全 文 ：卫生毒理学杂志 19 9 4年第 8卷第 1 期
Am e s 试验检测不同工艺制作
灵香草浸膏的致突变性①
刘淑 英 孙毓柏 魏运莲 张文俊 张文郁
Am
e s 试验是美国环保局 ( EP A)确定的化学物
质远期安全评价组合试验中的首选方法 。 文献报道 ,
以细菌致突变试验方法检测化学物质的可靠性达
85 一 95 % 〔 ,一 3】。 因此 , 我国工药品管理法 、 食品卫生
法等法规中 , 同样将 A m e s 试验列为评价化学物质
安全性的首选方法 。
灵香草 ( L y s i m a e h i a fo e n u m 一 g r a e e u m H a n e e )
为被子植物门 ,双子叶植物纲经济作物 〔们 ,盛产于我
国西南部 , 全草可制成浸膏提炼香精 ,作为药材出 口
和酒 、 食品添加剂 。 灵香草浸膏是通过烘干 、 浸提工
艺处理后提炼的复杂混合物 ,其成分与工艺流程密
切相关 。 该项研究目的是通过 A m e s 试验指导改进
灵香草浸膏制备工艺 ,去除其中微量致突变化学成
分 ,保留香精成分 ,保证浸膏的产率 , 以取得最大的
经济和社会效益 。
材料与方法
一 、 材料
1
. 菌株 : 根据 A m e s 本人推荐〔的和我国有关新
规定 ,采用 鼠伤寒沙 门氏菌变异株 T A 97 、 T A 98 、
T A 10
、
T A 102 四种菌种 ,为增加检测范围 , 又增加
了 T ^ 1 5 35 、 T A 1 5 s 7 、 T A 1 5 38 共七株 。 菌株生物学
特性 h( 15 一 、 r af 、 u vr B 、 R 因子 )鉴定均符合规定要求 。
2
. 培养基 、 大鼠肝微粒体酶系统 (s 9) 应用本所
制订的 A m e s 试验常规方法制备 〔的 。
3
. 阳性对照物 : 将 已知致突变 /致癌阳性物与
相应菌株进行对照试验 ,结果符合要求 。 见表 1 。
表 1 已知阳性物对应表
活化系统 T A 9 7 T A 9 8 T A 1 0 0 T A 1 0 2 T A 15 3 5 T A 1 5 37 T A 15 3 8
一 5 9 疟涤平
十 5 9 2一 A A F
6
一
M P 为 6一琉基嚷吟
正定霉素 6一 M P 丝裂霉素 c
2
一 A A F Z
一 A A F Z
一 A A
2
一 A A F 为 2一乙酞氨基药 2一 A A 为 2一氨基葱
6
一
M P
环磷酞胺
疟涤平
咯蔡睫
.3 3 二氛联苯胺
2一 A A F
4
. 受试物 :广西植物所先后提供不同制作工艺
样品 , 以每毫升浸膏 (精油 )相当生药重量计算 。 其编
号是与其它试验样品排列的系列号 。 即 9 2 , 9 8 , 9 ,
1 08
,
1 09 号共五个样品 。
二 、方法
1
. 各号样品均以二 甲基亚矾 ( D M s o )稀释为
试验所需浓度进行点试验 ,根据点试结果进行混合
法的非活化与活化试验 。
2
. 五个样品试验分别进行 ,根据结果改进工
艺 ,直至致突变转为阴性 。 (具体方法略 )
表 2 92 号灵香草浸膏点试验结果
测试菌株 灵香草浸膏
( m g / m l)
8 2
。
3 2 8 2 3
。
2 8 2 3 2
自然回变
菌落数 阳性物对照
一 抑菌
一 抑菌
一 抑菌
一 抑菌
土 抑菌 (士 )
2 2 ~ 2 6 + + +
1 0 + + + 十
2 5~ 3 2 +
3 3 + +
1 1 0~ 1 3 8 +
5 , 7 , s , 9
,
o 分别代表 鼠伤寒沙 门氏 菌株 T A 1 5 3 5 ,
T A 15 3 7
, T A 1 5 3 8
, T A 9 8
, T A 1 00
。 下同 。
① 天津劳动卫生职业病研究所 ( 3 0 0 2 0 4)
·
43
·
结 果
一 、 29 号灵香草浸膏点试验 、混合试验结果
1
. 点试验结果见表 2 。
由表 2 可见 29 号灵香草浸膏在 8 2 32 mg / ml 时
对五株菌种均产生抑菌 。 T 1 A0 在抑菌圈外能见到
菌落密集 , 在 825 . Zm g /m l 时菌落密集明显 ,定为可
疑阳性 。
2
. 混合试验结果见表 3 。
表 3 92 号灵香草浸膏混合法试验结果
试验组别 5
7 8 95 0
一 5 9 + 5 9 一 5 9 + 5 9 一 5 9 + 5 9 一 5 9 + 5 9 一 5 9 + 5 9
8 2
.
