全 文 ：猫眼草水煎液体外致突变性的研究
金建玲 ,张　辉 ,刘　波 ,蔡玉品 ,高培基
(山东大学生命科学学院 微生物技术国家重点实验室 ,山东 济南　250100)
收稿日期:2009-09-07,修回日期:2009-10-20
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No39430020)
作者简介:金建玲(1965-),女 , 博士 ,副教授 ,研究方向:细菌抗药
性及中西医联合用药 ,通讯作者 , Tel:0531-88369495, Fax:
0531-88565610, E-mail:jinjianling@sdu.edu.cn
中国图书分类号:R-332;R282.710.5;R394.2;R916.4
文献标识码:A 文章编号:1001-1978(2010)02-0263-04
摘要:目的　检验猫眼草水煎液的致突变性;改进经典的 A-
mes试验体系使之适应于中药体外致突变性检验。 方法　
通过经典的 Ames试验检测猫眼草的体外致突变性;通过哺
乳动物骨髓细胞染色体畸变试验检测猫眼草的致畸作用;改
进的 Ames试验通过增设含补充组氨酸(含量对应于猫眼草
水煎液中组氨酸浓度)的阴性对照 , 排除样品中组氨酸成分
对试验结果的影响 。结果　猫眼草水煎液在经典的 Ames
试验中为强阳性;对哺乳动物骨髓细胞染色体致畸作用为阴
性;在改进的 Ames试验中猫眼草水煎液的致突变性为阴
性。结论　经典的 Ames试验不适合猫眼草水煎液致突变
性检测 , 改进后的 Ames实验体系适合 。猫眼草水煎液在体
外和体内均没有致突变性。
关键词:猫眼草;Ames试验;致突变性;染色体畸变;遗传毒
性;国家标准
　　猫眼草(EnphorbialunulataBge, EL)是大蓟科
多年生草本植物 。其化学成分主要含有黄酮类成
分 、猫眼草素 、山柰酚 、槲皮素等 [ 1, 2] ,临床上一般作
为镇咳平喘药使用 [ 3] 。此外 ,猫眼草还因具有抑
菌 、诱导细胞凋亡和细胞毒活性等生物功能而将得
到更广泛的应用 [ 4] 。可是对猫眼草的遗传毒性尚
未见报道。本文利用 Ames实验和哺乳动物(小鼠)
骨髓细胞染色体畸变实验 ,分别检测了猫眼草体外
和体内的致突变作用 ,以期更好的为开发利用猫眼
草提供基础理论依据 。同时 ,针对经典的 Ames试
验在检测猫眼草水煎液出现的假阳性结果 ,提出了
针对 Ames试验的改进方法 。
1　材料与方法
1.1　材料　叠氮化钠 (NaN3)、2-氨基芴(2-Amin-
ofluorene, 2-AF)、组氨酸 (L-histidine-HCl)、生物素
(D-biotin)购于 Sigma公司 (St.Louis, MO, USA),其
它试剂为分析纯。
1.2　猫眼草及其水提物的制备　中药购于济南市
建联中药店。传统煎煮法:猫眼草 1 000 g加去离子
水浸泡 0.5h后进行煎煮 ,煮沸 0.5 h, 4层滤布滤出
药液 ,再次加水煮沸 0.5 h,过滤 。两次药液合到一
起 , 55℃旋转蒸发浓缩至 500 ml,制成每毫升含生药
2 g的猫眼草水煎液原液 (2 kg· L-1)。 110℃ 30
min高压灭菌 ,冰箱冷冻保存 。
1.3　实验菌株和实验动物　鼠伤寒沙门菌 Salmo-
nelatyphimuriumTA100和 TA98系山东省疾病预防
控制中心毒理研究所惠赠。实验动物由中国医学科
学院实验动物研究所提供 [生产许可证号:SCXK-
(京)2004-0001] , SPF级昆明小鼠 ,体重 25 ～ 30 g,
♂♀各半 ,每组 10只 。饲养环境为屏障环境 ,实验
动物使用许可证号:SYXK(鲁)20030006。实验动
物饲料由山东省实验动物中心提供 , 许可证号:
SCXK-(鲁)2004-0014。
1.4　培养基
1.4.1　丰富培养基(LB)[ 6] 。
1.4.2　基本培养基(minimummedium, MM)(L)　
柠檬酸三钠(C6H5Na3O7 · 2H2O)5 g,磷酸氢二钾
(K2HPO4)7 g,磷酸二氢钾(KH2PO4)3 g,硫酸铵
(NH4)2SO4 1g,硫酸镁(MgSO4· 7H2O)0.1g,葡萄
糖 2 g。再加入所需生物素至终浓度 1 mmol· L-1 ,
110℃ 30 min高压灭菌 。固体配方同液体 ,另加入
15 gSigma纯化琼脂粉 。
1.4.3　组氨酸限量的选择培养基　在基本培养基
基础上添加组氨酸 5 μmol·L-1。
