病菌菌丝干物质积累具有较强的抑制作用 ,抑
制率随着浓度的提高而增高。浓度为 0.1 g/mL
时 ,抑制率可达到 95%, 浓度为 0.05 g/mL 、0.02
g/mL 、0.01g/mL 、0.005 g/mL 时 , 抑制率分别为
81%、58%、48%、19%。表明紫藤丙酮提取液对香
瓜枯萎病菌菌丝干重具有较明显的抑制作用。
表 1　紫藤丙酮提取液对香瓜枯萎病菌菌丝干重的影响
浓度
(g/mL)
菌丝干重(g)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ 平均值
抑制率
(%)
0.100 0.0003 0.0020 0.0007 0.0010 95
0.050 0.0060 0.0010 0.0050 0.0040 81
0.020 0.0130 0.0080 0.0070 0.0090 58
0.010 0.0090 0.0170 0.0080 0.0110 48
0.005 0.0190 0.0120 0.0220 0.0170 19
CK 0.0230 0.0250 0.0160 0.0210 -
3　结论与讨论
本研究结果表明 ,紫藤叶片丙酮提取液对真菌
和细菌的生长均有一定的抑制作用 , 浓度为 0.1
g/mL时 ,对香瓜枯萎病菌和白菜软腐病菌的抑制效
果最好 ,在本试验浓度范围内对 2种病菌的最低抑
菌浓度均为 0.005g/mL。同时 ,比较详细地研究了
紫藤丙酮提取液对真菌香瓜枯萎病菌的抑制作用 ,
结果表明 ,紫藤丙酮提取液浓度为 0.1 g/mL 时 ,对香
瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制率为 60%,菌丝生长较
慢 ,菌丝稀疏 ,纤细 ,呈白色 ,随着稀释倍数的增加 ,菌
丝生长逐渐增快 ,但远远低于对照组;紫藤丙酮提取
液对孢子产生也具有一定的影响 , (下转第 78页)
·62·
2009年第 3期
粉末状物质。盆栽试验显示 ,该物质对蚜虫的防治
效果在 87.6%～ 98.3%,其他非黄色粉末状物质馏
分无活性 。
2.4　T LC 分析
T LC检测结果表明 ,发酵物丙酮浸泡原液成分
相对较简单 ,原点以上除了在 Rf =3/5左右有明显
的 2个黄点外 ,其他物质很少;而乙酸乙酯萃取相较
复杂 ,从原点开始一直到 Rf =4/5以上都有大量物
质存在 ,这些物质在 TLC 板上虽然也有明显的点 ,
但总体上成一条连续的带状;各分离纯化粗馏分和
乙酸乙酯萃取相情况相似 。
对制备型硅胶板快速分离所得样品在不同时间
的 T LC检测结果表明 ,将其中明显的点(或条带)刮
下 ,以丙酮浸泡 ,如果马上用浸泡液进行 TLC检测 ,
发现在硅胶板上是一个明显的点 ,但如果将浸泡液
过滤后蒸干并放置 12 h 以上 ,然后再进行 TLC 检
测 ,结果在 TLC板上又成了一连串的带状分布。这
些现象说明 ,该菌株产生的活性成分是一类不稳定
的物质 ,即使在室温条件下也会很快发生变化 。
根据以上结果可以判断 ,代谢产物中主要含有
2种活性成分(即在 Rf =3/5左右有明显的 2 个黄
色点的物质),其他活性成分可能都是由这 2个成分
衍生而来的 ,这也说明在丙酮浸泡原液中 ,可能有稳
定活性物质的因素存在 ,这种因素可能是一种水溶
性的成分 ,但需要进一步研究。
3　讨论
对链霉菌 JXJ-45固体发酵物的初步研究表明 ,
该菌产生的代谢产物对蚜虫具有较好的防治效果。
但是这些活性成分不稳定 ,极易发生变化 ,这给活性
成分的分离纯化和结构解析工作带来了极大困难。
由于这类活性物质发生变化后其活性变化不大 ,这
对目前农药的耐药性问题可能是一个很好的解决方
法 ,其分离纯化等有待于进一步研究 ,以寻找一类不
产生耐药性的新型微生物农药。
参考文献:
[ 1] 　陈生斗 ,胡伯海.中国植物保护五十年[ M] .北京:科学
出版社 , 2003:18-37 , 278-364.
[ 2] 　张广学 , 钟铁森.同翅目:蚜虫类(一)[ A] ∥中国经济
昆虫志 ,北京:科学出版社 , 1983.
[ 3] 　曹雅忠 ,尹姣 , 李克斌 ,等.小麦蚜虫不断猖獗原因及控
制对策的探讨[ J] .植物保护 , 2006 , 32(5):72-75.
[ 4] 　武宇鹏 , 李友莲.蚜虫防治技术与研究应用新进展[ J] .
山西农业科学 , 2003 , 31(2):64-68.
(上接第 62页)　0.1g/mL 稀释液对香瓜枯萎病菌
的抑制率为 84.66%,孢子生长较为缓慢 ,抑制率随
着浓度的降低而降低;另外 ,紫藤丙酮提取液对香瓜
枯萎病菌菌丝干物质积累具有较强的抑制作用 ,抑
制率随着浓度的提高而增高 , 0.1g/mL 时可达到
95%。由此可知 ,紫藤具有作为新型农药研发的潜
力 ,有望研发出一种新的植物源生物农药。
参考文献:
[ 1] 　尚海庆 , 于海燕.香瓜枯萎病药剂防效试验[ J] .植物
保护 , 2006(3):144-145.
[ 2] 　臧威 , 崔崇士 , 孙剑秋 , 等.大白菜软腐病的研究现状
[ J] .北方园艺 , 2005(3):59-60.
[ 3] 　张兴悦 , 徐大明 , 姜长阳 , 等.植物源农药的研发进展
[ J] .辽宁农业科学 , 2006(2):53-56.
[ 4] 　Pa tel D N , Pa te l B N.Evalution of plant e xtr acts and
Trichoderma harz ianum rifai against[ J] .Phy tophtho-
r apa rasitica Research , 1999 , 25(1):4-8.
[ 5] 　中国科学院上海药物研究所.中草药有效成分提取与
分离[ M] .上海:上海科学技术出版社 , 1983.
[ 6] 　冯俊涛 , 石勇强 , 张兴.56 种植物抑菌活性筛选试验
[ J] .西北农林科技大学学报:自然科学版 , 2001 , 29
(2):65-68.
[ 7] 　操海群 , 岳永德 , 彭镇华 , 等.竹提取物的抗真菌作用
[ J] .植物保护学报 , 2003 , 30(1):35-39.
[ 8] 　Lewi M A.I nbibtion o f respira tion at site by asimicin ,
and insecticidal aceto gemin o fpaw paw , asimina triloba
[ J] .Pestic Biochem and Phisic , 1993 , 45:15-23.
[ 9] 　张锦.木本植物源农药的开发应用[ J] .中国野生植物
资源 , 2003 , 22(3):23-25.
[ 10] 　陈万义 , 王明安.对我国植物源农药中几个问题的思
考[ J] .农药 , 2002 , 41(2):45.
·78·
2009年第 3期