3 2
一 4 1 16
( 。 1 9 / n ; l )
自然 回变
菌落数
阳性对照
菌落数
6
.
5~ 2 0
。
5 9
.
5~ 19
.
5 8 ~ 2 7 14
,
5 ~ 27 19 ~ 2 7 2 6
.
5 ~ 4 7 3 6
.
5 ~ 8 0
.
5 2 7
.
5 0 5 3
.
5 1 3 6
、
5 ~ 3 9 9
.
5 9 6
.
5 ~ 3 0 1
.
5
14 10
。
7 15
.
8 18
.
5 2 8 3 4
_
8 3 5
5 6 0
.
5 10 3 7
.
8 1 0 0 0 0 4 0 2 7 4 40
.
8 3 6 8 8
.
7 2 2 2 1
.
6 3 8 8 3
1 2 7 1 7 0
4 6 9 8 22
产 、
/ 、 、
/
写卜口日3012
诱变数菌落ǎ个益à由表
3 可 见 , 92 号灵香 草浸膏对 T A ] 5 35 、
T A z 5 3 7
、
T A 1 5 3 8三株菌种 , 加与不加 5 9 , 其诱变
菌落数均未超过自然回变菌落数的两倍 , 故判为阴
性结果 。 对 T A 98 菌株 , 在无 5 9 存在时 , 有两个剂
量组诱变菌落数超过了自然回变菌落数的一倍 , 但
其余剂量组的诱变菌落数均在正常范围内 , 而且无
剂量一反应线性关系 , 因而仍为阴性结果 。
9 2 号灵香草浸膏对 T A 10 的致突变作用 , 当
剂量为 82 . 32 m g /m1 时 , 其诱变菌落数尚接近正常
随 着剂 量 的增 加 , 诱变 菌落数 也增加 , 剂 量 为
1 6 4 6m g / m l 时 , 诱变菌落数超过了自然回变数的两
倍 , 但达到 4 1 1 6m g / m l 时即显示出抑菌作用 。 呈现
出良好的剂量 一反应线性关系 , 故判断 92 号灵香草
浸膏对 T A 10 的诱变结果为阳性 。 见附图 。
二 、 98 号灵香草浸膏混合试验结果见表 4 。
10 0 20 0 3 0 0 还丽
刑量 `。名撇 )
附图 : 灵香草浸膏对 T划 0 0 诱变剂量 一反应曲线
- - - - - - - - 一 5 9 — — 十 5 9
表 4 98 号灵香浸膏混合法试验结果
5 7 8 9 0试验组别
0
一 5 9 十 5 9 一 5 9 + 5 9 一 5 9 + 5 9 一 5 9 + 5 9 一 5 9 + 5 9
8 0
.
0 0
一
4 00 0
m g / m -
自然回变
菌落数
阳性对照
菌落数
6 ~ 13
.
5 6~ 2 3 4~ 1 9 15~ 2 1
.
5 12
.
5 ~ 1 4
.
5 1 7
.
5、 4 7 1 8 . 5~ 6 0 2 2~ 6 0 8 8 . 5 ~ 2匕7 8 2 . 5~ 1 8 3 . 5
9 ~ 11 12
.
5 ~ 2 1 10
.
5 ~ 4 5 8~ 8
.
5 1 3
.
5~ 3 4 16 ~ 20 2 3
.
5 ~ 6 ]
.
5 2 5~ 3 7 9 3
.
5 ~ 16 6 9 0
.
5 ~ 1 12
52 7
.
5一 19 14 9 84 5
一 18 62 1 00 00 I D0 00 6 24~ 72 6 16 50~ 39 6 0 5 4 0~ 8 58 26 12
.
5~ 8505 10」2~ 45了5 55 1~ 9 90
由表 4 可见 8 9号样 品对五株菌种的诱变结果
为阴性 。
三 、 9号精油混合试验结果见表 5 。
由表 5 可见 9 9号精油对 TA 10 的诱变结果为
阴性 。 在试验时见到各剂量组均出现乳化现象 , 由最
高剂量出现大块白色沉淀物 。
表 5 9 号精油混合法试验结果
试验组别 T A 1 0 0一 5 9 + 5 9
3 2 0
一
1 6 0 0 0 m g / m l
自然 回变菌落数
阳性对照菌落数
5 2~ 1 0 7
.
5
9 5
.
5~ 1 2 9
5 6 1~ 7 3 4
7 3
.
5 ~ 1 3 4
9 0
。
5 ~ 11 2
5 5 1 ~ 9 9 0
四 、 1 0 8 , 1 0 9 号样品选用 T A 9 7 , T A 9 8 , T A 1 0 o , T A l o Z新四株进行试验 ,结果见表 6 .