1.4.4　改进的阴性对照用培养基　在基本培养基
基础上添加组氨酸 。组氨酸的添加量依据猫眼草药
液中组氨酸含量和药液浓度而定 。
1.5　供试菌液制备　制备一批 TA100休止细胞的
冻存管 ,每次试验接种一管于 20 mlLB液体三角瓶
中 , 37℃摇床(150r· min-1)培养 4 ～ 6 h,至培养液
浑浊。离心 ,生理盐水洗涤 ,再用等量生理盐水重
悬 ,调整菌液的浓度约为每毫升含 1.0×109 ～ 1.1×
263中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBuletin　2010 Feb;26(2):263 ～ 6
10
9细胞 ,备用。
1.6　中药检测平板的制备　用选择培养基二倍梯
度稀释猫眼草水煎液 ,制备成含不同浓度中药的检
测平板 ,各平板 (20 ml)最终猫眼草含量为 500、
250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、1.95 g· L-1。
1.7　猫眼草药液中组氨酸含量测定 [ 5] 　按照国标
GB/T5009.124-2003进行 ,由国家认证实验室 -农
业部食品质量监督检验测试中心(济南)完成。
1.8　Ames试验　标准的 Ames试验检测猫眼草的
致突变性[ 6] 。取 0.1ml准备好的供试菌液 ,按照标
准 Ames实验的操作方法进行检测。
　　改进的 Ames试验检测猫眼草的致突变性 。操
作同上 ,只是增加 2组阴性对照实验。第 1组的阴
性对照平板中含组氨酸的量对应于猫眼草药液中游
离组氨酸的含量;第 2组对应于猫眼草药液中全部
组氨酸的含量。
1.9　哺乳动物骨髓细胞染色体畸变实验[ 7] 　根据
国标 GB15193.6-2003进行 ,由国家认证实验室———
山东省疾病预防控制中心毒理研究所完成 。
1.10　数据处理 　使用 MicrosoftExcel、Prism4和
SPSS软件进行统计分析 ,以 χ2检验进行组间比较 。
2　结果
2.1　经典的 Ames试验检验猫眼草的体外致突变
性　以 TA100和 TA98为实验菌株 ,采用经典的 A-
mes试验 -平板参入法 ,检测猫眼草水煎液的致突
变性 ,结果见 Fig1。 Fig1结果显示:当浓度≥500 g
· L-1时 ,猫眼草水煎液对 TA100和 TA98均表现强
烈的抑菌效果 ,没有 His+组氨酸回复子出现 。对于
TA100菌株 ,在 250、125、62.5、31.2 g· L-1时 ,猫眼
草水煎液为阳性结果 ,其余浓度为阴性结果 。对于
TA98菌株 , 在 125、62.5、 31.2、 15.6、 7.9、 3.9 g·
L-1时 ,为阳性结果 ,其余为阴性结果 。
2.2　猫眼草水煎液对哺乳动物(小鼠)骨髓细胞染
色体的致畸作用　利用哺乳动物(小鼠)骨髓细胞
染色体畸变实验 ,检测猫眼草在活体内对染色体的
致突变作用 。所用的猫眼草浓度 ,根据中药水煎液
的流动性 ,在几乎达到最大耐受剂量时 ,猫眼草水煎
液与阴性对照差异无显着性 ,表明该样品在实验条
件下对小鼠脊髓染色体无致畸作用 ,结果见 Tab1。
2.3　改进的 Ames实验体系检验猫眼草水煎液的
致突变性
2.3.1　猫眼草水煎液中组氨酸含量　因为 Ames
试验是利用鼠伤寒沙门菌(Salmonelatyphymurium)
Fig1　ThemutagenicityofEnphorbialunulata
decoctioninStandardAmestest
　　A:Negative;B:Positive.PositivecontrolofTA100was0.5 mg·
L-1 NaN3 , ofTA98was0.5mg· L-1 2-AF
Tab1　TeratogenicityofEnphorbialunulatadecoctionin
mammalianbonemarrowchromosomalaberrationtest(n=10)
Micegroup
Numberof
total
cels
Numberof
teratogenic
cels
Teratogenisis
/%
Negativecontrol 10×100 18 1.8±0.79
Positivecontrol 10×100 306 30.6±5.66＊＊
EL2.5 g· kg-1bw 10×100 22 2.2±0.92
　 5.0 g· kg-1bw 10×100 20 2.0±0.82