表 6 108 号 、 109 号灵香草浸膏混合法试验结果
T A 9 7 T A 9 8 T A 1 0 0 T A 1 0 2试验组别 一 5 9 十 5 9 一 5 9 + 5 9 一 5 9 十 5 9 一 5 9 + 5 9
灵香草浸膏 1 08 号
8
.
2 3
一
4 l l 6 m s / m l
12~ 1 5 6 46
.
5~ 1 19
.
5 1 4~ 5 3
.
5 2 3、 5 0 . 5 9 5~ 1 9 8 7 3~ 1 6 5 . 5 9 4 . 5 ~ 2 2 3 . 5 1 3 4 . 5~ 2 5 3
是臀操氰黔 ’ · 5一 “ 2 ’ 5 ` 5 . 5 ~ 1 69 . 5 2 2~ 5 8 . 5 28 . 5~ 52 5 3 . 5~ 1 1 3 . 5 1 1 6~ 1 7 1 . 5 9 5 ~ 2 1 6 1 6 1~ 2 1 6 . 5
自然回变菌落数
阳性对照菌落数
] 0 0~ 16 4 1 3 3~ 1 7 7
.
5 2 6~ 3 6
.
5 3 9
.
5~ 4 8
.
5 8 6 ~ 13 7
.
5 1 5 0~ 2 1 3
.
5 15 6 5 ~ 18 1
.
5 1 8 7
.
5~ 2 0 2
.
5
1 0 0 0 0 130 9~ 14 08 139
.
5~ 9 18
.
5 2381
.
5~ 3459
.
5 3 7 7 ~ 4 2 2
.
5 1 3 4 2~ 1 4 9 0
.
5 4 4 8 ~ 6 16 2 5 4 0
由表 6 可见 , 1 08 , 109 号样品对新四株菌种的
诱变菌落数 ,不论加与不加 5 9 均未超过 自然回变数
的两倍 ,故定为阴性结果 。
讨 论
9 2 号浸膏是由农 民利用传统火烤熏干所制膏
体 ,该加工方法往往在灵香草即将干燥时燃烧 ,并常
有烤焦变色情况 ,因此 ,损失很大 。据报道 ,灵香草经
溶剂提取 ,柱层析分离 ,并通过色质联用仪分析 ,含
多碳脂肪酸 、 醇类 、 蔗糖 、 百里香酚等成分的 ,其中有
些物质经氧化或焦化均可形成致突变物质 。 因此 ,应
考虑去除致突变原 。
9 2 号浸膏试用 50 % 乙醇脱色 ,脱色膏体为 98
号样品 。 98 号样品在没有 5 9 存在 , 80 Om g /m l剂量
时 ,对 T A 1 0 诱变菌落出现 20 7 个 /皿 ,但未超过 自
然回变一倍 。结果为阴性 ,该结果说明经过脱色可去
除致突变原 。 这种膏体色 、 香 、 味均好 ,基本无毒 ,可
作为食用香料 。
9 号样品经广西植物所利用色质联用仪分析 ,
其中氯代烷烃和氯代芳烃的相对含量达 48 . 7% 。 试
验中虽未见到诱变阳性 , 由于 出现严重乳化证实含
氯化合物的致突变性不宜应用 A m e s 试验进行检
测 , 因此 , 又进行了枯草杆菌重组实验 ,该实验结果
为阳性 。所以 ,我们同意提取醇浸膏时尽量除去这部
分含量 ,石油醚萃取的精油不能用于食品 、 烟 、 酒添
加剂 。
108 和 109 号样品试验结果是确定工艺的关
键 。 因此 ,我们采用了鼠伤寒沙门氏菌变异株新四株
菌种 。 改进灵香草干燥加工方法 ,其结果可以使用致
突变结果转为阴性 。严格控制干烤过程中的温 、湿度
是该工艺的关键 , 否则在食品中慎用 。
参 考 文 献
1
. 李雅观 ,张桥 . 广东微生物 1 9 7 7 ; 6 , 2 5~ 3 6 ·
2
.
B r i d g e s , B
.
A
.
N a t u r e 19 7 6 ; 2 6 1
: 1 9 5~ 2 0 0
.
3
.
K l o l t a , G
.
B
.
S e i e n e e 1 9 7 6
, 1 9 2 : 12 1 5
.
4
. 中国科学院植物研究所主编 . 中国高等植物科属 检索
表 . 19 7 9 ·
5
.
A m e s
,
B
.
N
.
M u t a t i o n R
e s 1 9 7 5 ; 3 1
:
3 4 1
.
6
. 张文郁 ,等 . 劳动卫生与环境医学 19 7 9 ; .5 6 ` 42 一 51 ·
7
. 刘国声 ,等 . 零陵香挥发油成分研究 . 中国植学会编 .
(修回时间 94 年 1 月 )