　 10.0g· kg-1 bw 10×100 19 1.9±1.20
　　＊＊P<0.01vsnegativecontrol(SPSS13.0)
的组氨酸(histidine)营养缺陷型突变株(his-)发生
回复突变的性质 ,对待测物质致突变性进行初步筛
选的短期体外实验方法[ 8] ,所以猫眼草水煎液中所
含的组氨酸成分 ,可能是影响 Ames试验结果并造
成假阳性的主要原因 ,因此要排除样品中组氨酸的
影响 ,首先需要了解猫眼草药液中组氨酸浓度。猫
眼草水煎液原液中组氨酸含量:氨基酸型组氮酸含
264 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　2010 Feb;26(2)
Tab2　ThemutagenicityofEnphorbialunulatadecoctionbythemodifiedAmestest(TA100)
ConcentrationofEL/g· L-1 Histidine/mg· L
-1
Aminoacid total
NumberofHis+
C c B
Ratio
B/C B/c B/A
125 2.00 9.40 391 769 441 1.13 0.57 3.13
62.5 1.00 4.70 313 592 502 1.60 0.85 3.56
62.5 1.00 4.70 313 592 502 1.60 0.85 3.56
31.25 0.50 2.35 277 419 460 1.66 1.10 3.26
15.63 0.25 1.18 259 327 401 1.55 1.23 2.84
7.81 0.13 0.59 250 283 223 0.89 0.79 1.58
3.91 0.06 0.29 246 262 209 0.85 0.80 1.48
Negative 141(A)
Positive 739
　　Positivecontrolwas0.5mg· L-1 NaN3.A:Thenumberofhis+revertantsofnegativecontrol.B:Thenumberofhis+revertantsofELexperimental
groups.C:Thenumberofhis+revertantsofnegativecontrolmodifiedbytheaminoacidtypehistidineinEL.c:Thenumberofhis+revertantsofnegative
controlmodifiedbytotalhistidineinEL
Tab3　ThemutagenicityofEnphorbialunulatadecoctionbythemodifiedAmestest(TA98)
Concentrationof
EL/g· L-1
Histidine/mg· L-1
Aminoacid total
NumberofHis+
C c B
Ratio
B/C B/c B/A
125 2.00 9.40 62 105 18 0.29 0.17 1.28
62.5 1.00 4.70 73 95 56 0.77 0.59 4.00
31.25 0.50 2.35 43 62 56 1.30 0.90 4.00
15.63 0.25 1.18 36 49 59 1.64 1.20 4.21
7.81 0.13 0.59 29 46 54 1.86 1.17 3.96
3.91 0.06 0.29 25 36 42 1.68 1.17 3.00
1.96 0.03 0.15 19 27 27 1.42 1.00 1.93
Negative 14(A)
Positive 42
　　Positivecontrolwas0.5mg· L-1 2-AF.ThemeansofA, B, CandcweresameasinTab2
量为 32 μg· g-1 ,总组氨酸为 150.4 μg·g-1。
2.3.2　改进后的 Ames试验检测猫眼草水煎液的
致突变性　利用改进的 Ames试验体系 ,重新测定
猫眼草水煎液的致突变性。结果见 Tab2、3。结果
显示:猫眼草水煎液在排除药液中所含氨基酸型组
氨酸的影响作用后 , Ames试验结果就转变为阴性 。
3　讨论
3.1　猫眼草水煎液的体外致突变性　试验结果显
示:猫眼草水煎液在经典 Ames试验中表现阳性结
果(Fig1),排除药液中组氨酸的影响后 ,在改进的
Ames试验中表现阴性结果(Tab2, 3)。表明猫眼草
水煎液在体外致突变性检验中呈阴性 , 经典 Ames
试验中猫眼草水煎液表现的阳性结果 ,是因为药液
中所含有的组氨酸成分所致的假阳性 。
3.2　猫眼草水煎液的致染色体畸变作用　哺乳动
物(小鼠)骨髓细胞染色体畸变试验中的阴性结果
显示:猫眼草水煎液在活体内没有致染色体畸变作
用 。
3.3　经典 Ames试验需进行修正后才能适合中药
水煎液的体外致突变性检验　Ames试验是国际上
通用的遗传毒理学的必检项目之一。 Ames试验最
重要的影响因素是检测体系中的组氨酸及其前提物
(如多肽 、蛋白质等)的含量[ 9 ～ 12] 。因为它们可以支
持 his-缺陷型细胞生长和分裂 ,增加最终回复子菌
落数;从而造成假阳性 。因此 ,标准的 Ames试验体
系不适合含组氨酸成分样品的致突变性检验 。如食
品 、某些化妆品 、中药水提物等。因此 ,必须进行改
进后才能适用 [ 10 ～ 17] 。
　　本文改进后的 Ames试验 ,因为排除了猫眼草
水煎液中的组氨酸成分的影响作用后表现阴性结
果 ,与哺乳动物(小鼠)骨髓细胞染色体畸变试验的
阴性结果相吻合 ,也与猫眼草在长期临床实践中所
显示的安全性相吻合。表明本文提出的改进方法 ,
能有效的排除样品中组氨酸的影响而导致的假阳
性 ,是一种可行的适合中药样品体外致突变性检测
的实验体系 ,值得推广使用。
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MutagenicityofEnphorbialunulatadecoctioninvitro
JINJian-ling, ZHANGHui, LIUBo, CAIYu-pin, GAOPei-ji
(StateKeyLaboratoryofMicrobialTechnology, SchoolofLifeSciences, ShandongUniversity, ShandongJinan　250100, China)
Abstract:Aim　ToassaythemutagenicityofEnphor-
bialunulata(EL)decoctionandtomodifytheAmes
testforevaluationthemutagenicityofherbalmedicine
samples.Method　ThemutagenicityofELdecoction
wasassayedbystandardAmestest;theteratogenicity
wasdonebymammalianbonemarowchromosomalab-
erationtest.InmodifiedAmestestsystem, theinflu-
enceofhistidineELdecoctionwasexcludedbyaddi-
tionalnegativecontrol, inwhichthetestmediawas
suppliedwithhistidine(histidineamountequaledto
thehistidineindiferentconcentrationofELdecoc-
tion).Result　ThemutagenicityofELdecoctionwas
positiveinthestandardAmestest.Theteratogenicity
ofELdecoctionwasnegativeinmammalianbonemar-
rowchromosomalaberationtest.BythemodifiedA-
mestests, themutagenicityofELdecoctionwasnega-
tive.Conclusion　ThestandardAmestestisnotsuit-
ableforevaluatingthemutagenicityofELdecoction,
butthemodifiedAmestestis.Themutagenicityin
vitroandtheteratogenicityinvivoofELdecoctionare
alnegative.
Keywords:Enphorbialunulata;Amestest;mutagenic-
ity;teratogenicity;genetictoxicity, nationalstandard
266 中国药理学通报　ChinesePharmacologicalBulletin　2010 Feb;26(2)